Bildning av amyloidfibriller med mikroplattsonikatorn UIP400MTP

Amyloidfibriller bildas, ungefär som kristaller, genom en process med kärnbildning och efterföljande tillväxt. På grund av den höga fria energibarriären för kärnbildning sker dock spontan bildning av amyloidfibriller först efter en lång lagfas. Ultraljudsbehandling har blivit ett kraftfullt verktyg för att inducera amyloidkärnbildning och därigenom avsevärt påskynda fibrillbildningen. I kombination med en mikroplattläsare som använder fluorescens från tioflavin T (ThT) möjliggör ultraljudsbehandling detektion av amyloidfibriller med hög provgenomströmning i flera prover samtidigt.

Ultraljudsinducerad bildning av amyloidfibriller med mikroplattsonikatorn UIP400MTP

Med sonikatorn UIP400MTP för flerbrunnsplattor kan stora mängder amyloidfibriller av samma kvalitet snabbt syntetiseras för forskningsändamål. Detta effektiva tillvägagångssätt gör det möjligt att studera proteiners amyloidogenicitet. Tekniken underlättar snabb och reproducerbar amyloidfibrillering, vilket har visats med β2-mikroglobulin (β2-m), ett amyloidogent protein som är förknippat med dialysrelaterad amyloidos.

Enkelt experimentellt tillvägagångssätt: ultraljudsinducerad amyloidfibrillering

För att inducera fibrillbildning placerades en mikroplatta med 96 brunnar i mitten av sonikatorn UIP400MTP för flerbrunnsplattor, vilket säkerställer en jämn ultraljudsexponering i alla brunnar. Försöksbetingelserna var följande:

1. Varje brunn innehöll 0,2 ml β2-mikroglobulinlösning (0,3 mg/ml, pH 2,5) med tillsats av 5 μM ThT.
2. Plattan utsattes för ultraljudsbehandlingscykler, exempelvis 1 minuts ultraljudsbehandling följt av 9 minuters paus.
3. Efter ultraljudsbehandlingen mättes ThT-fluorescensen med en mikroplattläsare.

(jfr So et al., 2011)

Jämförelse med konventionell omrörning

Jämfört med traditionella omrörningsmetoder minskade ultraljudsbehandling drastiskt fibrillbildningens lagfas. Vid konventionell skakning av mikroplattor uppvisade endast 1 av 10 brunnar ökad ThT-fluorescens efter 20 timmar. Vid cyklisk ultraljudsbehandling (15 minuters ultraljudsbehandling följt av 5 minuters vila) detekterades däremot en signifikant ökning av ThT-fluorescensen omedelbart efter den första ultraljudsbehandlingen.

Snabb acceleration av fibrilleringskinetiken

Resultaten från So et al. (2011) visade att den spontana fibrillbildningen hos β2-mikroglobulin vid pH 2,5 kan påskyndas från flera timmar till endast 10–15 minuter med ultraljudsbehandling.
Bilder från atomkraftsmikroskopi (AFM) bekräftade att fibriller som genererades genom 10 minuters ultraljudsbehandling var 15:e minut inte kunde skiljas morfologiskt från dem som bildades med 1 minuts ultraljudsbehandling var 10:e minut. Detta understryker reproducerbarheten och robustheten hos ultraljudsinducerad amyloidfibrillering.

AFM-bilder av amyloidfibriller som framställts genom 1 minuts ultraljudsbehandling var 10:e min (i), genom 10 minuters ultraljudsbehandling var 15:e min (ii) och genom reaktionen med tillsatta fibrillkärnor utan ultraljudsbehandling (iii). Det vita skalstrecket motsvarar 1 μm.
Studie och bilder: ©So et al., 2011

Fibrillering vid neutralt pH

Även vid neutralt pH uppnåddes fibrillbildning efter en lagtid på 1,5 timmar, vilket visar att ultraljudsbehandling avsevärt sänker energibarriären för kärnbildning och tillväxt. Detta ger ytterligare stöd åt hypotesen att amyloidfibrillering främst är en fysikalisk reaktion som till stor del begränsas av energibarriären för kärnbildning, vilken ultraljudsbehandling effektivt sänker.

Betydelse för forskning om amyloidrelaterade sjukdomar

Den enkla och tillförlitliga bildningen av amyloidfibriller med mikroplattsonikatorn UIP400MTP har stor betydelse för forskningen om Alzheimers sjukdom (AD) och andra amyloidrelaterade sjukdomar, såsom Parkinsons sjukdom, typ II-diabetes och systemiska amyloidoser. Vid AD är aggregering av amyloid-β (Aβ) ett centralt patologiskt kännetecken, men det är fortfarande svårt att studera dess fibrilleringskinetik på grund av långa lagfaser och variabilitet hos konventionella metoder. Ultraljudsdriven fibrillbildning påskyndar kärnbildningen och säkerställer hög reproducerbarhet och minskad variabilitet, vilket är avgörande för att screena potentiella hämmare och förstå amyloidogena mekanismer. Dessutom möjliggör UIP400MTP:s höga provgenomströmning storskaliga undersökningar av felveckning och aggregering av proteiner, vilket underlättar upptäckten av terapeutiska substanser som kan modulera fibrillbildning och potentiellt bromsa den neurodegenerativa utvecklingen.

Denna studie fastställer att ultraljudsbehandling med sonikatorn UIP400MTP för flerbrunnsplattor är en mycket effektiv metod för att påskynda bildningen av amyloidfibriller. De främsta fördelarna med detta tillvägagångssätt är:

• Kraftig minskning av lagtiden för fibrillering.
• Jämn ultraljudsexponering i alla brunnar, vilket möjliggör reproducerbar fibrillbildning.
• Möjlighet till screening med hög provgenomströmning, vilket gör metoden lämplig för genomomfattande sökningar efter proteiners amyloidogenicitet.

Genom att integrera ultraljudsbehandling med detektion av ThT-fluorescens ger denna metod en snabb, skalbar och tillförlitlig plattform för att studera amyloidfibrillering. Tack vare sin effektivitet och potential för hög provgenomströmning kan detta tillvägagångssätt underlätta enkel syntes av amyloidfibriller för biofysikalisk och farmaceutisk forskning och erbjuda ett lovande verktyg för amyloidrelaterade studier och läkemedelsscreening.