Bildning av amyloidfibriller med hjälp av den UIP400MTP mikroplattsonikern

Amyloidfibriller, ungefär som kristaller, bildas genom en process av kärnbildning och efterföljande tillväxt. På grund av den höga fria energibarriären för kärnbildning sker spontan bildning av amyloidfibriller endast efter en långvarig fördröjningsfas. Ultraljud har dykt upp som ett kraftfullt verktyg för att inducera amyloidkärnbildning, vilket avsevärt påskyndar fibrillbildningen. I kombination med en mikroplattläsare som använder tioflavin T (ThT) fluorescens, möjliggör ultraljud hög genomströmningsdetektion av amyloidfibriller i flera prover samtidigt.

Ultraljudsinducerad amyloid fibrillbildning med UIP400MTP Microplate Sonicator

Med den UIP400MTP multi-well plate sonicator, amyloid fibriller av samma kvalitet i stora mängder kan snabbt syntetiseras för forskningsändamål. Detta effektiva tillvägagångssätt gör det möjligt att studera proteiners amyloidogenicitet. Denna teknik underlättar snabb och reproducerbar amyloidflimmer, vilket demonstreras med β2-mikroglobulin (β2-m), ett amyloidogent protein som är associerat med dialysrelaterad amyloidos.

Enkel experimentell metod: Ultraljudsinducerat amyloidflimmer

För att inducera fibrillbildning placerades en 96-brunns mikroplatta i mitten av den UIP400MTP multi-well plate sonicator, vilket säkerställer enhetlig ultraljudsexponering över alla brunnar. De experimentella betingelserna var följande:

1. Varje brunn innehöll 0,2 ml β2-mikroglobulinlösning (0,3 mg/ml, pH 2,5) kompletterad med 5 μM ThT.
2. Plattan utsattes för ultraljudscykler, såsom 1 minuts ultraljud följt av 9 minuters paus.
3. Efter ultraljudsbehandling mättes ThT-fluorescens med hjälp av en mikroplattläsare.

(jfr So et al., 2011)

Jämförelse med konventionell omrörning

Jämfört med traditionella omrörningsmetoder minskade ultraljud drastiskt fördröjningsfasen av fibrillbildning. Under konventionella skakningsförhållanden på mikroplattor uppvisade endast 1 av 10 brunnar ökad ThT-fluorescens efter 20 timmar. Däremot, med hjälp av cyklad ultraljud (15 minuter ultraljudsbehandling följt av 5 minuters vila), upptäcktes en signifikant ThT-fluorescensökning omedelbart efter den första ultraljudsbehandlingen.

Snabb acceleration av flimmerkinetik

Resultaten från So et al. (2011) visade att den spontana fibrillbildningen av β2-mikroglobulin vid pH 2,5 kan accelereras från flera timmar till bara 10–15 minuter med ultraljud.
Atomkraftsmikroskopi (AFM) bilder bekräftade att fibriller som genereras via 10-minuters ultraljud var 15:e minut var morfologiskt omöjliga att skilja från de som bildades med 1-minuts ultraljud var 10:e minut. Detta belyser reproducerbarheten och robustheten hos ultraljudsinducerat amyloidflimmer.

AFM-bilder av amyloidfibriller som produceras av 1-min ultraljud var 10:e minut (i), av 10-min ultraljudsbehandling var 15:e minut (ii), och av såddreaktionen utan ultraljud (iii). Den vita skalan representerar 1 μm.
Studie och bilder: ©So et al., 2011

Flimmer vid neutrala pH-förhållanden

Även under neutrala pH-förhållanden uppnåddes fibrillbildning efter en fördröjningstid på 1,5 timmar, vilket visar att ultraljud avsevärt sänker den energetiska barriären för kärnbildning och tillväxt. Detta stöder ytterligare hypotesen att amyloidflimmer i första hand är en fysisk reaktion, till stor del begränsad av kärnbildningens energibarriär, som ultraljud effektivt minskar.

Påverkan på forskning om amyloidrelaterade sjukdomar

Den enkla och tillförlitliga bildningen av amyloidfibriller med hjälp av den UIP400MTP mikroplattan ultraljudsbehandling har betydande konsekvenser för forskning om Alzheimers sjukdom (AD) och andra amyloidrelaterade sjukdomar, såsom Parkinsons sjukdom, typ II-diabetes och systemiska amyloidoser. Vid Alzheimers sjukdom är amyloid-β (Aβ) aggregering ett viktigt patologiskt kännetecken, men att studera dess flimmerkinetik är fortfarande utmanande på grund av långa fördröjningsfaser och variabilitet i konventionella metoder. Ultraljudsdriven fibrillbildning påskyndar kärnbildning, vilket säkerställer hög reproducerbarhet och minskad variabilitet, vilket är avgörande för screening av potentiella hämmare och förståelse av amyloidogena mekanismer. Dessutom möjliggör den höga genomströmningskapaciteten hos UIP400MTP storskaliga undersökningar av felveckning och aggregering av proteiner, vilket underlättar upptäckten av terapeutiska medel som kan modulera fibrillbildning och potentiellt mildra neurodegenerativ progression.

Denna studie etablerar ultraljud med hjälp av den UIP400MTP multi-well platta sonikator som en mycket effektiv metod för att påskynda amyloid fibriller bildning. De viktigaste fördelarna med den här metoden är:

• Dramatisk minskning av fördröjningstiden för flimmer.
• Enhetlig ultraljudsexponering i alla brunnar, vilket möjliggör reproducerbar fibrillbildning.
• Screeningkapacitet med hög genomströmning, vilket gör den lämplig för genomomfattande sökningar av proteinamyloidogenicitet.

Genom att integrera ultraljud med ThT-fluorescensdetektion ger denna metod en snabb, skalbar och tillförlitlig plattform för att studera amyloidflimmer. Med tanke på dess effektivitet och potential för hög genomströmning kan detta tillvägagångssätt underlätta syntesen av amyloidfibriller för biofysisk och farmaceutisk forskning, och erbjuda ett lovande verktyg för amyloidrelaterade studier och läkemedelsscreening.