PMCA för detektion av prioner med hög provgenomströmning med ultraljudsapparaten UIP400MTP

Ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor erbjuder en kraftfull lösning för provberedning med hög provgenomströmning vid cyklisk amplifiering av felveckade proteiner (PMCA). Genom att fördela energin jämnt över flera brunnar och upprätthålla exakta ultraljudsparametrar möjliggör systemet samtidig bearbetning av ett stort antal prover med exceptionell reproducerbarhet. Dessa egenskaper är avgörande för att optimera PMCA för detektion av prioner vid låga koncentrationer i svåranalyserade biologiska prover, såsom saliv, där analyshämmare kan försvåra tolkningen av resultaten.

Prionsjukdomar, såsom avmagringssjuka (CWD) hos hjortdjur och Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (CJD) hos människor, är neurodegenerativa sjukdomar som orsakas av felveckade prionproteiner (PrP^Sc). Dessa sjukdomar innebär ofta låga halter av infektiösa prioner i kroppsvätskor, såsom saliv, blod och urin, vilket försvårar diagnostik och forskning. Horisontell överföring av CWD genom prioner som utsöndrats till olika miljömatriser har särskilt betydande konsekvenser för viltförvaltning och ekologisk hälsa. På motsvarande sätt är tillförlitlig amplifiering av felveckade prionproteiner från humana prover avgörande vid sjukdomar som Creutzfeldt-Jakobs sjukdom för att utveckla diagnostiken och förstå sjukdomsförloppet.

Genom att tillämpa ett modifierat PMCA-protokoll kan man kringgå vanliga analyshämmare (t.ex. muciner i saliv) och uppnå hög känslighet vid detektion av prioner som annars inte skulle kunna detekteras eller skulle ge tvetydiga resultat med tekniker såsom realtidskonversion inducerad genom skakning (RT-QuIC). Dessa framsteg förbättrar priondetektionen vid olika sjukdomar och gör PMCA till ett oumbärligt verktyg för prionforskning och diagnostik. Ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor underlättar PMCA med hög provgenomströmning genom ultraljudsbehandling av ett stort antal prover i mikroplattor (t.ex. plattor med 6, 24 eller 96 brunnar) eller provflaskor i ett provrörsställ.

Protokoll för cyklisk amplifiering av felveckade proteiner (PMCA) med hög provgenomströmning

Följande protokoll möjliggör effektiv bearbetning av ett stort antal prover under exakt samma förhållanden för robusta forskningsresultat.

Provberedning

Utgångsmaterial:
Bered prover genom att:

• Resuspendera sarkosylextraktionspelletar i PMCA-substrat.
• Spika hjärnhomogenat eller blodprover direkt med prionfrön.

Substrat:

• Använd ett 10% (wt/vol) hjärnhomogenat framställt från transgena möss som överuttrycker PrP^C (t.ex. Tg-möss).
• Homogenisera hjärnvävnaden i:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Förvara substratet vid -80ºC tills det ska användas.

Provuppställning i mikroplatta eller provrör:
Provrör:

• Tillsätt 90 μL hjärnhomogenatsubstrat och tillsätt 10 μL prov som prionfrö (t.ex. blod, hjärnhomogenat eller sarkosylpellet).
• Placera 3 Teflon-kulor (1,59-mm eller 2,38-mm diameter) i varje 0,2 mL-rör.
• Montera rören i ett ställ som är kompatibelt med ultraljudsapparaten UIP400MTP.

Mikroplatta med 6 brunnar:

• Tillsätt 5 mL hjärnhomogenatsubstrat och tillsätt 500 μL prov som prionfrö per brunn.
• Tillsätt 3 Teflon-kulor i varje brunn.

PMCA-förfarande

Placering:
Placera provrörsstället eller mikroplattan med 6 brunnar i ultraljudsapparaten UIP400MTP enligt tillverkarens anvisningar.

Cykelprogram:
Utför 144 PMCA-cykler enligt följande:

• Inkubation: 29 minuter och 30 sekunder vid 37°C.
• Ultraljudsbehandling: 30 sekunder vid 60% amplitud.
• Övervaka temperaturen: Använd den anslutningsbara temperatursensorn för att övervaka provtemperaturen och programmera UIP400MTP till en maximal temperatur på 48–50°C.

Efterföljande omgångar:
Efter att den första omgången med 144 cykler har slutförts, överför en alikvot av det amplifierade materialet:

• Späd 10 gånger i färskt hjärnhomogenatsubstrat från transgena möss.
• Utför 96 PMCA-cykler för efterföljande omgångar och bibehåll samma ultraljudsparametrar.
• Fortsätt till önskat antal omgångar (vanligen upp till 5).

Detektion av PrP^Sc

1. Nedbrytning med proteinas K:
   – Behandla proverna med proteinas K (50 μg/mL) vid 37°C i 1 timme.
   – Avsluta nedbrytningen genom att tillsätta SDS-provbuffert och koka i 10 minuter.
2. Western blot-analys:
   – Analysera nedbrutna prover med:
   – 6H4- eller PRC1-antikroppar mot PrP.
   – Utför SDS-PAGE och överför till PVDF-membran för detektion.

 

Hielscher UIP400MTP är den mest flexibla sonikatorn för multibrunnsplattor, PCR-plattor eller provrör. Med en kontinuerlig ultraljudseffekt på 400 watt är den utformad för tillämpningar som cellys, emulgering, proteinextraktion, DNA- / RNA-fragmentering, deagglomerering, FFPE-extraktion samt lösgöring av celler och biofilm eller emulgering. UIP400MTP är inget ultraljudsbad. Det är en högintensiv kopphornssonikator för fokuserad ultraljudsbehandling. Denna kraftfulla, kontaktfria sonikator ger en jämn ultraljudsbehandling i samtliga brunnar i en standardmultibrunnsplatta. Amplitud, effekt och pulsning kan styras med hög precision. En inbyggd timer och temperaturgivare säkerställer enhetliga resultat. Plattsonikatorn UIP400MTP kyler proverna med ett vattenbad (extern kylare finns som tillval).

 

Bearbeta fler prover för robustare resultat

Ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor förbättrar avsevärt effektiviteten och skalbarheten hos cyklisk amplifiering av felveckade proteiner (PMCA) och hanterar därmed förfarandets traditionellt tidskrävande karaktär. Genom att möjliggöra samtidig bearbetning av upp till 96 prover i en platta med 96 brunnar effektiviserar systemet PMCA-arbetsflöden samtidigt som exakta och enhetliga ultraljudsförhållanden upprätthålls i alla brunnar. Denna höga provgenomströmning minimerar den manuella hanteringen, minskar arbetskrävande moment och säkerställer reproducerbarhet, vilket gör apparaten till ett oumbärligt verktyg för prionforskning. Oavsett om forskningen gäller avmagringssjuka eller Creutzfeldt-Jakobs sjukdom underlättar UIP400MTP storskaliga studier med högre effektivitet, så att forskare kan möta kraven från moderna diagnostiska och vetenskapliga tillämpningar.

---

---

Litteratur / referenser

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.