PMCA för High-Throughput Detection av prioner med hjälp av UIP400MTP Sonicator

Den UIP400MTP multi-well plate sonicator erbjuder en kraftfull lösning för provberedning med hög genomströmning i protein misfolding cyclic amplification (PMCA). Genom att leverera enhetlig energifördelning över flera brunnar och upprätthålla exakta ultraljudsbehandlingsparametrar, möjliggör detta system samtidig bearbetning av många prover med exceptionell reproducerbarhet. Dessa funktioner är avgörande för att optimera PMCA för att detektera prioner vid låga koncentrationer i utmanande biologiska prover, såsom saliv, där analyshämmare kan dölja resultaten.

Prionsjukdomar, såsom chronic wasting disease (CWD) hos hjortdjur och Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (CJD) hos människor, är neurodegenerativa sjukdomar som orsakas av felveckade prionproteiner (PrP^Sc). Dessa sjukdomar innebär ofta låga nivåer av infektiösa prioner i kroppsvätskor, såsom saliv, blod och urin, vilket försvårar diagnos och forskning. Horisontell överföring av CWD via prioner som fälls i miljömatriser har särskilt betydande konsekvenser för viltförvaltning och ekologisk hälsa. På samma sätt, vid sjukdomar som Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, är tillförlitlig amplifiering av felveckade prionproteiner från mänskliga prover avgörande för att främja diagnostik och förstå sjukdomsprogression.

Genom att tillämpa ett modifierat PMCA-protokoll kan man kringgå vanliga analyshämmare (t.ex. muciner i saliv) och uppnå hög känslighet vid detektion av prioner som annars skulle vara odetekterbara eller tvetydiga med hjälp av tekniker som realtids-quaking-inducerad konvertering (RT-QuIC). Dessa framsteg förbättrar priondetektionen för olika sjukdomar, vilket gör PMCA till ett oumbärligt verktyg för prionforskning och diagnostik. Multi-well plate sonicator UIP400MTP underlättar hög genomströmning PMCA sonikering av många prover i mikroplattor (t.ex. 6-, 24- eller 96-brunnsplattor) eller ampuller i ett rörställ.

Protokoll för cyklisk amplifiering av protein med hög genomströmning (Misfolding Cyclic Amplification)

Följande protokoll möjliggör effektiv bearbetning av ett stort antal prover under exakt samma förhållanden för robusta forskningsresultat.

Beredning av prover

Utgångsmaterial:
Förbered prover genom att:

• Återsuspendera sarkosylextraktionspellets i PMCA-substrat.
• Direkt spetsande hjärnhomogenat eller blodprover med prionfrön.

Substrat:

• Använd ett 10 % (vikt/vol) hjärnhomogenat framställt av transgena möss som överuttrycker PrP^C (t.ex. Tg-möss).
• Homogenisera hjärnvävnaden i:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Förvara substratet vid -80ºC tills det används.

Provinställning i mikroplatta eller rör:
Rör:

• Tillsätt 90 μl substrat av hjärnhomogenat material och befrukta med 10 μL prov (t.ex. blod, hjärnhomogenat eller sarkosylpellet).
• Placera 3 teflonpärlor (1,59 mm eller 2,38 mm diameter) i varje 0,2 ml rör.
• Montera rören i ett rack som är kompatibelt med UIP400MTP ultraljudsfilter.

Mikroplatta med 6 brunnar:

• Tillsätt 5 ml substrat av hjärnhomogenat material och befrukta 500 μL prov per brunn.
• Tillsätt 3 teflonpärlor i varje brunn.

PMCA-förfarande

Placering:
Placera rörstället eller 6-håls mikroplattan i UIP400MTP ultraljudslampan enligt tillverkarens instruktioner.

Cykling program:
Utför 144 PMCA-cykler enligt följande:

• Inkubation: 29 minuter och 30 sekunder vid 37 °C.
• Ultraljudsbehandling: 30 sekunder vid 60% amplitud.
• Övervaka temperaturen: Använd den pluggbara temperatursensorn för att övervaka sample temperatur och programmera UIP400MTP till en maxtemperatur på 48–50°C.

Efterföljande omgångar:
Efter att ha slutfört den första omgången av 144 cykler, överför en alikvot av det amplifierade materialet:

• Späd 10-faldigt till ett färskt transgent homogent substrat för mushjärna.
• Utför 96 PMCA-cykler för efterföljande omgångar, med bibehållande av samma ultraljudsbehandling.
• Fortsätt med önskat antal omgångar (vanligtvis upp till 5).

Detektion av PrP^Sc

1. Proteinas K uppslutning:
   – Behandla prover med proteinas K (50 μg/ml) vid 37 °C i 1 timme.
   – Avsluta digestionen genom att tillsätta SDS-provbuffert och koka i 10 minuter.
2. Western Blot Analys:
   – Analysera smälta prover med hjälp av:
   – 6H4- eller PRC1-anti-PrP-antikroppar.
   – Utför SDS-PAGE och överför till PVDF-membran för detektion.

 

 

Bearbeta fler prover för mer robusta resultat

Den UIP400MTP multi-well plate sonicator förbättrar avsevärt effektiviteten och skalbarheten av protein misfolding cyclic amplification (PMCA), vilket tar itu med den traditionellt tidskrävande karaktären av förfarandet. Genom att tillåta samtidig bearbetning av upp till 96 prover i en 96-brunnars platta, effektiviserar systemet PMCA-arbetsflöden samtidigt som exakta och enhetliga ultraljudsbehandlingsförhållanden bibehålls över alla brunnar. Denna kapacitet med hög genomströmning minimerar manuell hantering, minskar arbetsintensiva steg och säkerställer reproducerbarhet, vilket gör den till ett oumbärligt verktyg för prionforskning. Oavsett om det handlar om chronic wasting disease eller Creutzfeldt-Jakobs sjukdom, underlättar UIP400MTP storskaliga studier med större effektivitet, vilket gör det möjligt för forskare att möta kraven på moderna diagnostiska och vetenskapliga tillämpningar.

---

---

Litteratur / Referenser

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.