Припрема великог броја узорака за митохондријалну дијагностику
Митохондријална дијагностика у истраживањима и клиничкој пракси спроводи се различитим техникама, као што су секвенцирање, PCR и биохемијски тестови. Ове методе користе се за идентификацију мутација ДНК и мерење функције митохондрија. Секвенцирање помаже у откривању генетских мутација, док PCR омогућава квантификацију специфичних секвенци ДНК. Биохемијским тестовима процењује се функционалност митохондријалних протеина и ензима.
Дијагностика митохондријалних болести посебно је тешка због изражене клиничке варијабилности ових болести, као и због сложене интеракције два генома који се различито наслеђују: митохондријалне ДНК (mtDNA) и нуклеарног генома.
Екстракција и фрагментација ДНК соникацијом
Екстракција ДНК из мишићног ткива посебно је корисна када се сумња на промене mtDNA специфичне за ткиво. Ове промене могу укључивати делеције mtDNA код хроничне прогресивне спољашње офталмоплегије (CPEO), тачкасте мутације mtDNA код митохондријалних миопатија или деплецију mtDNA код Алперсовог синдрома. ДНК екстрахована из мишићног ткива затим се може користити за различите генетске тестове, као што су Саутерн блот и PCR дугих фрагмената за делеције, PCR у реалном времену за деплецију или секвенцирање за тачкасте мутације.
Соникација, при којој се користе интензивни ултразвучни таласи, има више примена у митохондријалној дијагностици. Користи се за лизу ћелија ради екстракције унутарћелијског садржаја, као што су митохондрије и ДНК, за фрагментацију ДНК смицањем, укључујући mtDNA и nDNA, ради секвенцирања и за хомогенизацију узорака.
Соникатор за плоче UIP400MTP за припрему великог броја узорака равномерно соницира узорке у плочама са више бунарчића и плочама са 96 бунарчића
Како изоловати митохондрије из ћелија и ткива
Изолација митохондрија обухвата два основна корака: разарање ћелија ради ослобађања њиховог садржаја и примену диференцијалног центрифугирања ради раздвајања и прикупљања митохондријалних фракција.
Соникација
Hielscher соникатори компатибилни су са стандардним пуферима и комплетима за лизу, што их чини погодним за изолацију митохондрија. Соникација има две главне намене:
- Лиза ћелија: Ултразвучни таласи разарају ћелијске мембране, ослобађајући унутарћелијски садржај.
- Разарање митохондрија: Соникација у наредном кораку може да разори митохондрије и ослободи митохондријалне протеине или митохондријалну ДНК.
- Фрагментација mtDNA: Соникација је поуздана техника за фрагментацију митохондријалне ДНК смицањем ради секвенцирања.
Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP омогућава припрему великог броја митохондријалних узорака. У комбинацији са диференцијалним центрифугирањем, соникација повећава ефикасност изолације митохондрија, обезбеђујући високе приносе очуваних митохондрија погодних за различите даље примене.
Hielscher UIP400MTP соникатор за плоче са више бунарчића ради са било којом стандардном плочом
Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP нуди бројне предности за припрему великог броја узорака, на пример у митохондријалној дијагностици.
Соникатор за плоче са више бунарчића UIP400MTP за припрему великог броја узорака у дијагностици заснованој на биомаркерима.
Пример упутства за ултразвучну фрагментацију mtDNA
Припрема и екстракција:
- Мишеви C57BL/6 усмрћени су цервикалном дислокацијом.
- Јетре су брзо извађене и испране стерилним PBS-ом охлађеним на температуру леда.
Изолација митохондрија:
- Митохондрије су изоловане помоћу Dounce хомогенизатора ткива запремине 2 mL и комплета за изолацију митохондрија из ткива.
- Почетно центрифугирање при 700× g и 3.000× g.
- Извршите два додатна корака испирања пуфером C.
Изолација ДНК:
- Талог из првог центрифугирања при 700× g коришћен је за изолацију нуклеарне ДНК (nDNA).
- ДНК је изолована помоћу центрифугалних колона.
- Митохондријална ДНК (mtDNA) екстрахована је из изолованих митохондрија.
- Нуклеарна ДНК (nDNA) екстрахована је из сирових нуклеарних екстраката, при чему су обе врсте ДНК добијене из ткива јетре миша.
Фрагментација ДНК:
- ДНК је фрагментисана на леду помоћу ултразвучног соникатора UP50H (30-kHz/50-W) са сонотродом са микроврхом од 0,5 mm, при амплитуди од 14 μm, током 2 × 30 секунди.
Визуелизација и квантификација фрагментације:
- Фрагментација након ултразвучног третмана визуализована је на 1% агарозном гелу помоћу боје за ДНК SYBR safe.
- Релативна заступљеност mtDNA и nDNA одређена је помоћу qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
За припрему великог броја узорака, соникатор UIP400MTP за плоче са више бунарчића олакшава припрему великог броја узорака у стандардним плочама са 96 бунарчића, плочама са више бунарчића и микротитарским плочама.
Прочитајте више о предностима припреме великог броја узорака помоћу UIP400MTP!
Савети за оптималну изолацију митохондрија помоћу соникације:
- Контрола температуре: Спроводите све кораке у температурном опсегу од 0°C до 4°C. То је од пресудног значаја за очување интегритета и функционалности митохондрија.
- Ефикасност и брзина: Радите брзо и пречишћавајте митохондрије само у мери неопходној за вашу конкретну примену. Прекомерно руковање може довести до значајних губитака митохондријског садржаја.
- Разблаживање суспензија: Одржавајте ниске концентрације суспензија ћелија и органела током целог поступка изолације. То помаже да се ризици од заробљавања и аглутинације сведу на минимум, чиме се побољшава чистоћа изолованих митохондрија.
- Запремина узорка: Определите се за више припрема малог обима уместо једне припреме великог обима. Овај приступ обично даје боље приносе, јер повећање обима не повећава сразмерно количину митохондрија које се могу издвојити. Соникатор UIP400MTP за плоче са више бунарчића олакшава брзу и поуздану лизу ћелија ради изолације митохондрија, као и екстракцију протеина из митохондрија.
Ове смернице учиниће поступак изолације помоћу ултразвучне лизе и центрифугирања ефикаснијим, дајући висококвалитетне митохондријске препарате погодне за даље примене.
Hielscher соникатори – квалитет произведен у Немачкој
Hielscher ултразвучни уређаји добро су познати по највишим стандардима квалитета и дизајна. Робусност и једноставно руковање омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних уређаја у индустријска постројења. Hielscher ултразвучни уређаји лако раде у тешким условима и захтевним окружењима.
Hielscher Ultrasonics је компанија са ISO сертификатом и посебан нагласак ставља на ултразвучне уређаје високих перформанси који се одликују најсавременијом технологијом и једноставном употребом. Наравно, Hielscher ултразвучни уређаји усаглашени су са CE захтевима и испуњавају захтеве UL, CSA и RoHs.
Соникатор UIP400MTP за плоче са 96 бунарчића, за соникацију микротитарских плоча и плоча са више бунарчића
Литература / Референце
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Често постављана питања о митохондријама и митохондријској дијагностици
Шта су митохондрије?
Митохондрије су органеле окружене мембраном које се налазе у ћелијама већине еукариотских организама. Познате су као енергетске централе ћелије јер производе енергију у облику аденозин-трифосфата (ATP) кроз процес ћелијског дисања. Поред тога, митохондрије имају сопствену ДНК и играју кључне улоге у другим ћелијским процесима, укључујући регулацију ћелијског циклуса и ћелијске смрти.
По чему се mtDNA разликује од геномске ДНК?
Митохондријска ДНК (mtDNA) разликује се од геномске ДНК (gDNA) на неколико кључних начина. MtDNA се налази у митохондријама, кружна је и наслеђује се по мајчинској линији, док се gDNA налази у ћелијском једру, линеарна је и наслеђује се од оба родитеља. MtDNA је знатно мања и кодира само 37 гена, док gDNA садржи око 20.000–25.000 гена. MtDNA је присутна у више копија по ћелији, има вишу стопу мутација и првенствено кодира протеине укључене у функцију митохондрија. Насупрот томе, gDNA је обично диплоидна, има нижу стопу мутација и кодира широк спектар гена неопходних за развој и функционисање организма. Поред тога, транскрипција и транслација mtDNA одвијају се унутар митохондрија, док се транскрипција gDNA одвија у једру, а транслација у цитоплазми. Ове разлике одражавају њихове различите улоге и еволуционо порекло.
Шта је бесћелијски екстракт?
Бесћелијски екстракт је раствор који садржи садржај лизираних ћелија, укључујући протеине, нуклеинске киселине и друге ћелијске компоненте, али без очуваних ћелијских мембрана. Овај екстракт се користи у биохемијским и молекуларнобиолошким истраживањима за проучавање ћелијских процеса in vitro, омогућавајући истраживачима да анализирају реакције и механизме изван живих ћелија.
Какву улогу имају PCR тестови у митохондријској дијагностици?
PCR тестови имају кључну улогу у митохондријској дијагностици јер омогућавају откривање мутација, делеција или варијација у броју копија митохондријске ДНК (mtDNA). Они омогућавају амплификацију специфичних региона mtDNA ради идентификације патогених варијанти повезаних са митохондријским поремећајима. Технике засноване на PCR-у, као што су квантитативни PCR (qPCR) и PCR дугих фрагмената, користе се и за процену интегритета mtDNA, нивоа хетероплазмије и деплеције mtDNA, пружајући суштински увид у функцију митохондрија и болести.
Сазнајте како соникатор за микроплоче UIP400MTP олакшава PCR тестове и анализе!
Шта је диференцијално центрифугирање?
Диференцијално центрифугирање је широко примењивана техника за фракционисање ћелија и изолацију митохондрија. Ова метода раздваја ћелијске структуре на основу њиховог коефицијента седиментације, који зависи и од густине и од облика. Поступак подразумева примену различитих нивоа центрифугалне силе на узорке у пуферисаним растворима соли одређених густина. Структуре са сличним коефицијентима седиментације истовремено ће се исталожити на дну епрувете за прикупљање, што омогућава њихово издвајање.
Како се диференцијално центрифугирање користи за изолацију митохондрија?
Диференцијално центрифугирање омогућава истраживачима да ефикасно одвоје митохондријске фракције од других ћелијских компоненти. Изолација митохондрија обухвата неколико корака центрифугирања и накнадно прикупљање изолата.
Почетно центрифугирање: Примените малу центрифугалну силу да бисте исталожили крупне ћелијске остатке и једра.
Наредна центрифугирања: Постепено повећавајте центрифугалну силу да бисте исталожили фракције обогаћене митохондријама. Сваким кораком центрифугирања уклањају се структуре са све већим коефицијентима седиментације.
Прикупљање фракција: После сваког центрифугирања прикупља се талог, а супернатант се излаже већим g-силама да би се изоловала следећа фракција. Ово се понавља док се не постигне жељена чистоћа митохондрија.