Високо пропусна припрема узорака за митохондријалну дијагностику
Дијагностика митохондрија у истраживањима и клиникама се обавља коришћењем различитих техника као што су секвенцирање, ПЦР и биохемијски тестови. Ове методе се користе за идентификацију мутација ДНК и мерење митохондријалне функције. Секвенцирање помаже у откривању генетских мутација, док ПЦР може квантификовати специфичне секвенце ДНК. Биохемијски тестови процењују функционалност митохондријалних протеина и ензима.
Дијагностика митохондријалних болести је посебно тешка због изражене клиничке варијабилности ових болести, као и због сложене интеракције између два различито наследна генома: митохондријалне ДНК (мтДНК) и нуклеарног генома.
Екстракција и фрагментација ДНК помоћу соникације
Екстракција ДНК из мишићног ткива је посебно корисна када се сумња на ткивно специфичне промене у мтДНК. Ове промене могу укључивати делеције мтДНК код хроничне прогресивне спољашње офталмоплегије (ЦПЕО), тачкасте мутације мтДНК код митохондријалних миопатија или исцрпљивање мтДНК код Алперсовог синдрома. ДНК екстрахован из мишићног ткива може се затим користити за различите генетске тестове, као што су Соутхерн блот и ПЦР дугог домета за делеције, ПЦР у реалном времену за исцрпљивање или секвенцирање за тачкасте мутације.
Соникација, користећи интензивне ултразвучне таласе, примењује се за неколико примена у митохондријалној дијагностици. Користи се за лизу ћелија за екстракцију интрацелуларног садржаја као што су митохондрије и ДНК, за смицање ДНК као што су мтДНК и нДНК за секвенцирање и за хомогенизацију узорака.
УИП400МТП соникатор плоча за припрему узорака високог протока равномерно обрађује узорке соникацијом у плочама са више и 96 јажица
Како изоловати митохондрије од ћелија и ткива
Изолација митохондрија обухвата два суштинска корака: разбијање ћелија да би се ослободио њихов садржај и коришћење диференцијалног центрифугирања да се одвоје и поврате митохондријалне фракције.
соницатион
Хиелсцхер соникатори су компатибилни са стандардним пуферима и комплетима за лизу, што их чини погодним за изолацију митохондрија. Соникација има две главне сврхе:
- Лиза ћелија: Ултразвучни таласи ометају ћелијске мембране, ослобађајући интрацелуларни садржај.
- Поремећај митохондрија: Соникација у следећем кораку може да разбије митохондрије да би се ослободили митохондријски протеини или митохондријална ДНК.
- Фрагментација мтДНК: Соникација је поуздана техника за смицање митохондријске ДНК за секвенцирање.
Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП омогућава припрему узорака митохондријалних узорака велике пропусности. У комбинацији са диференцијалним центрифугирањем, соникација побољшава ефикасност митохондријалне изолације, обезбеђујући високе приносе нетакнутих митохондрија погодних за различите низводне примене.
Хиелсцхер УИП400МТП соникатор плоча са више јажица ради са било којом стандардном плочом
Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП нуди бројне предности за припрему узорака високог протока, нпр. у митохондријалној дијагностици.
УИП400МТП Мултивелл Плате Соницатор за високопропусну припрему узорака у дијагностици биомаркера.
Примери инструкција за ултразвучну фрагментацију мтДНК
Припрема и екстракција:
- Ц57БЛ/6 мишеви су убијени дислокацијом грлића материце.
- Јетра су брзо екстрахована и испрана у ледено хладном стерилном ПБС-у.
Изолација митохондрија:
- Митохондрије су изоловане коришћењем Доунце млевења ткива од 2 мЛ и комплета за изолацију митохондрија за ткиво.
- Почетно центрифугирање на 700× г и 3.000× г.
- Обавите два додатна корака прања са пуфером Ц.
Изолација ДНК:
- Пелет из првог центрифугирања на 700 × г коришћен је за изолацију нуклеарне ДНК (нДНК).
- ДНК је изолована коришћењем спин колона.
- Митохондријска ДНК (мтДНК) је екстрахована из изолованих митохондрија.
- Нуклеарна ДНК (нДНК) је екстрахована из сирових нуклеарних екстраката, оба из ткива јетре миша.
Фрагментација ДНК:
- ДНК је фрагментисана на леду коришћењем ултразвучног соникатора УП50Х од 30 кХз/50 В са сонотродом од 0,5 мм са микро врхом на 14 μм током 2 × 30 секунди.
Визуелизација и квантификација фрагментације:
- Фрагментација након ултрасонификације је визуелизована на 1% агарозном гелу са СИБР безбедном ДНК бојом.
- Релативна заступљеност мтДНК и нДНК одређена је кПЦР.
(уп. Мариеро ет ал., 2019)
За припрему узорака високе пропусности, ултразвучни уређај за плоче са више јажица УИП400МТП олакшава припрему великог броја узорака у стандардним плочама са 96 јажица, са више јажица и микротитарским плочама.
Прочитајте више о предностима припреме узорака високе пропусности помоћу УИП400МТП!
Савети за оптималну изолацију митохондрија помоћу ултразвука:
- Контрола температуре: Спроведите све кораке на температурном опсегу од 0°Ц до 4°Ц. Ово је кључно за одржавање интегритета и функционалности митохондрија.
- Ефикасност и брзина: Радите брзо и прочистите митохондрије само у мери која је потребна за вашу специфичну примену. Прекомерна манипулација може довести до значајних губитака митохондријалног садржаја.
- Разблаживање суспензија: Одржавајте ниске концентрације суспензија ћелија и органела током процеса изолације. Ово помаже да се минимизирају ризици од хватања и аглутинације, чиме се побољшава чистоћа изолованих митохондрија.
- Волумен узорка: Одлучите се за више припрема мањих размера, а не за једну велику. Овај приступ обично резултира бољим приносима, пошто повећање не повећава пропорционално количину митохондрија које се могу повратити. Соникатор плоча са више бунара УИП400МТП олакшава брзу и поуздану лизу ћелије за изолацију митохондрија, као и екстракцију протеина из митохондрија.
Ове смернице ће учинити процес изолације коришћењем ултразвучне лизе и центрифугирања ефикаснијим, дајући висококвалитетне митохондријалне препарате погодне за низводне примене.
Хиелсцхер Соницаторс – Квалитет Маде ин Германи
Хиелсцхер ултрасоникатори су познати по свом највишем квалитету и стандардима дизајна. Робусност и једноставан рад омогућавају несметану интеграцију наших ултразвучних апарата у индустријске објекте. Хиелсцхер ултрасоникатори се лако носе са тешким условима и захтевним окружењима.
Хиелсцхер Ултрасоницс је ИСО сертификована компанија и ставља посебан нагласак на ултрасоникаторе високих перформанси са најсавременијом технологијом и једноставношћу за коришћење. Наравно, Хиелсцхер ултрасоникатори су усаглашени са ЦЕ и испуњавају захтеве УЛ, ЦСА и РоХ.
Соникатор плоча са 96 јажица УИП400МТП за соникацију микротитарских и плоча са више јажица
Литература / Референце
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Често постављана питања о митохондријама и митохондријалној дијагностици
Шта су митохондрије?
Митохондрије су органеле везане за мембрану које се налазе у ћелијама већине еукариотских организама. Они су познати као електране ћелије јер производе енергију у облику аденозин трифосфата (АТП) кроз процес ћелијског дисања. Поред тога, митохондрије имају сопствену ДНК и играју кључну улогу у другим ћелијским процесима, укључујући регулацију ћелијског циклуса и ћелијску смрт.
Шта разликује мтДНК од геномске ДНК?
Митохондријална ДНК (мтДНК) се разликује од геномске ДНК (гДНК) на неколико кључних начина. МтДНК се налази у митохондријима, кружна је и наслеђује се по мајци, док се гДНК налази у ћелијском језгру, линеарна је и наслеђује се од оба родитеља. МтДНК је много мања, кодира само 37 гена, док гДНК садржи око 20.000-25.000 гена. МтДНК је присутна у више копија по ћелији, има већу стопу мутације и првенствено кодира протеине укључене у функцију митохондрија. Насупрот томе, гДНК је типично диплоидна, има нижу стопу мутација и кодира широку лепезу гена неопходних за развој и функцију организма. Поред тога, транскрипција и транслација мтДНК се дешавају унутар митохондрија, док се транскрипција гДНК дешава у језгру, а транслација се дешава у цитоплазми. Ове разлике одражавају њихове различите улоге и еволуционо порекло.
Шта је екстракт без ћелија?
Екстракт без ћелија је раствор који садржи садржај лизираних ћелија, укључујући протеине, нуклеинске киселине и друге ћелијске компоненте, али без нетакнутих ћелијских мембрана. Овај екстракт се користи у биохемијском и молекуларном биолошком истраживању за проучавање ћелијских процеса ин витро, омогућавајући истраживачима да анализирају реакције и механизме изван живих ћелија.
What Role Play PCR Tests in Mitochondrial Diagnostics?
PCR tests play a critical role in mitochondrial diagnostics by enabling the detection of mutations, deletions, or copy number variations in mitochondrial DNA (mtDNA). They allow for the amplification of specific mtDNA regions to identify pathogenic variants associated with mitochondrial disorders. PCR-based techniques, such as quantitative PCR (qPCR) and long-range PCR, are also used to assess mtDNA integrity, heteroplasmy levels, and mtDNA depletion, providing essential insights into mitochondrial function and disease.
Learn how the UIP400MTP Microplate Sonicator facilitates PCR tests and assays!
Шта је диференцијална центрифугација?
Диференцијално центрифугирање је широко коришћена техника за фракционисање ћелија и изолацију митохондрија. Ова метода раздваја ћелијске структуре на основу њиховог коефицијента седиментације, који зависи и од густине и од облика. Процес укључује примену различитих нивоа центрифугалне силе на узорке у пуферованим растворима соли специфичне густине. Структуре са сличним коефицијентима седиментације ће се у исто време таложити на дну сабирне цеви, омогућавајући њихов опоравак.
Како се диференцијална центрифугација користи за изолацију митохондрија?
Диференцијално центрифугирање омогућава истраживачима да ефикасно одвоје митохондријалне фракције од других ћелијских компоненти. Изолација митохондрија укључује неколико корака центрифугирања и накнадни опоравак изолата.
Почетно центрифугирање: Примијенити ниску центрифугалну силу да седиментира велике ћелијске остатке и језгра.
Наредне центрифугације: Постепено повећавајте центрифугалну силу до фракција пелета обогаћених митохондријама. Сваки корак центрифугирања уклања структуре са прогресивно вишим коефицијентима седиментације.
Опоравак фракција: После сваког центрифугирања, пелет се сакупља, а супернатант се подвргава већим г-силама да би се изоловала следећа фракција. Ово се понавља све док се не постигне жељена чистоћа митохондрија.