Ultrazvočno podprta fermentacija za proizvodnjo bioetanola

Ultrazvočno podprta fermentacija lahko izboljša proizvodnjo bioetanola s spodbujanjem razgradnje kompleksnih ogljikovih hidratov v enostavnejše sladkorje, ki so tako kvasovkam lažje dostopni za pretvorbo v etanol. Hkrati sonikacija izboljša tudi učinkovitost prepustnosti celičnih sten kvasovk, kar omogoča hitrejše sproščanje etanola in povečanje celotne proizvodnje. Ultrazvočno podprta fermentacija bioetanola tako zagotavlja višje stopnje pretvorbe in večje izkoristke.

Fermentacija

Fermentacija je lahko aeroben (= oksidativna fermentacija) ali anaeroben proces, ki se uporablja v biotehnoloških postopkih za pretvorbo organskih snovi z bakterijskimi, glivnimi ali drugimi biološkimi celičnimi kulturami oziroma encimi. Pri fermentaciji se energija pridobiva z oksidacijo organskih spojin, npr. ogljikovih hidratov.
Sladkor je najpogostejši substrat za fermentacijo, pri kateri nastanejo proizvodi, kot so mlečna kislina, laktoza, etanol in vodik. Pri alkoholni fermentaciji se s fermentacijo proizvaja etanol – zlasti za uporabo kot gorivo, pa tudi za alkoholne pijače. Ko določeni sevi kvasovk, kot je Saccharomyces cerevisiae , presnavljajo sladkor, celice kvasovk pretvorijo izhodno snov v etanol in ogljikov dioksid.

Spodnje kemijske enačbe povzemajo pretvorbo:

Če je izhodna snov škrob, npr. iz koruze, je treba škrob najprej pretvoriti v sladkor. Za bioetanol, ki se uporablja kot gorivo, je za pretvorbo škroba potrebna hidroliza. Hidrolizo običajno pospešimo s kislinsko ali encimsko obdelavo oziroma s kombinacijo obeh. Fermentacija običajno poteka pri približno 35–40 °C.
Pregled različnih fermentacijskih procesov:

Živila:

• proizvodnja & konzerviranje
• mlečni izdelki (mlečnokislinska fermentacija), npr. jogurt, pinjenec, kefir
• mlečnokislinsko fermentirana zelenjava, npr. kimči, miso, natto, tsukemono, kislo zelje
• razvoj aromatičnih snovi, npr. sojina omaka
• razgradnja strojilnih snovi, npr. čaj, kakav, kava, tobak
• alkoholne pijače, npr. pivo, vino, viski

Zdravila:

• proizvodnja zdravilnih spojin, npr. inzulina, hialuronske kisline

Bioplin/ etanol:

• izboljšanje proizvodnje bioplina/ bioetanola

Različne raziskovalne objave ter preskusi z namiznimi napravami in v pilotnem merilu so pokazali, da ultrazvok izboljša fermentacijski proces, saj zagotavlja več biomase, dostopne za encimsko fermentacijo. V naslednjem razdelku bodo podrobneje predstavljeni učinki ultrazvoka v tekočini.

Učinki ultrazvočne obdelave tekočin

Z ultrazvokom visoke moči/ nizke frekvence je mogoče ustvariti visoke amplitude. Zato se lahko ultrazvok visoke moči/ nizke frekvence uporablja za obdelavo tekočin, kot so mešanje, emulgiranje, dispergiranje in deaglomeracija ali mletje.
Pri sonikaciji tekočin z visoko intenzivnostjo zvočni valovi, ki se širijo v tekočem mediju, povzročajo izmenjujoče se cikle visokega tlaka (stiskanje) in nizkega tlaka (redčenje), katerih hitrost je odvisna od frekvence. Med ciklom nizkega tlaka ultrazvočni valovi visoke intenzivnosti v tekočini ustvarijo majhne vakuumske mehurčke ali votline. Ko mehurčki dosežejo prostornino, pri kateri ne morejo več absorbirati energije, se med ciklom visokega tlaka silovito sesedejo. Ta pojav imenujemo kavitacija. Kavitacija, to je »nastajanje, rast in implozijski kolaps mehurčkov v tekočini. Kavitacijski kolaps povzroča intenzivno lokalno segrevanje (~5000 K), visoke tlake (~1000 atm) in izjemne hitrosti segrevanja in ohlajanja (>109 K/sec)« ter tekočinske curke (~400 km/h)«. (Suslick 1998)

Kavitacijo je mogoče ustvariti na različne načine, na primer z visokotlačnimi šobami, mešalniki rotor–stator ali ultrazvočnimi procesorji. V vseh teh sistemih se vnesena energija pretvarja v trenje, turbulenco, valovanje in kavitacijo. Delež vnesene energije, ki se pretvori v kavitacijo, je odvisen od več dejavnikov, ki opisujejo gibanje opreme za ustvarjanje kavitacije v tekočini. Intenzivnost pospeševanja je eden najpomembnejših dejavnikov, ki vplivajo na učinkovito pretvorbo energije v kavitacijo. Večji pospešek ustvarja večje tlačne razlike. To povečuje verjetnost nastanka vakuumskih mehurčkov namesto nastanka valov, ki se širijo skozi tekočino. Večji kot je torej pospešek, večji je delež energije, ki se pretvori v kavitacijo.
Pri ultrazvočnem pretvorniku amplituda nihanja opisuje intenzivnost pospeševanja. Višje amplitude omogočajo učinkovitejše ustvarjanje kavitacije. Poleg ustrezne intenzivnosti je treba tekočino pospeševati tako, da so izgube zaradi turbulence, trenja in ustvarjanja valov čim manjše. Za to je optimalno gibanje v eni smeri. S spreminjanjem intenzivnosti in parametrov sonikacijskega procesa je lahko ultrazvočna obdelava zelo intenzivna ali zelo blaga. Zato je ultrazvok zelo vsestransko orodje za različne namene.

Blagi postopki, pri katerih se uporablja blaga sonikacija v blagih pogojih, vključujejo razplinjevanje, emulgiranje in aktivacijo encimov. Intenzivni postopki z ultrazvokom visoke intenzivnosti/ visoke moči (večinoma pri povišanem tlaku) so mokro mletje, deaglomeracija in zmanjševanje velikosti delcev ter dispergiranje. Pri številnih postopkih, kot so ekstrakcija, razgradnja ali sonokemija, je potrebna ultrazvočna intenzivnost odvisna od posameznega materiala, ki ga sonikiramo. Različni parametri, ki jih je mogoče prilagoditi posameznemu procesu, omogočajo, da z ultrazvokom za vsak proces poiščemo optimalno delovno točko.
Poleg izjemne pretvorbe moči ima ultrazvočna obdelava veliko prednost popolnega nadzora nad najpomembnejšimi parametri: amplitudo, tlakom, temperaturo, viskoznostjo in koncentracijo. To omogoča prilagajanje vseh teh parametrov, da za vsak posamezen material najdemo idealne parametre obdelave. Rezultat sta večja učinkovitost in optimizirana energijska učinkovitost.

Ultrazvok za izboljšanje fermentacijskih procesov, pojasnjen na primeru proizvodnje bioetanola

Bioetanol je proizvod razgradnje biomase ali biološko razgradljivih odpadnih snovi z anaerobnimi ali aerobnimi bakterijami. Proizvedeni etanol se uporablja predvsem kot biogorivo. Zato je bioetanol obnovljiva in okolju prijazna alternativa fosilnim gorivom, kot je zemeljski plin.
Za proizvodnjo etanola iz biomase se lahko kot surovine uporabljajo sladkor, škrob in lignocelulozni material. Pri proizvodnji v industrijskem merilu trenutno prevladujeta sladkor in škrob, saj sta ekonomsko ugodna.
Kako ultrazvok izboljša proces, prilagojen posameznemu naročniku, z določeno surovino v danih pogojih, je mogoče zelo preprosto preveriti s preskusi izvedljivosti. V prvem koraku bo sonikacija majhne količine surovinske suspenzije z ultrazvočno laboratorijsko napravo pokazala, ali ultrazvok vpliva na surovino.

Preskušanje izvedljivosti

V prvi fazi preskušanja je primerno vnesti razmeroma veliko ultrazvočne energije v majhno prostornino tekočine, saj se tako poveča možnost, da ugotovimo, ali je mogoče doseči kakršne koli rezultate. Majhna prostornina vzorca skrajša tudi čas uporabe laboratorijske naprave in zmanjša stroške prvih preskusov.
Ultrazvočni valovi se s površine sonotrode prenašajo v tekočino. Pod površino sonotrode je ultrazvočna intenzivnost največja. Zato so zaželene kratke razdalje med sonotrodo in sonikiranim materialom. Pri obdelavi majhne prostornine tekočine je mogoče ohraniti kratko razdaljo od sonotrode.
Spodnja preglednica prikazuje značilne ravni energije/prostornine za sonikacijske procese po optimizaciji. Ker prvi preskusi ne bodo potekali pri optimalni konfiguraciji, bosta intenzivnost in čas sonikacije, ki znašata od 10 do 50-krat toliko kot značilna vrednost, pokazala, ali obstaja kakršen koli učinek na sonikirani material ali ne.

Proces	Energija/ prostornina	Prostornina vzorca	Moč	Čas
Preprost	< 100Ws/mL	10mL	50W	< 20 sec
Srednje zahteven	100Ws/mL do 500Ws/mL	10mL	50W	20 do 100 sec
Zahteven	> 500Ws/mL	10mL	50W	>100 sec

Preglednica 1 – Značilne vrednosti sonikacije po optimizaciji procesa

Dejansko vneseno moč med preskusi je mogoče beležiti z vgrajenim zapisovanjem podatkov (UP200Ht in UP200St), prek računalniškega vmesnika ali z merilnikom moči. Skupaj z zabeleženimi podatki o nastavitvi amplitude in temperaturi je mogoče ovrednotiti rezultate vsakega preskusa ter določiti osnovno vrednost energije/prostornine.
Če je bila med preskusi izbrana optimalna konfiguracija, bi lahko njeno delovanje preverili v koraku optimizacije in nato povečali merilo do komercialne ravni. Za lažjo optimizacijo je zelo priporočljivo preučiti tudi meje sonikacije, npr. temperaturo, amplitudo ali energijo/prostornino za določene formulacije. Ker bi ultrazvok lahko negativno vplival na celice, kemikalije ali delce, je treba preučiti kritične ravni vsakega parametra, da se nadaljnja optimizacija omeji na območje parametrov, v katerem ni zaznati negativnih učinkov. Za študijo izvedljivosti priporočamo majhne laboratorijske ali namizne naprave, da se omejijo stroški opreme in vzorcev pri takšnih preskusih. Na splošno so naprave z močjo od 100 do 1.000 vatov zelo primerne za študije izvedljivosti. (prim. Hielscher 2005)

Optimizacija

Rezultati študij izvedljivosti lahko kažejo precej veliko porabo energije glede na majhno obdelano prostornino. Vendar je namen preskusa izvedljivosti predvsem pokazati učinke ultrazvoka na material. Če so se med preskušanjem izvedljivosti pojavili pozitivni učinki, so potrebna nadaljnja prizadevanja za optimizacijo razmerja energija/prostornina. To pomeni raziskati idealno konfiguracijo ultrazvočnih parametrov za doseganje največjega izkoristka ob najmanjši mogoči porabi energije, da bo proces ekonomsko čim bolj smiseln in učinkovit. Da bi našli optimalno konfiguracijo parametrov – doseganje želenih koristi z minimalnim vnosom energije –, je treba raziskati povezanost najpomembnejših parametrov: amplitude, tlaka, temperature in tekočinske sestave. V tem drugem koraku je priporočljiv prehod s šaržne sonikacije na sistem za neprekinjeno sonikacijo z reaktorjem s pretočno celico, saj pri šaržni sonikaciji ni mogoče vplivati na pomembni parameter tlaka. Med sonikacijo v šarži je tlak omejen na tlak okolice. Če sonikacijski proces poteka skozi komoro pretočne celice, ki omogoča vzpostavitev tlaka, je mogoče tlak povišati (ali znižati), kar na splošno močno vpliva na ultrazvočno kavitacijo . Z uporabo pretočne celice je mogoče določiti povezanost med tlakom in učinkovitostjo procesa. Za optimizacijo procesa so najprimernejši ultrazvočni procesorji z močjo od 500 vatov do 2000 vatov .

Povečanje merila do komercialne proizvodnje

Ko je optimalna konfiguracija določena, je nadaljnje povečanje merila preprosto, saj so ultrazvočni procesi popolnoma ponovljivi pri linearnem povečanju merila. To pomeni, da je pri uporabi ultrazvoka za enako tekočinsko formulacijo ob enaki konfiguraciji parametrov obdelave za doseganje enakega rezultata potrebna enaka energija na prostornino, neodvisno od merila obdelave. (Hielscher 2005). To omogoča uporabo optimalne konfiguracije ultrazvočnih parametrov pri proizvodnji v polnem merilu. Prostornina, ki jo je mogoče obdelati z ultrazvokom, je praktično neomejena. Na voljo so komercialni ultrazvočni sistemi z močjo do 16.000 vatov na enoto, ki jih je mogoče namestiti v skupine. Takšne skupine ultrazvočnih procesorjev je mogoče namestiti vzporedno ali zaporedno. Z namestitvijo ultrazvočnih procesorjev visoke moči v skupine je skupna moč skoraj neomejena, zato je mogoče brez težav obdelovati tokove z velikim volumskim pretokom. Tudi če je potrebna prilagoditev ultrazvočnega sistema, npr. prilagoditev parametrov spremenjeni tekočinski formulaciji, je to večinoma mogoče izvesti z zamenjavo sonotrode, ojačevalnika amplitude ali pretočne celice. Zaradi linearnega povečevanja merila, ponovljivosti in prilagodljivosti ultrazvoka je ta inovativna tehnologija učinkovita in stroškovno ugodna.

Parametri ultrazvočne obdelave

Ultrazvočno obdelavo tekočin opisuje več parametrov. Najpomembnejši so amplituda, tlak, temperatura, viskoznost in koncentracija. Rezultat procesa, na primer velikost delcev, je pri določeni konfiguraciji parametrov funkcija energije na obdelano prostornino. Funkcija se spremeni ob spremembah posameznih parametrov. Poleg tega je dejanska izhodna moč na enoto površine sonotrode ultrazvočne naprave odvisna od parametrov. Izhodna moč na enoto površine sonotrode je površinska intenzivnost (I). Površinska intenzivnost je odvisna od amplitude (A), tlaka (p), prostornine reaktorja (VR), temperature (T), viskoznosti (η) in drugih parametrov.

Učinek ustvarjene kavitacije je odvisen od površinske intenzivnosti. Na enak način je z njo povezan tudi rezultat procesa. Skupna izhodna moč ultrazvočne naprave je zmnožek površinske intenzivnosti (I) in površine (S):

P [W] I [W / mm²]* S[mm²]

Amplituda

Amplituda nihanja opisuje pot (npr. 50 µm), ki jo površina sonotrode opravi v določenem času (npr. 1/20.000s pri 20kHz). Večja kot je amplituda, večja je hitrost zniževanja in zviševanja tlaka pri vsakem pomiku. Poleg tega se poveča prostorninski pomik pri vsakem pomiku, kar povzroči večjo prostornino kavitacije (velikost in/ali število mehurčkov). Pri uporabi v disperzijah višje amplitude povzročijo močnejše razbijanje trdnih delcev. Preglednica 1 prikazuje splošne vrednosti za nekatere ultrazvočne procese.

Tlak

Vrelišče tekočine je odvisno od tlaka. Višji kot je tlak, višje je vrelišče in obratno. Povišan tlak omogoča kavitacijo pri temperaturah blizu vrelišča ali nad njim. Poveča tudi intenzivnost implozije, ki je povezana z razliko med statičnim tlakom in parnim tlakom v mehurčku (prim. Vercet et al. 1999). Ker se ultrazvočna moč in intenzivnost ob spremembah tlaka hitro spreminjata, je primernejša črpalka s konstantnim tlakom. Pri dovajanju tekočine v pretočno celico mora biti črpalka sposobna zagotavljati določen pretok tekočine pri ustreznih tlakih. Membranske črpalke; črpalke z gibko cevjo, cevne ali stiskalne črpalke; peristaltične črpalke; ali batne oziroma plunžerske črpalke povzročajo izmenično nihanje tlaka. Prednost imajo centrifugalne črpalke, zobniške črpalke, spiralne črpalke in ekscentrične vijačne črpalke, ki tekočino za sonikacijo dovajajo pri stalno stabilnem tlaku. (Hielscher 2005)

Temperatura

Pri sonikaciji tekočine se moč prenaša v medij. Ker ultrazvočno ustvarjeno nihanje povzroča turbulenco in trenje, se sonikirana tekočina – v skladu z zakonom termodinamike – segreje. Povišane temperature obdelovanega medija lahko poškodujejo material in zmanjšajo učinkovitost ultrazvočne kavitacije. Inovativne ultrazvočne pretočne celice so opremljene s hladilnim plaščem (glejte sliko). To zagotavlja natančen nadzor nad temperaturo materiala med ultrazvočno obdelavo. Za sonikacijo manjših prostornin v čaši je za odvajanje toplote priporočljiva ledena kopel.

Viskoznost in koncentracija

Ultrazvočno mletje in dispergiranje sta procesa, ki potekata v tekočini. Delci morajo biti v suspenziji, npr. v vodi, olju, topilih ali smolah. Z uporabo ultrazvočnih pretočnih sistemov je mogoče sonikirati zelo viskozen, pastozen material.
Ultrazvočni procesor visoke moči lahko deluje pri razmeroma visokih koncentracijah trdnih snovi. Visoka koncentracija zagotavlja učinkovitost ultrazvočne obdelave, saj učinek ultrazvočnega mletja povzročajo trki med delci. Raziskave so pokazale, da je hitrost drobljenja silicijevega dioksida neodvisna od koncentracije trdnih snovi do 50% po masi. Obdelava koncentratov z visokim deležem materiala je običajen proizvodni postopek z uporabo ultrazvočne obdelave.

Moč in intenzivnost v primerjavi z energijo

Površinska intenzivnost in skupna moč opisujeta le intenzivnost obdelave. Za opis sonikacijskega procesa, ki omogoča povečanje merila in ponovljivost, je treba upoštevati prostornino sonikiranega vzorca in čas izpostavljenosti pri določeni intenzivnosti. Pri določeni konfiguraciji parametrov je rezultat procesa, npr. velikost delcev ali kemijska pretvorba, odvisen od energije na prostornino (E/V).

Rezultat = f (E /V )

Pri tem je energija (E) zmnožek izhodne moči (P) in časa izpostavljenosti (t).

E[Ws] = P[W]*t[s]

Spremembe konfiguracije parametrov spremenijo funkcijo rezultata. To posledično spremeni količino energije (E), ki je pri določeni vrednosti vzorca (V) potrebna za doseganje določene vrednosti rezultata. Zato za doseganje rezultata ni dovolj, da v procesu uporabimo določeno ultrazvočno moč. Za določitev potrebne moči in konfiguracije parametrov, pri kateri je treba moč vnesti v obdelovani material, je potreben bolj izpopolnjen pristop. (Hielscher 2005)

Ultrazvočno podprta proizvodnja bioetanola

Znano je že, da ultrazvok izboljša proizvodnjo bioetanola. Priporočljivo je tekočino zgostiti z biomaso v zelo viskozno suspenzijo, ki jo je še vedno mogoče črpati. Ultrazvočni reaktorji lahko obdelujejo razmeroma visoke koncentracije trdnih snovi, tako da lahko sonikacijski proces poteka najučinkoviteje. Več materiala kot vsebuje suspenzija, manj nosilne tekočine, ki od sonikacijskega procesa nima koristi, se obdeluje. Ker vnos energije v tekočino po zakonu termodinamike povzroča njeno segrevanje, to pomeni, da se ultrazvočna energija v največji mogoči meri dovaja ciljnemu materialu. S takšno učinkovito zasnovo procesa se izognemo potratnemu segrevanju odvečne nosilne tekočine.
Ultrazvok pomaga pri ekstrakciji znotrajceličnega materiala in ga tako naredi dostopnega za encimsko fermentacijo. Blaga ultrazvočna obdelava lahko poveča encimsko aktivnost, za ekstrakcijo biomase pa je potreben intenzivnejši ultrazvok. Zato je treba encime dodati suspenziji biomase po sonikaciji, saj intenziven ultrazvok inaktivira encime, kar je nezaželen učinek.

Trenutni rezultati znanstvenih raziskav:

Študije Yoswathana et al. (2010) o proizvodnji bioetanola iz riževe slame so pokazale, da kombinacija kislinske predobdelave in ultrazvočne obdelave pred encimsko obdelavo privede do povečanega izkoristka sladkorja do 44% (na osnovi riževe slame). To kaže učinkovitost kombinacije fizikalne in kemijske predobdelave pred encimsko hidrolizo lignoceluloznega materiala v sladkor. 

Graf 2 grafično ponazarja pozitivne učinke ultrazvočnega obsevanja med proizvodnjo bioetanola iz riževe slame. (Za razstrupljanje predobdelanih vzorcev iz kislinske/ encimske predobdelave in ultrazvočne predobdelave je bilo uporabljeno lesno oglje.)

V drugi nedavni študiji so preučili vpliv ultrazvočne obdelave na zunajcelične in znotrajcelične ravni encima β-galaktozidaze. Sulaiman et al. (2011) so z uporabo ultrazvoka pri nadzorovani temperaturi, ki je spodbujal rast kvasovke Kluyveromyces marxianus (ATCC 46537), lahko bistveno izboljšali produktivnost proizvodnje bioetanola. Avtorji članka povzemajo, da je prekinjajoča se sonikacija z močnim ultrazvokom (20 kHz) pri delovnih ciklih ≤20% spodbujala proizvodnjo biomase, presnovo laktoze in proizvodnjo etanola pri K. marxianus pri razmeroma visoki intenzivnosti sonikacije 11,8Wcm². V najboljših pogojih je sonikacija povečala končno koncentracijo etanola za skoraj 3,5-krat v primerjavi s kontrolo. To je ustrezalo 3,5-kratnemu povečanju produktivnosti etanola, vendar je zahtevalo 952W dodatne vnesene moči na kubični meter fermentacijske brozge s sonikacijo. Ta dodatna potreba po energiji je bila nedvomno v okviru sprejemljivih obratovalnih norm za bioreaktorje, pri proizvodih visoke vrednosti pa bi jo bilo mogoče zlahka nadomestiti s povečano produktivnostjo.

Zaključek: koristi ultrazvočno podprte fermentacije

Ultrazvočna obdelava se je izkazala kot učinkovita in inovativna tehnika za povečanje izkoristka bioetanola. Ultrazvok se uporablja predvsem za ekstrakcijo znotrajceličnega materiala iz biomase, kot so koruza, soja, slama, lignocelulozni material ali rastlinski odpadni materiali.

• Povečanje izkoristka bioetanola
• Razgradnja/ uničenje celic in sproščanje znotrajceličnega materiala
• Izboljšana anaerobna razgradnja
• Aktivacija encimov z blago sonikacijo
• Izboljšanje učinkovitosti procesa s suspenzijami visoke koncentracije

Preprosto preskušanje, ponovljivo povečanje merila in preprosta namestitev (tudi v že obstoječih proizvodnih tokovih) omogočajo, da je ultrazvočna tehnologija dobičkonosna in učinkovita. Na voljo so zanesljivi industrijski ultrazvočni procesorji za komercialno obdelavo, ki omogočajo sonikacijo praktično neomejenih prostornin tekočin.