Բարձր թողունակության նմուշի պատրաստում միտոքոնդրիալ ախտորոշման համար
Հետազոտություններում և կլինիկաներում միտոքոնդրիալ ախտորոշումն իրականացվում է տարբեր մեթոդների կիրառմամբ, ինչպիսիք են հաջորդականությունը, ՊՇՌ-ն և կենսաքիմիական անալիզները: Այս մեթոդներն օգտագործվում են ԴՆԹ-ի մուտացիաները հայտնաբերելու և միտոքոնդրիումի ֆունկցիան չափելու համար: Հերթականությունը օգնում է հայտնաբերել գենետիկական մուտացիաները, մինչդեռ PCR-ն կարող է քանակականացնել հատուկ ԴՆԹ հաջորդականությունները: Կենսաքիմիական անալիզները գնահատում են միտոքոնդրիալ սպիտակուցների և ֆերմենտների ֆունկցիոնալությունը:
Միտոքոնդրիալ հիվանդությունների ախտորոշումը հատկապես դժվար է այս հիվանդությունների ընդգծված կլինիկական փոփոխականության, ինչպես նաև երկու տարբեր ժառանգական գենոմների՝ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի (mtDNA) և միջուկային գենոմի բարդ փոխազդեցության պատճառով:
ԴՆԹ-ի արդյունահանում և մասնատում, օգտագործելով Sonication
ԴՆԹ-ի արդյունահանումը մկանային հյուսվածքից հատկապես օգտակար է, երբ կասկածվում են մթԴՆԹ-ի հյուսվածքային փոփոխությունների մասին: Այս փոփոխությունները կարող են ներառել mtDNA-ի ջնջում քրոնիկ առաջադեմ արտաքին ակնաբուժության ժամանակ (CPEO), mtDNA-ի կետային մուտացիաները միտոքոնդրիալ միոպաթիաներում կամ mtDNA-ի սպառումը Ալպերսի համախտանիշի դեպքում: Մկանային հյուսվածքից արդյունահանված ԴՆԹ-ն այնուհետև կարող է օգտագործվել գենետիկական տարբեր թեստերի համար, ինչպիսիք են՝ Southern blot-ը և հեռահար ՊՇՌ-ն ջնջումների համար, իրական ժամանակի ՊՇՌ-ն սպառման համար կամ կետային մուտացիաների հաջորդականությունը:
Sonication-ը, օգտագործելով ինտենսիվ ուլտրաձայնային ալիքներ, կիրառվում է միտոքոնդրիալ ախտորոշման մի քանի կիրառման համար: Այն օգտագործվում է բջիջները լիզելու համար՝ ներբջջային բովանդակություն արդյունահանելու համար, ինչպիսիք են միտոքոնդրիան և ԴՆԹ-ն, կտրելու ԴՆԹ-ն, ինչպիսիք են mtDNA-ն և nDNA-ը՝ հաջորդականության համար, և նմուշները համասեռացնելու համար:
UIP400MTP Plate Sonicator բարձր թողունակության նմուշի պատրաստման համար միատեսակ ձայնագրում է նմուշները բազմաբնակարան և 96 ջրհոր ափսեներում
Ինչպես մեկուսացնել միտոքոնդրիան բջիջներից և հյուսվածքներից
Միտոքոնդրիալ մեկուսացումը ներառում է երկու կարևոր քայլ՝ խաթարել բջիջները՝ ազատելու իրենց պարունակությունը և կիրառել դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգացիա՝ միտոքոնդրիումային ֆրակցիաները առանձնացնելու և վերականգնելու համար:
sonication
Hielscher sonicators-ը համատեղելի է ստանդարտ լիզի բուֆերների և փաթեթների հետ՝ դրանք դարձնելով պիտանի միտոքոնդրիաների մեկուսացման համար: Sonication-ը ծառայում է երկու հիմնական նպատակի.
- Բջջային Լիզիս. Ուլտրաձայնային ալիքները խախտում են բջջային թաղանթները՝ ազատելով ներբջջային պարունակությունը։
- Միտոքոնդրիալ խանգարում. Հետագա քայլում հնչյունավորումը կարող է կոտրել միտոքոնդրիումները՝ միտոքոնդրիալ սպիտակուցներ կամ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի ազատման համար:
- mtDNA ֆրագմենտացիա. Sonication-ը միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի կտրման հուսալի մեթոդ է հաջորդականության համար:
UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքը թույլ է տալիս միտոքոնդրիալ նմուշների բարձր թողունակության նմուշի պատրաստում: Դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգացման հետ մեկտեղ, ձայնային ձայնագրումը բարձրացնում է միտոքոնդրիումային մեկուսացման արդյունավետությունը՝ ապահովելով անձեռնմխելի միտոքոնդրիումների բարձր բերքատվություն, որը հարմար է ներքևում գտնվող տարբեր ծրագրերի համար:
Hielscher UIP400MTP բազմաբնակարան ափսե sonicator աշխատում է ցանկացած ստանդարտ ափսեի հետ
UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնագրիչն առաջարկում է բազմաթիվ առավելություններ նմուշների բարձր թողունակության պատրաստման համար, օրինակ՝ միտոքոնդրիալ ախտորոշման համար:
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator բարձր թողունակությամբ նմուշի պատրաստման համար կենսամարկերների ախտորոշման մեջ:
Ուլտրաձայնային mtDNA ֆրագմենտացիայի օրինակելի ցուցումներ
Պատրաստում և արդյունահանում.
- C57BL/6 մկները սպանվել են արգանդի վզիկի տեղաշարժով:
- Լյարդներն արագ հանվեցին և լվացվեցին սառցե ստերիլ PBS-ով:
Միտոքոնդրիայի մեկուսացում.
- Միտոքոնդրիաները մեկուսացվել են՝ օգտագործելով 2-մլ Dounce հյուսվածքների մանրացնող սարք և հյուսվածքների համար միտոքոնդրիայի մեկուսացման հավաքածու:
- Սկզբնական ցենտրիֆուգում՝ 700×գ և 3000×գ:
- Կատարեք լվացման երկու լրացուցիչ քայլ բուֆեր C-ով:
ԴՆԹ-ի մեկուսացում.
- Առաջին ցենտրիֆուգումից 700×g գնդիկն օգտագործվել է միջուկային ԴՆԹ (nDNA) մեկուսացնելու համար:
- ԴՆԹ-ն մեկուսացվել է սպին սյուների միջոցով:
- Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ (mtDNA) արդյունահանվել է մեկուսացված միտոքոնդրիումներից:
- Միջուկային ԴՆԹ (nDNA) արդյունահանվել է անմշակ միջուկային քաղվածքներից, երկուսն էլ մկների լյարդի հյուսվածքից:
ԴՆԹ-ի մասնատում.
- ԴՆԹ-ն մասնատվել է սառույցի վրա՝ օգտագործելով 30-kHz/50-W ուլտրաձայնային UP50H 0,5 մմ միկրո-ծածկույթով sonotrode-ով 14 մկմ 2 × 30 վայրկյան տեւողությամբ:
Հատվածության պատկերացում և քանակականացում.
- Ուլտրաձայնացումից հետո մասնատումը տեսանելի է եղել 1% ագարոզայի գելի վրա՝ SYBR անվտանգ ԴՆԹ ներկով:
- mtDNA-ի և nDNA-ի հարաբերական առատությունը որոշվել է qPCR-ով:
(տես՝ Mariero et al., 2019)
Բարձր թողունակությամբ նմուշների պատրաստման համար UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնագրիչը հեշտացնում է մեծ քանակությամբ նմուշների պատրաստումը ստանդարտ 96 ջրհորների, բազմահորերի և միկրոտիտրային թիթեղներում:
Կարդացեք ավելին UIP400MTP-ի միջոցով նմուշի բարձր թողունակության պատրաստման առավելությունների մասին:
Խորհուրդներ օպտիմալ միտոքոնդրիայի մեկուսացման համար՝ օգտագործելով Sonication.
- Ջերմաստիճանի վերահսկում. Բոլոր քայլերը կատարեք 0°C-ից 4°C ջերմաստիճանի միջակայքում: Սա չափազանց կարևոր է միտոքոնդրիայի ամբողջականության և ֆունկցիոնալության պահպանման համար:
- Արդյունավետություն և արագություն. Աշխատեք արագ և մաքրեք միտոքոնդրիումները միայն այնքանով, որքանով պահանջվում է ձեր հատուկ կիրառման համար: Չափազանց մանիպուլյացիան կարող է հանգեցնել միտոքոնդրիումային բովանդակության զգալի կորստի:
- Կասեցումների նոսրացում. Պահպանեք բջիջների և օրգանելների կախույթների ցածր կոնցենտրացիաներ մեկուսացման ողջ ընթացքում: Սա օգնում է նվազագույնի հասցնել թակարդի և ագլյուտինացիայի ռիսկերը՝ դրանով իսկ բարելավելով մեկուսացված միտոքոնդրիումների մաքրությունը:
- Նմուշի ծավալը՝ Ընտրեք մի քանի փոքրածավալ պատրաստուկներ, այլ ոչ թե մեկ մեծ: Այս մոտեցումը սովորաբար ավելի լավ բերք է տալիս, քանի որ մասշտաբը համամասնորեն չի մեծացնում վերականգնվող միտոքոնդրիումների քանակը: UIP400MTP բազմաբնակարան ափսեի ձայնային սարքը հեշտացնում է բջիջների արագ և հուսալի լիզումը միտոքոնդրիայի մեկուսացման համար, ինչպես նաև սպիտակուցի արդյունահանումը միտոքոնդրիայից:
Այս ուղեցույցները ավելի արդյունավետ կդարձնեն մեկուսացման գործընթացը՝ օգտագործելով ուլտրաձայնային լիզի և ցենտրիֆուգացումը՝ ստանալով բարձրորակ միտոքոնդրիալ պատրաստուկներ, որոնք հարմար են ներքևի կիրառման համար:
Hielscher Sonicators – Որակյալ Արտադրված է Գերմանիայում
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են իրենց բարձր որակի և դիզայնի չափանիշներով: Հզորությունը և հեշտ շահագործումը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի սահուն ինտեգրումը արդյունաբերական օբյեկտներում: Կոպիտ պայմանները և պահանջկոտ միջավայրերը հեշտությամբ կառավարվում են Hielscher ուլտրաձայնային սարքերի կողմից:
Hielscher Ultrasonics-ը ISO սերտիֆիկացված ընկերություն է և հատուկ շեշտադրում է կատարում բարձր արդյունավետության ուլտրաձայնային սարքերի վրա, որոնք բնութագրվում են ժամանակակից տեխնոլոգիաներով և օգտագործողների համար հարմարավետությամբ: Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են ԵԽ-ին և համապատասխանում են UL, CSA և RoH-ների պահանջներին:
96 ջրհորանոց ափսեի ձայնային սարք UIP400MTP միկրոտիտրային և բազմաբնակարանային թիթեղների ձայնագրման համար
Գրականություն / Հղումներ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Հաճախակի տրվող հարցեր միտոքոնդրիայի և միտոքոնդրիալ ախտորոշման մասին
Որոնք են միտոքոնդրիաները:
Միտոքոնդրիաները թաղանթով կապված օրգանելներ են, որոնք հայտնաբերված են էուկարիոտիկ օրգանիզմների մեծ մասի բջիջներում: Նրանք հայտնի են որպես բջջի ուժային կենտրոններ, քանի որ նրանք էներգիա են արտադրում ադենոզին տրիֆոսֆատի (ATP) տեսքով բջջային շնչառության գործընթացի միջոցով: Բացի այդ, միտոքոնդրիաներն ունեն իրենց սեփական ԴՆԹ-ն և առանցքային դեր են խաղում այլ բջջային գործընթացներում, ներառյալ բջջային ցիկլի կարգավորումը և բջիջների մահը:
Ի՞նչն է տարբերում mtDNA-ն գենոմային ԴՆԹ-ից:
Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն (mtDNA) տարբերվում է գենոմային ԴՆԹ-ից (gDNA) մի քանի հիմնական առումներով: MtDNA-ն գտնվում է միտոքոնդրիայում, շրջանաձև է և ժառանգվում է մայրական կողմից, մինչդեռ gDNA-ն գտնվում է բջջի միջուկում, գծային է և ժառանգվում է երկու ծնողներից: MtDNA-ն շատ ավելի փոքր է, կոդավորում է ընդամենը 37 գեն, մինչդեռ gDNA-ն պարունակում է մոտ 20,000-25,000 գեն: MtDNA-ն առկա է յուրաքանչյուր բջջի մի քանի օրինակներով, ունի մուտացիայի ավելի բարձր արագություն և հիմնականում կոդավորում է միտոքոնդրիումի ֆունկցիայի մեջ ներգրավված սպիտակուցները: Ի հակադրություն, gDNA-ն, որպես կանոն, դիպլոիդ է, ունի մուտացիայի ավելի ցածր արագություն և կոդավորում է օրգանիզմի զարգացման և գործունեության համար անհրաժեշտ գեների հսկայական զանգված: Բացի այդ, mtDNA տրանսկրիպցիան և թարգմանությունը տեղի են ունենում միտոքոնդրիայում, մինչդեռ gDNA տրանսկրիպցիան տեղի է ունենում միջուկում, իսկ թարգմանությունը տեղի է ունենում ցիտոպլազմայում: Այս տարբերությունները արտացոլում են նրանց հստակ դերերը և էվոլյուցիոն ծագումը:
Ի՞նչ է առանց բջջային էքստրակտը:
Բջջազուրկ էքստրակտը լուծույթ է, որը պարունակում է լուծված բջիջների պարունակությունը, ներառյալ սպիտակուցները, նուկլեինաթթուները և բջջային այլ բաղադրիչները, բայց առանց անձեռնմխելի բջջային թաղանթների: Այս քաղվածքն օգտագործվում է կենսաքիմիական և մոլեկուլային կենսաբանության հետազոտության մեջ՝ ուսումնասիրելու բջջային գործընթացները in vitro՝ հնարավորություն տալով հետազոտողներին վերլուծել ռեակցիաները և մեխանիզմները կենդանի բջիջներից դուրս:
Ի՞նչ դեր խաղալ PCR թեստերը միտոքոնդրիալ ախտորոշման մեջ:
PCR թեստերը կարևոր դեր են խաղում միտոքոնդրիալ ախտորոշման մեջ՝ հնարավորություն տալով հայտնաբերել մուտացիաները, ջնջումները կամ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ում (mtDNA) կրկնօրինակների թվի տատանումները: Նրանք թույլ են տալիս ընդլայնել հատուկ mtDNA շրջանները՝ բացահայտելու պաթոգեն տարբերակները, որոնք կապված են միտոքոնդրիալ խանգարումների հետ: PCR-ի վրա հիմնված մեթոդները, ինչպիսիք են քանակական PCR (qPCR) և երկարաժամկետ PCR-ն, նույնպես օգտագործվում են mtDNA ամբողջականությունը, հետերոպլազմիայի մակարդակները և mtDNA-ի սպառումը գնահատելու համար՝ ապահովելով էական պատկերացումներ միտոքոնդրիալ ֆունկցիայի և հիվանդության վերաբերյալ:
Իմացեք, թե ինչպես է UIP400MTP Microplate Sonicator-ը հեշտացնում PCR թեստերն ու վերլուծությունները:
Ի՞նչ է դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգացումը:
Դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգացումը բջիջների մասնատման և միտոքոնդրիումային մեկուսացման լայնորեն կիրառվող տեխնիկա է: Այս մեթոդը բաժանում է բջջային կառուցվածքները՝ ելնելով դրանց նստվածքային գործակիցից, որը կախված է ինչպես խտությունից, այնպես էլ ձևից: Գործընթացը ներառում է կենտրոնախույս ուժի տարբեր մակարդակների կիրառում հատուկ խտություններով բուֆերացված աղի լուծույթներում նմուշների վրա: Նմանատիպ նստվածքային գործակից ունեցող կառույցները միաժամանակ կտեղավորվեն հավաքման խողովակի հատակին, ինչը թույլ կտա վերականգնել դրանք:
Ինչպե՞ս է օգտագործվում դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգացումը միտոքոնդրիայի մեկուսացման համար:
Դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգացիան թույլ է տալիս հետազոտողներին արդյունավետորեն առանձնացնել միտոքոնդրիալ ֆրակցիաները բջջային այլ բաղադրիչներից: Միտոքոնդրիումների մեկուսացումը ներառում է մի քանի ցենտրիֆուգացման քայլեր և մեկուսացման հետագա վերականգնում:
Սկզբնական ցենտրիֆուգացիա. Ցածր կենտրոնախույս ուժ կիրառեք խոշոր բջջային բեկորները և միջուկները նստեցնելու համար:
Հետագա ցենտրիֆուգացիաներ. Քայլ առ քայլ մեծացրեք կենտրոնախույս ուժը միտոքոնդրիումներով հարստացված գնդիկավոր ֆրակցիաներին: Ցենտրիֆուգացման յուրաքանչյուր քայլ հեռացնում է նստվածքի աստիճանաբար ավելի բարձր գործակից ունեցող կառույցները:
Կոտորակի վերականգնում. Յուրաքանչյուր ցենտրիֆուգումից հետո գնդիկը հավաքվում է, և վերին նյութը ենթարկվում է ավելի բարձր g- ուժերի՝ հաջորդ ֆրակցիան մեկուսացնելու համար: Սա կրկնվում է այնքան ժամանակ, մինչև հասնի միտոքոնդրիումների ցանկալի մաքրությունը: