Նմուշների բարձր թողունակությամբ նախապատրաստում միտոքոնդրիալ ախտորոշման համար
Հետազոտություններում և կլինիկական պրակտիկայում միտոքոնդրիալ ախտորոշումն իրականացվում է տարբեր մեթոդներով, ինչպիսիք են սեքվենավորումը, PCR-ը և կենսաքիմիական վերլուծությունները։ Այս մեթոդներն օգտագործվում են ԴՆԹ-ի մուտացիաները հայտնաբերելու և միտոքոնդրիալ գործառույթը չափելու համար։ Սեքվենավորումն օգնում է հայտնաբերել գենետիկական մուտացիաները, մինչդեռ PCR մեթոդը կարող է քանակապես որոշել ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականությունները։ Կենսաքիմիական վերլուծությունները գնահատում են միտոքոնդրիալ սպիտակուցների և ֆերմենտների ֆունկցիոնալությունը։
Միտոքոնդրիալ հիվանդությունների ախտորոշումը հատկապես դժվար է այդ հիվանդությունների արտահայտված կլինիկական փոփոխականության, ինչպես նաև ժառանգման տարբեր ձևեր ունեցող երկու գենոմների՝ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի (mtDNA) և կորիզային գենոմի միջև բարդ փոխազդեցության պատճառով։
ԴՆԹ-ի անջատում և ֆրագմենտացում ուլտրաձայնային մշակմամբ
Մկանային հյուսվածքից ԴՆԹ-ի անջատումը հատկապես օգտակար է, երբ կասկածվում են միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի՝ տվյալ հյուսվածքին բնորոշ փոփոխություններ։ Այդ փոփոխությունները կարող են ներառել միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի դելեցիաներ քրոնիկ առաջադիմող արտաքին օֆթալմոպլեգիայի (CPEO) դեպքում, միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի կետային մուտացիաներ միտոքոնդրիալ միոպաթիաների դեպքում կամ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի քանակի նվազում Ալպերսի համախտանիշի դեպքում։ Մկանային հյուսվածքից անջատված ԴՆԹ-ն այնուհետև կարող է օգտագործվել տարբեր գենետիկական հետազոտությունների համար, օրինակ՝ Սաութերն բլոթ և երկար հատվածների PCR՝ դելեցիաների համար, իրական ժամանակի PCR՝ քանակի նվազման համար, կամ սեքվենավորում՝ կետային մուտացիաների համար։
Ինտենսիվ ուլտրաձայնային ալիքներով մշակումն օգտագործվում է միտոքոնդրիալ ախտորոշման մի շարք կիրառություններում։ Այն օգտագործվում է բջիջները լիզիսի ենթարկելու համար՝ ներբջջային պարունակությունը, օրինակ՝ միտոքոնդրիաները և ԴՆԹ-ն անջատելու նպատակով, ԴՆԹ-ն, օրինակ՝ mtDNA և nDNA, սահքային ազդեցությամբ մասնատելու համար՝ սեքվենավորման նպատակով, ինչպես նաև նմուշները հոմոգենացնելու համար։
Նմուշների բարձր թողունակությամբ նախապատրաստման համար նախատեսված UIP400MTP պլանշետային ուլտրաձայնային սարքը բազմահոր և 96-հորանի պլանշետներում նմուշները հավասարաչափ ենթարկում է ուլտրաձայնային մշակման
Ինչպես մեկուսացնել միտոքոնդրիաները բջիջներից և հյուսվածքներից
Միտոքոնդրիաների մեկուսացումը ներառում է երկու էական փուլ՝ բջիջների քայքայում՝ դրանց պարունակությունն ազատելու համար, և դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգման կիրառում՝ միտոքոնդրիալ ֆրակցիաներն առանձնացնելու և ստանալու համար։
Ուլտրաձայնային մշակում
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համատեղելի են լիզիսի ստանդարտ բուֆերների և հավաքածուների հետ, ինչի շնորհիվ հարմար են միտոքոնդրիաների մեկուսացման համար։ Ուլտրաձայնային մշակումը ծառայում է երկու հիմնական նպատակի․
- Բջիջների լիզիս․ Ուլտրաձայնային ալիքները քայքայում են բջջաթաղանթները՝ ազատելով ներբջջային պարունակությունը։
- Միտոքոնդրիաների քայքայում․ Հաջորդ փուլում ուլտրաձայնային մշակումը կարող է քայքայել միտոքոնդրիաները՝ ազատելով միտոքոնդրիալ սպիտակուցները կամ միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն։
- Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի (mtDNA) ֆրագմենտացում․ Ուլտրաձայնային մշակումը հուսալի մեթոդ է միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն սահքային ազդեցությամբ մասնատելու համար՝ սեքվենավորման նպատակով։
UIP400MTP բազմահոր պլանշետների ուլտրաձայնային սարքը հնարավորություն է տալիս բարձր թողունակությամբ նախապատրաստել միտոքոնդրիալ նմուշները։ Դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգման հետ համատեղ ուլտրաձայնային մշակումը բարձրացնում է միտոքոնդրիաների մեկուսացման արդյունավետությունը՝ ապահովելով տարբեր հետագա կիրառությունների համար պիտանի, անվնաս միտոքոնդրիաների բարձր ելք։
Hielscher UIP400MTP բազմահոր պլանշետների ուլտրաձայնային սարքն աշխատում է ցանկացած ստանդարտ պլանշետի հետ
UIP400MTP բազմահոր պլանշետների ուլտրաձայնային սարքը բազմաթիվ առավելություններ է առաջարկում նմուշների բարձր թողունակությամբ նախապատրաստման համար, օրինակ՝ միտոքոնդրիալ ախտորոշման մեջ։
UIP400MTP բազմահոր պլանշետների ուլտրաձայնային սարք՝ կենսամարկերային ախտորոշման մեջ նմուշների բարձր թողունակությամբ նախապատրաստման համար։
Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի (mtDNA) ուլտրաձայնային ֆրագմենտացման օրինակային հրահանգներ
Նախապատրաստում և անջատում․
- C57BL/6 մկներին սպանել են պարանոցային դիսլոկացիայի միջոցով։
- Լյարդերն արագ հեռացրել են և լվացել սառցասառը ստերիլ PBS լուծույթով։
Միտոքոնդրիաների մեկուսացում․
- Միտոքոնդրիաները մեկուսացրել են՝ օգտագործելով 2-mL Dounce հյուսվածքային մանրացուցիչ և հյուսվածքից միտոքոնդրիաների մեկուսացման հավաքածու։
- Սկզբնական ցենտրիֆուգում՝ 700× g և 3 000× g պայմաններում։
- Կատարեք լվացման երկու լրացուցիչ փուլ՝ C բուֆերով։
ԴՆԹ-ի մեկուսացում․
- 700× g պայմաններում առաջին ցենտրիֆուգումից ստացված նստվածքն օգտագործվել է կորիզային ԴՆԹ-ի (nDNA) մեկուսացման համար։
- ԴՆԹ-ն մեկուսացրել են ցենտրիֆուգային սյունակներով։
- Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն (mtDNA) անջատել են մեկուսացված միտոքոնդրիաներից։
- Կորիզային ԴՆԹ-ն (nDNA) անջատել են չմաքրված կորիզային էքստրակտներից․ երկու դեպքում էլ սկզբնաղբյուրը մկան լյարդի հյուսվածքն էր։
ԴՆԹ-ի ֆրագմենտացում․
- ԴՆԹ-ն ֆրագմենտացրել են սառույցի վրա՝ օգտագործելով 30-kHz/50-W UP50H ուլտրաձայնային սարք՝ 0,5-mm միկրոծայրով սոնոտրոդով, 14 μm պայմաններում՝ 2 × 30 վայրկյան տևողությամբ։
Ֆրագմենտացման տեսանելիացում և քանակական որոշում․
- Ուլտրաձայնային մշակումից հետո ֆրագմենտավորումը տեսանելի դարձվեց 1% ագարոզային գելի վրա՝ ԴՆԹ-ի SYBR safe ներկանյութով։
- mtDNA և nDNA հարաբերական քանակությունները որոշվեցին qPCR մեթոդով։
(cf. Mariero et al., 2019)
Նմուշների մեծաքանակ նախապատրաստման համար բազմահոր պլանշետների UIP400MTP ուլտրաձայնային սարքը հեշտացնում է մեծ թվով նմուշների նախապատրաստումը ստանդարտ 96-հորանի, բազմահոր և միկրոտիտրային պլանշետներում։
Կարդացեք ավելին UIP400MTP սարքի միջոցով նմուշների մեծաքանակ նախապատրաստման առավելությունների մասին։
Ուլտրաձայնային մշակման միջոցով միտոքոնդրիումների օպտիմալ առանձնացման խորհուրդներ.
- Ջերմաստիճանի վերահսկում. Բոլոր քայլերը կատարեք 0°C-ից 4°C ջերմաստիճանային միջակայքում։ Սա վճռորոշ նշանակություն ունի միտոքոնդրիումների ամբողջականությունն ու գործառութային ակտիվությունը պահպանելու համար։
- Արդյունավետություն և արագություն. Աշխատեք արագ և միտոքոնդրիումները մաքրեք միայն այնքան, որքան պահանջվում է ձեր կոնկրետ կիրառության համար։ Չափից ավելի մանիպուլյացիաները կարող են հանգեցնել միտոքոնդրիալ պարունակության զգալի կորուստների։
- Կախույթների նոսրացում. Առանձնացման ողջ գործընթացի ընթացքում պահպանեք բջիջների և օրգանելների կախույթների ցածր կոնցենտրացիաներ։ Սա օգնում է նվազագույնի հասցնել թակարդման և ագլյուտինացիայի ռիսկերը՝ դրանով բարելավելով առանձնացված միտոքոնդրիումների մաքրությունը։
- Նմուշի ծավալ. Մեկ մեծածավալ պատրաստուկի փոխարեն նախընտրեք մի քանի փոքրածավալ պատրաստուկներ։ Այս մոտեցումը սովորաբար ապահովում է ավելի բարձր ելք, քանի որ մշակման մասշտաբը մեծացնելիս վերականգնվող միտոքոնդրիումների քանակը համամասնորեն չի ավելանում։ Բազմահոր պլանշետների UIP400MTP ուլտրաձայնային սարքը հեշտացնում է բջջի արագ և հուսալի լիզիսը՝ միտոքոնդրիումների առանձնացման համար, ինչպես նաև միտոքոնդրիումներից սպիտակուցների էքստրակցիան։
Այս ուղեցույցները ուլտրաձայնային լիզիսի և ցենտրիֆուգման միջոցով առանձնացման գործընթացը կդարձնեն ավելի արդյունավետ՝ ապահովելով հետագա կիրառությունների համար պիտանի բարձրորակ միտոքոնդրիալ պատրաստուկներ։
Hielscher ուլտրաձայնային սարքեր – Գերմանիայում արտադրված որակ
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հայտնի են իրենց որակի և նախագծման ամենաբարձր չափանիշներով։ Ամրությունն ու շահագործման դյուրինությունը թույլ են տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերը սահուն ինտեգրել արդյունաբերական օբյեկտներում։ Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը հեշտությամբ աշխատում են ծանր պայմաններում և բարձր պահանջներ ներկայացնող միջավայրերում։
Hielscher Ultrasonics ընկերությունն ունի ISO հավաստագրում և հատուկ ուշադրություն է դարձնում բարձր արտադրողականությամբ ուլտրաձայնային սարքերին, որոնք առանձնանում են ամենաարդիական տեխնոլոգիայով և օգտագործման հարմարավետությամբ։ Իհարկե, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը համապատասխանում են CE նորմերին և բավարարում են UL, CSA և RoHs պահանջները։
96-հորանի պլանշետների UIP400MTP ուլտրաձայնային սարք՝ միկրոտիտրային և բազմահոր պլանշետների ուլտրաձայնային մշակման համար
Գրականություն / Հղումներ
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator — Non-Contact Sonicator — Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Հաճախ տրվող հարցեր միտոքոնդրիումների և միտոքոնդրիալ ախտորոշման մասին
Ի՞նչ են միտոքոնդրիումները։
Միտոքոնդրիումները թաղանթով պարփակված օրգանելներ են, որոնք առկա են էուկարիոտ օրգանիզմների մեծ մասի բջիջներում։ Դրանք հայտնի են որպես բջջի էներգետիկ կայաններ, քանի որ բջջային շնչառության գործընթացում էներգիա են արտադրում ադենոզինեռֆոսֆատի (ATP) տեսքով։ Բացի այդ, միտոքոնդրիումներն ունեն սեփական ԴՆԹ և առանցքային դեր են խաղում բջջային այլ գործընթացներում, ներառյալ բջջային ցիկլի և բջջային մահվան կարգավորումը։
Ինչո՞վ է mtDNA տարբերվում գենոմային ԴՆԹ-ից։
Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն (mtDNA) գենոմային ԴՆԹ-ից (gDNA) տարբերվում է մի քանի առանցքային հատկանիշներով։ Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն գտնվում է միտոքոնդրիումներում, օղակաձև է և ժառանգվում է մայրական գծով, մինչդեռ գենոմային ԴՆԹ-ն գտնվում է բջջի կորիզում, գծային է և ժառանգվում է երկու ծնողներից։ Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն շատ ավելի փոքր է՝ կոդավորելով ընդամենը 37 գեն, մինչդեռ գենոմային ԴՆԹ-ն պարունակում է մոտ 20 000–25 000 գեն։ Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն յուրաքանչյուր բջջում առկա է բազմաթիվ պատճեններով, ունի մուտացիաների ավելի բարձր հաճախականություն և հիմնականում կոդավորում է միտոքոնդրիալ գործառույթին մասնակցող սպիտակուցներ։ Ի տարբերություն դրա՝ գենոմային ԴՆԹ-ն սովորաբար դիպլոիդ է, ունի մուտացիաների ավելի ցածր հաճախականություն և կոդավորում է օրգանիզմի զարգացման ու գործունեության համար անհրաժեշտ գեների լայն բազմազանություն։ Բացի այդ, միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի տրանսկրիպցիան և տրանսլյացիան տեղի են ունենում միտոքոնդրիումների ներսում, մինչդեռ գենոմային ԴՆԹ-ի տրանսկրիպցիան տեղի է ունենում կորիզում, իսկ տրանսլյացիան՝ ցիտոպլազմայում։ Այս տարբերություններն արտացոլում են դրանց տարբեր դերերն ու էվոլյուցիոն ծագումը։
Ի՞նչ է անբջիջ էքստրակտը։
Անբջիջ էքստրակտը լուծույթ է, որը պարունակում է լիզիսի ենթարկված բջիջների պարունակությունը՝ ներառյալ սպիտակուցները, նուկլեինաթթուները և բջջային այլ բաղադրիչները, սակայն չի պարունակում ամբողջական բջջաթաղանթներ։ Այս էքստրակտն օգտագործվում է կենսաքիմիական և մոլեկուլային կենսաբանության հետազոտություններում՝ փորձանոթային պայմաններում բջջային գործընթացներն ուսումնասիրելու համար՝ հնարավորություն տալով հետազոտողներին վերլուծել ռեակցիաներն ու մեխանիզմները կենդանի բջիջներից դուրս։
Ի՞նչ դեր ունեն PCR թեստերը միտոքոնդրիալ ախտորոշման մեջ։
PCR թեստերը վճռորոշ դեր ունեն միտոքոնդրիալ ախտորոշման մեջ՝ հնարավորություն տալով հայտնաբերել միտոքոնդրիալ DNA-ի (mtDNA) մուտացիաները, դելեցիաները կամ պատճենների թվի տատանումները։ Դրանք թույլ են տալիս ամպլիֆիկացնել mtDNA-ի որոշակի հատվածներ՝ միտոքոնդրիալ խանգարումների հետ կապված ախտածին տարբերակները հայտնաբերելու համար։ PCR-ի վրա հիմնված մեթոդները, ինչպիսիք են քանակական PCR-ը (qPCR) և երկար հատվածների PCR-ը, կիրառվում են նաև mtDNA-ի ամբողջականությունը, հետերոպլազմիայի մակարդակները և mtDNA-ի քանակի նվազումը գնահատելու համար՝ տրամադրելով էական տեղեկություններ միտոքոնդրիալ գործառույթի և հիվանդության մասին։
Իմացեք, թե ինչպես է UIP400MTP միկրոպլանշետների ուլտրաձայնային մշակման սարքը հեշտացնում PCR թեստերն ու անալիզները։
Ի՞նչ է դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգումը։
Դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգումը լայնորեն կիրառվող մեթոդ է բջիջների ֆրակցիոնացման և միտոքոնդրիումների առանձնացման համար։ Այս մեթոդը բջջային կառուցվածքները բաժանում է ըստ դրանց նստեցման գործակցի, որը կախված է և՛ խտությունից, և՛ ձևից։ Գործընթացը ներառում է որոշակի խտությամբ բուֆերացված աղային լուծույթներում գտնվող նմուշների վրա տարբեր մեծության կենտրոնախույս ուժերի կիրառում։ Նստեցման նմանատիպ գործակիցներ ունեցող կառուցվածքները միաժամանակ կնստեն հավաքման փորձանոթի հատակին՝ հնարավորություն տալով հավաքել դրանք։
Ինչպե՞ս է դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգումն օգտագործվում միտոքոնդրիումների առանձնացման համար։
Դիֆերենցիալ ցենտրիֆուգումը հետազոտողներին թույլ է տալիս արդյունավետորեն առանձնացնել միտոքոնդրիալ ֆրակցիաները բջջային այլ բաղադրիչներից։ Միտոքոնդրիումների առանձնացումը ներառում է ցենտրիֆուգման մի քանի փուլ և առանձնացված նյութի հետագա հավաքում։
Սկզբնական ցենտրիֆուգում. Կիրառեք փոքր կենտրոնախույս ուժ՝ բջջային խոշոր բեկորներն ու կորիզները նստեցնելու համար։
Հետագա ցենտրիֆուգումներ. Աստիճանաբար մեծացրեք կենտրոնախույս ուժը՝ միտոքոնդրիումներով հարստացված ֆրակցիաները նստեցնելու համար։ Ցենտրիֆուգման յուրաքանչյուր փուլ հեռացնում է աստիճանաբար ավելի բարձր նստեցման գործակիցներ ունեցող կառուցվածքները։
Ֆրակցիայի հավաքում. Յուրաքանչյուր ցենտրիֆուգումից հետո նստվածքը հավաքում են, իսկ վերնստվածքային հեղուկը ենթարկում են ավելի մեծ g-ուժերի ազդեցության՝ հաջորդ ֆրակցիան առանձնացնելու համար։ Սա կրկնվում է մինչև միտոքոնդրիումների ցանկալի մաքրության աստիճանին հասնելը։