הכנת דגימות בתפוקה גבוהה לאבחון מיטוכונדריאלי
אבחון מיטוכונדריאלי במחקר ובמסגרות קליניות מתבצע באמצעות טכניקות שונות כגון ריצוף, PCR ובדיקות ביוכימיות. שיטות אלה משמשות לזיהוי מוטציות ב-DNA ולמדידת התפקוד המיטוכונדריאלי. ריצוף מסייע בזיהוי מוטציות גנטיות, ואילו PCR מאפשר לכמת רצפי DNA מסוימים. בדיקות ביוכימיות מעריכות את תפקודם של חלבונים ואנזימים מיטוכונדריאליים.
אבחון מחלות מיטוכונדריאליות קשה במיוחד בשל השונות הקלינית הניכרת של מחלות אלה, וכן בשל יחסי הגומלין המורכבים בין שני גנומים העוברים בתורשה בדרכים שונות: DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) והגנום הגרעיני.
מיצוי וקיטוע DNA באמצעות סוניקציה
מיצוי DNA מרקמת שריר שימושי במיוחד כאשר קיים חשד לשינויים ב-mtDNA הייחודיים לרקמה. שינויים אלה עשויים לכלול חסרים ב-mtDNA באופתלמופלגיה חיצונית מתקדמת כרונית (CPEO), מוטציות נקודתיות ב-mtDNA במיופתיות מיטוכונדריאליות, או דלדול mtDNA בתסמונת אלפרס. לאחר מכן ניתן להשתמש ב-DNA שמוצה מרקמת השריר לבדיקות גנטיות שונות, כגון תספיג סאת'רן ו-PCR לטווח ארוך לזיהוי חסרים, PCR בזמן אמת לזיהוי דלדול, או ריצוף לזיהוי מוטציות נקודתיות.
סוניקציה, המשתמשת בגלי אולטרסאונד עזים, משמשת למספר יישומים באבחון מיטוכונדריאלי. היא משמשת לפירוק תאים לשם מיצוי תוכן תוך-תאי כגון מיטוכונדריה ו-DNA, לגזירת DNA כגון mtDNA ו-nDNA לצורך ריצוף, ולהומוגניזציה של דגימות.
מכשיר הסוניקציה לצלחות UIP400MTP להכנת דגימות בתפוקה גבוהה מבצע סוניקציה אחידה של דגימות בצלחות מרובות באריות ובצלחות בעלות 96 באריות
כיצד לבודד מיטוכונדריה מתאים ומרקמות
בידוד מיטוכונדריה כולל שני שלבים חיוניים: פירוק תאים לשחרור תכולתם, ושימוש בצנטריפוגציה דיפרנציאלית להפרדה ולאיסוף של מקטעים מיטוכונדריאליים.
סוניקציה
מכשירי הסוניקציה של Hielscher תואמים לתמיסות בופר ולערכות סטנדרטיות לפירוק תאים, ולכן מתאימים לבידוד מיטוכונדריה. סוניקציה משרתת שתי מטרות עיקריות:
- פירוק תאים: גלי האולטרסאונד מפרקים את קרומי התאים ומשחררים תוכן תוך-תאי.
- פירוק מיטוכונדריה: סוניקציה בשלב עוקב יכולה לפרק את המיטוכונדריה ולשחרר חלבונים מיטוכונדריאליים או DNA מיטוכונדריאלי.
- קיטוע mtDNA: סוניקציה היא טכניקה אמינה לגזירת DNA מיטוכונדריאלי לצורך ריצוף.
מכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות UIP400MTP מאפשר הכנת דגימות מיטוכונדריאליות בתפוקה גבוהה. בשילוב עם צנטריפוגציה דיפרנציאלית, סוניקציה משפרת את יעילות בידוד המיטוכונדריה ומבטיחה תפוקות גבוהות של מיטוכונדריה שלמות המתאימות ליישומי המשך שונים.
מכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות Hielscher UIP400MTP פועל עם כל צלחת סטנדרטית
מכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות UIP400MTP מציע יתרונות רבים להכנת דגימות בתפוקה גבוהה, למשל באבחון מיטוכונדריאלי.
מכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות UIP400MTP להכנת דגימות בתפוקה גבוהה באבחון באמצעות סמנים ביולוגיים.
הוראות לדוגמה לקיטוע אולטרסוני של mtDNA
הכנה ומיצוי:
- עכברי C57BL/6 הומתו באמצעות פריקת חוליות הצוואר.
- הכבדים הוצאו במהירות ונשטפו ב-PBS סטרילי קר כקרח.
בידוד מיטוכונדריה:
- המיטוכונדריה בודדו באמצעות מטחנת רקמות מסוג Dounce בנפח 2-mL וערכה לבידוד מיטוכונדריה מרקמה.
- צנטריפוגציה ראשונית ב-700× g וב-3,000× g.
- בצעו שני שלבי שטיפה נוספים עם בופר C.
בידוד DNA:
- המשקע מהצנטריפוגציה הראשונה ב-700× g שימש לבידוד DNA גרעיני (nDNA).
- ה-DNA בודד באמצעות עמודות צנטריפוגה.
- DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) מוצה ממיטוכונדריה מבודדות.
- DNA גרעיני (nDNA) מוצה מתמציות גרעיניות גולמיות, ושני סוגי ה-DNA הופקו מרקמת כבד של עכבר.
קיטוע DNA:
- ה-DNA קוטע על קרח באמצעות מכשיר סוניקציה אולטרסוני UP50H בעל מפרט 30-kHz/50-W, עם סונוטרודה בעלת קצה זעיר של 0.5-mm, ב-14 μm למשך 2 × 30 שניות.
הדמיה וכימות של הקיטוע:
- הפרגמנטציה לאחר הטיפול באולטרסאונד הודגמה על ג׳ל אגרוז בריכוז 1% באמצעות צבע DNA מסוג SYBR safe.
- השכיחות היחסית של mtDNA ושל nDNA נקבעה באמצעות qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
להכנת דגימות בתפוקה גבוהה, מכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות UIP400MTP מאפשר הכנה של מספר רב של דגימות בצלחות סטנדרטיות בעלות 96 באריות, בצלחות מרובות באריות ובצלחות מיקרוטיטר.
קראו עוד על היתרונות של הכנת דגימות בתפוקה גבוהה באמצעות UIP400MTP!
טיפים לבידוד מיטוכונדריה מיטבי באמצעות סוניקציה:
- בקרת טמפרטורה: בצעו את כל השלבים בטווח טמפרטורות של 0°C עד 4°C. הדבר חיוני לשמירה על השלמות והתפקוד של המיטוכונדריה.
- יעילות ומהירות: עבדו במהירות וטהרו את המיטוכונדריה רק במידה הנדרשת ליישום הספציפי שלכם. טיפול מופרז עלול להוביל לאובדן משמעותי של תכולה מיטוכונדריאלית.
- דילול תרחיפים: שמרו על ריכוזים נמוכים של תרחיפי תאים ואברונים לאורך כל תהליך הבידוד. הדבר מסייע למזער את הסיכונים ללכידה ולאגלוטינציה, ובכך משפר את טוהר המיטוכונדריה המבודדות.
- נפח הדגימה: העדיפו כמה הכנות בהיקף קטן על פני הכנה אחת בהיקף גדול. גישה זו מניבה בדרך כלל תפוקות טובות יותר, שכן הגדלת היקף ההכנה אינה מגדילה באופן יחסי את כמות המיטוכונדריה שניתן להפיק. מכשיר הסוניקציה לצלחות מרובות באריות UIP400MTP מאפשר ליזיס מהיר ואמין של תאים לצורך בידוד מיטוכונדריה, וכן מיצוי חלבונים ממיטוכונדריה.
הנחיות אלה ייעלו את תהליך הבידוד באמצעות ליזיס אולטרסוני וצנטריפוגציה, ויניבו תכשירים מיטוכונדריאליים באיכות גבוהה המתאימים ליישומי המשך.
מכשירי הסוניקציה של Hielscher – איכות תוצרת גרמניה
מכשירי האולטרסאונד של Hielscher ידועים בסטנדרטים הגבוהים ביותר של איכות ותכנון. עמידות ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של מכשירי האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. מכשירי האולטרסאונד של Hielscher מתמודדים בקלות עם תנאים קשים וסביבות תובעניות.
Hielscher Ultrasonics היא חברה בעלת הסמכת ISO, והיא שמה דגש מיוחד על מכשירי אולטרסאונד בעלי ביצועים גבוהים, המשלבים טכנולוגיה מתקדמת ביותר וידידותיות למשתמש. כמובן, מכשירי האולטרסאונד של Hielscher עומדים בדרישות CE ובדרישות UL, CSA ו-RoHs.
מכשיר הסוניקציה לצלחות בעלות 96 באריות UIP400MTP לסוניקציה של צלחות מיקרוטיטר וצלחות מרובות באריות
ספרות / מקורות
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
שאלות נפוצות על מיטוכונדריה ואבחון מיטוכונדריאלי
מהן מיטוכונדריה?
מיטוכונדריה הן אברונים מוקפי ממברנה המצויים בתאים של רוב האורגניזמים האאוקריוטיים. הן מוכרות כתחנות הכוח של התא משום שהן מייצרות אנרגיה בצורת אדנוזין טריפוספט (ATP) בתהליך הנשימה התאית. נוסף על כך, למיטוכונדריה יש DNA משלהן, והן ממלאות תפקידי מפתח בתהליכים תאיים אחרים, לרבות ויסות מחזור התא ומוות תאי.
מה מבדיל בין mtDNA ל-DNA גנומי?
DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) שונה מ-DNA גנומי (gDNA) בכמה היבטים מרכזיים. MtDNA נמצא במיטוכונדריה, הוא מעגלי ועובר בתורשה מהאם, ואילו gDNA נמצא בגרעין התא, הוא קווי ועובר בתורשה משני ההורים. MtDNA קטן בהרבה ומקודד רק 37 גנים, בעוד ש-gDNA מכיל כ-20,000–25,000 גנים. MtDNA קיים במספר עותקים בכל תא, שיעור המוטציות שלו גבוה יותר, והוא מקודד בעיקר לחלבונים המעורבים בתפקוד המיטוכונדריה. לעומת זאת, gDNA הוא בדרך כלל דיפלואידי, שיעור המוטציות שלו נמוך יותר, והוא מקודד למגוון עצום של גנים הנחוצים להתפתחות האורגניזם ולתפקודו. נוסף על כך, השעתוק והתרגום של mtDNA מתרחשים בתוך המיטוכונדריה, בעוד שהשעתוק של gDNA מתרחש בגרעין והתרגום מתרחש בציטופלזמה. הבדלים אלה משקפים את תפקידיהם הנבדלים ואת מקורותיהם האבולוציוניים.
מהו מיצוי נטול תאים?
תמצית נטולת תאים היא תמיסה המכילה את תכולתם של תאים שעברו ליזיס, לרבות חלבונים, חומצות גרעין ורכיבים תאיים אחרים, אך ללא קרומי תאים שלמים. תמצית זו משמשת במחקר ביוכימי ובמחקר בביולוגיה מולקולרית לחקר תהליכים תאיים בתנאי מבחנה, ומאפשרת לחוקרים לנתח תגובות ומנגנונים מחוץ לתאים חיים.
מה תפקידן של בדיקות PCR באבחון מיטוכונדריאלי?
בדיקות PCR ממלאות תפקיד מכריע באבחון מיטוכונדריאלי בכך שהן מאפשרות לזהות מוטציות, חסרים או שינויים במספר העותקים של DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA). הן מאפשרות להגביר אזורים מסוימים של mtDNA כדי לזהות וריאנטים פתוגניים הקשורים להפרעות מיטוכונדריאליות. טכניקות המבוססות על PCR, כגון PCR כמותי (qPCR) ו-PCR לטווח ארוך, משמשות גם להערכת שלמות ה-mtDNA, רמות ההטרופלזמיה ודלדול ה-mtDNA, ומספקות תובנות חיוניות על תפקוד המיטוכונדריה ועל מחלות מיטוכונדריאליות.
גלו כיצד מכשיר הסוניקציה למיקרופלטות UIP400MTP מקל על ביצוע בדיקות ותבחיני PCR!
מהי צנטריפוגה דיפרנציאלית?
צנטריפוגה דיפרנציאלית היא טכניקה נפוצה להפרדת תאים לפרקציות ולבידוד מיטוכונדריה. שיטה זו מפרידה מבנים תאיים על סמך מקדם השקיעה שלהם, התלוי הן בצפיפות והן בצורה. התהליך כולל הפעלת רמות שונות של כוח צנטריפוגלי על דגימות בתמיסות מלח מבופרות בעלות צפיפויות מוגדרות. מבנים בעלי מקדמי שקיעה דומים ישקעו בתחתית מבחנת האיסוף באותו זמן, וכך יתאפשר לאסוף אותם.
כיצד משמשת צנטריפוגה דיפרנציאלית לבידוד מיטוכונדריה?
צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשרת לחוקרים להפריד ביעילות פרקציות מיטוכונדריאליות מרכיבים תאיים אחרים. בידוד מיטוכונדריה כולל מספר שלבי צנטריפוגה ולאחריהם איסוף החומר שבודד.
צנטריפוגה ראשונית: הפעילו כוח צנטריפוגלי נמוך כדי לשקע שברי תאים גדולים וגרעיני תאים.
שלבי הצנטריפוגה הבאים: הגדילו את הכוח הצנטריפוגלי בהדרגה כדי לשקע פרקציות מועשרות במיטוכונדריה. כל שלב צנטריפוגה מסלק מבנים בעלי מקדמי שקיעה גבוהים יותר בהדרגה.
איסוף הפרקציות: לאחר כל צנטריפוגה אוספים את המשקע, ואת הנוזל העליון חושפים לכוחות g גבוהים יותר כדי לבודד את הפרקציה הבאה. חוזרים על התהליך עד להשגת דרגת הטוהר הרצויה של המיטוכונדריה.