הכנת דגימות בתפוקה גבוהה לאבחון מיטוכונדריאלי
אבחון מיטוכונדריאלי במחקר ובמרפאות מתבצע באמצעות טכניקות שונות כגון ריצוף, PCR ובדיקות ביוכימיות. שיטות אלה משמשות לזיהוי מוטציות DNA ולמדידת תפקוד המיטוכונדריה. ריצוף מסייע לזהות מוטציות גנטיות, בעוד PCR יכול לכמת רצפי DNA ספציפיים. בדיקות ביוכימיות מעריכות את הפונקציונליות של חלבונים ואנזימים מיטוכונדריאליים.
האבחון של מחלות מיטוכונדריאליות קשה במיוחד בשל השונות הקלינית הבולטת של מחלות אלה, כמו גם בשל האינטראקציה המורכבת בין שני גנומים תורשתיים שונים: DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) והגנום הגרעיני.
מיצוי ופיצול DNA באמצעות סוניקציה
מיצוי DNA מרקמת שריר שימושי במיוחד כאשר יש חשד לשינויים ספציפיים לרקמות ב- mtDNA. שינויים אלה עשויים לכלול מחיקות של mtDNA באופטלמופלגיה חיצונית מתקדמת כרונית (CPEO), מוטציות נקודתיות של mtDNA במיופתיים מיטוכונדריאליים, או דלדול של mtDNA בתסמונת אלפרס. הדנ"א המופק מרקמת השריר יכול לשמש לבדיקות גנטיות שונות, כגון כתם דרומי ו-PCR ארוך טווח למחיקות, PCR בזמן אמת לדלדול, או ריצוף למוטציות נקודתיות.
סוניקציה, באמצעות גלי אולטרסאונד אינטנסיביים, מיושמת עבור מספר יישומים באבחון מיטוכונדריאלי. הוא משמש לליזה של תאים כדי לחלץ תוכן תוך תאי כגון מיטוכונדריה ו- DNA, כדי לגזור DNA כגון mtDNA ו- nDNA לריצוף, וכדי הומוגניזציה של דגימות.
UIP400MTP Plate Sonicator להכנת דגימות בתפוקה גבוהה באופן אחיד סוניק דגימות בלוחות מרובי בארות ולוחות 96 בארות
כיצד לבודד מיטוכונדריה מתאים ורקמות
בידוד מיטוכונדריאלי כולל שני שלבים חיוניים: שיבוש התאים לשחרר את תכולתם, ושימוש בצנטריפוגה דיפרנציאלית כדי להפריד ולשחזר שברים מיטוכונדריאליים.
סוניקציה
הסוניקטורים של Hielscher תואמים למאגרי ליזיס סטנדרטיים וערכות, מה שהופך אותם מתאימים לבידוד מיטוכונדריה. סוניקציה משרתת שתי מטרות עיקריות:
- ליזה סלולרית: הגלים העל-קוליים משבשים את קרום התא, ומשחררים תוכן תוך-תאי.
- הפרעה במיטוכונדריה: סוניקציה בשלב הבא יכולה לפתוח את המיטוכונדריה כדי לשחרר חלבונים מיטוכונדריאליים או DNA מיטוכונדריאלי.
- פיצול mtDNA: סוניקציה היא טכניקה אמינה לגזירת DNA מיטוכונדריאלי לצורך ריצוף.
UIP400MTP הסוניקטור מרובה הבארות מאפשר הכנת דגימות בתפוקה גבוהה של דגימות מיטוכונדריאליות. בשילוב עם צנטריפוגה דיפרנציאלית, סוניקציה משפרת את יעילות בידוד המיטוכונדריה, ומבטיחה תפוקות גבוהות של מיטוכונדריה שלמים המתאימים ליישומים שונים במורד הזרם.
Hielscher UIP400MTP sonicator צלחת multiwell עובד עם כל צלחת סטנדרטית
UIP400MTP הסוניקטור מרובה הבארות מציע יתרונות רבים להכנת דגימות בתפוקה גבוהה, למשל באבחון מיטוכונדריאלי.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator להכנת דגימות בתפוקה גבוהה באבחון סמנים ביולוגיים.
הוראות לדוגמה לפיצול mtDNA על-קולי
הכנה וחילוץ:
- עכברי C57BL/6 נהרגו כתוצאה מנקע צוואר הרחם.
- הכבדים חולצו במהירות ונשטפו ב-PBS סטרילי קר כקרח.
בידוד מיטוכונדריה:
- המיטוכונדריה בודדו באמצעות מטחנת רקמות Dounce בנפח 2 מ"ל וערכת בידוד מיטוכונדריה לרקמות.
- צנטריפוגה התחלתית ב-700× גרם ו-3,000× גרם.
- בצעו שני שלבי כביסה נוספים עם חיץ C.
בידוד DNA:
- הגלולה מהצנטריפוגה הראשונה במשקל 700× גרם שימשה לבידוד DNA גרעיני (nDNA).
- הדנ"א בודד באמצעות עמודות ספין.
- דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) הופק ממיטוכונדריה מבודדת.
- דנ"א גרעיני (nDNA) הופק מתמציות גרעיניות גולמיות, שתיהן מרקמת כבד עכברים.
פיצול DNA:
- הדנ"א שובר על קרח באמצעות סוניק על-קולי UP50H בהספק 30 קילו-הרץ/50 ואט עם סונוטרודה מיקרו-קצה בקוטר 0.5 מ"מ בעוצמה של 14 מיקרומטר למשך 2 ×-30 שניות.
הדמיית פיצול וכימות:
- פיצול לאחר אולטרה-סאונד הודגם על ג'ל אגרוז 1% עם צבע DNA בטוח של SYBR.
- השפע היחסי של mtDNA ו- nDNA נקבע על ידי qPCR.
(ראה: Mariero et al., 2019)
להכנת דגימות בתפוקה גבוהה, UIP400MTP הסוניקטור של לוחות מרובי בארות מקל על הכנת מספרי מדגם גדולים בלוחות סטנדרטיים של 96 בארות, מרובי בארות ומיקרוטיטרים.
קרא עוד על היתרונות של הכנת דוגמאות בתפוקה גבוהה באמצעות UIP400MTP!
טיפים לבידוד מיטוכונדריה אופטימלי באמצעות סוניקציה:
- בקרת טמפרטורה: בצעו את כל השלבים בטווח טמפרטורות של 0°C עד 4°C. זה קריטי לשמירה על השלמות והתפקוד של המיטוכונדריה.
- יעילות ומהירות: עבדו במהירות וטיהרו את המיטוכונדריה רק במידה הנדרשת ליישום הספציפי שלכם. מניפולציה מוגזמת עלולה להוביל לאובדן משמעותי של תוכן מיטוכונדריאלי.
- דילול מתלים: שמרו על ריכוזים נמוכים של תרחיפים של תאים ואברונים לאורך כל תהליך הבידוד. זה עוזר למזער את הסיכונים של לכידה ו agglutination, ובכך לשפר את הטוהר של מיטוכונדריה מבודדת.
- נפח לדוגמה: העדיפו תכשירים מרובים בקנה מידה קטן ולא תכשיר אחד גדול. גישה זו בדרך כלל מביאה לתפוקות טובות יותר, שכן הגדלת קנה המידה אינה מגדילה באופן פרופורציונלי את כמות המיטוכונדריה הניתנים להתאוששות. UIP400MTP הסוניקטור מרובה הבארות מאפשר ליזה מהירה ואמינה של תאים לבידוד מיטוכונדריה, כמו גם מיצוי חלבון מהמיטוכונדריה.
הנחיות אלה יהפכו את תהליך הבידוד באמצעות ליזה קולית וצנטריפוגה ליעילים יותר, ויניבו תכשירים מיטוכונדריאליים באיכות גבוהה המתאימים ליישומים במורד הזרם.
Hielscher Sonicators – איכות תוצרת גרמניה
Hielscher ultrasonicators ידועים באיכות הגבוהה ביותר שלהם סטנדרטים עיצוב. חוסן ותפעול קל מאפשרים שילוב חלק של האולטרסאונד שלנו במתקנים תעשייתיים. תנאים קשים וסביבות תובעניות מטופלים בקלות על ידי אולטרסוניקטורים Hielscher.
Hielscher Ultrasonics היא חברה מוסמכת ISO לשים דגש מיוחד על ultrasonicators ביצועים גבוהים שמציעות טכנולוגיה חדישה וידידותיות למשתמש. כמובן, Hielscher ultrasonicators הם תואמי CE ולעמוד בדרישות של UL, CSA ו RoHs.
UIP400MTP סוניק לוחות 96 בארות לסוניקציה של לוחות מיקרוטיטר ורב-באר
ספרות / מקורות
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
שאלות נפוצות לגבי מיטוכונדריה ואבחון מיטוכונדריאלי
מהם מיטוכונדריה?
מיטוכונדריה הם אברונים הקשורים לקרום הנמצאים בתאים של רוב האורגניזמים האיקריוטים. הם ידועים כתחנות הכוח של התא מכיוון שהם מייצרים אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות תהליך הנשימה התאית. נוסף על כך, למיטוכונדריה יש דנ"א משלהם והם ממלאים תפקידי מפתח בתהליכים תאיים אחרים, כולל ויסות מחזור התא ומוות תאי.
מה מבדיל בין mtDNA לדנ"א גנומי?
דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) שונה מדנ"א גנומי (gDNA) בכמה דרכים עיקריות. MtDNA ממוקם במיטוכונדריה, הוא מעגלי ועובר בתורשה אימהית, ואילו gDNA ממוקם בגרעין התא, הוא ליניארי ועובר בתורשה משני ההורים. MtDNA קטן בהרבה, ומקודד רק 37 גנים, בעוד gDNA מכיל כ 20,000-25,000 גנים. MtDNA קיים במספר עותקים לכל תא, יש לו שיעור מוטציות גבוה יותר, והוא מקודד בעיקר חלבונים המעורבים בתפקוד המיטוכונדריה. לעומת זאת, gDNA הוא בדרך כלל דיפלואידי, בעל שיעור מוטציות נמוך יותר, ומקודד מגוון רחב של גנים הדרושים להתפתחות האורגניזם ולתפקודו. בנוסף, שעתוק ותרגום mtDNA מתרחשים בתוך המיטוכונדריה, בעוד ששעתוק gDNA מתרחש בגרעין, ותרגום מתרחש בציטופלסמה. הבדלים אלה משקפים את תפקידיהם השונים ואת מקורותיהם האבולוציוניים.
מהי תמצית ללא תאים?
תמצית ללא תאים היא תמיסה המכילה את התוכן של תאים lysed, כולל חלבונים, חומצות גרעין, ורכיבים תאיים אחרים, אבל ללא קרום התא שלם. תמצית זו משמשת במחקר ביוכימי וביולוגיה מולקולרית לחקר תהליכים תאיים במבחנה, ומאפשרת לחוקרים לנתח תגובות ומנגנונים מחוץ לתאים חיים.
What Role Play PCR Tests in Mitochondrial Diagnostics?
PCR tests play a critical role in mitochondrial diagnostics by enabling the detection of mutations, deletions, or copy number variations in mitochondrial DNA (mtDNA). They allow for the amplification of specific mtDNA regions to identify pathogenic variants associated with mitochondrial disorders. PCR-based techniques, such as quantitative PCR (qPCR) and long-range PCR, are also used to assess mtDNA integrity, heteroplasmy levels, and mtDNA depletion, providing essential insights into mitochondrial function and disease.
Learn how the UIP400MTP Microplate Sonicator facilitates PCR tests and assays!
מהי צנטריפוגה דיפרנציאלית?
צנטריפוגה דיפרנציאלית היא טכניקה נפוצה לשבירת תאים ובידוד מיטוכונדריאלי. שיטה זו מפרידה מבנים תאיים בהתבסס על מקדם השקיעה שלהם, התלוי הן בצפיפות והן בצורה. התהליך כולל הפעלת רמות שונות של כוח צנטריפוגלי על דגימות בתמיסות מלח חוצצות עם צפיפויות ספציפיות. מבנים בעלי מקדמי שיקוע דומים ישקעו בתחתית צינור האיסוף בו זמנית, מה שיאפשר את התאוששותם.
כיצד משתמשים בצנטריפוגה דיפרנציאלית לבידוד מיטוכונדריה?
צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשרת לחוקרים להפריד ביעילות שברים מיטוכונדריאליים ממרכיבים תאיים אחרים. בידוד המיטוכונדריה כולל מספר שלבי צנטריפוגה והתאוששות לאחר מכן של המבודד.
צנטריפוגה ראשונית: הפעילו כוח צנטריפוגלי נמוך על משקעים של פסולת תאית גדולה וגרעינים.
צנטריפוגות עוקבות: הגדילו את הכוח הצנטריפוגלי בהדרגה לשברי גלולות מועשרים במיטוכונדריה. כל שלב צנטריפוגה מסיר מבנים עם מקדמי שיקוע גבוהים יותר ויותר.
שחזור שברים: לאחר כל צנטריפוגה נאספת הכדורית, והסופרנאטנט נתון לכוחות G גבוהים יותר כדי לבודד את השבר הבא. פעולה זו חוזרת על עצמה עד להשגת הטוהר הרצוי של המיטוכונדריה.