صوتنة للتحلل: تعطيل الخلايا واستخراجها
يعد تفكك الخلايا أو تحللها جزءا شائعا من التحضير اليومي للعينات في مختبرات التكنولوجيا الحيوية. الهدف من التحلل هو تعطيل أجزاء من الجدار الخلوي أو الخلية الكاملة لإطلاق جزيئات حيوية. تستخدم الخالطات بالموجات فوق الصوتية على نطاق واسع لتحلل الخلايا بنجاح. الميزة الرئيسية للموجات فوق الصوتية المتطورة هي التحكم الدقيق في معلمات العملية مثل الكثافة ودرجة الحرارة ، مما يسمح بتعطيل الخلايا واستخراجها بشكل لطيف ولكنه عالي الكفاءة.
تحلل الخلايا باستخدام الموجات فوق الصوتية
تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها هي طريقة تستخدم لكسر الخلايا المفتوحة واستخراج المحتويات باستخدام موجات صوتية عالية التردد ، أي الموجات فوق الصوتية. Sonication هي تقنية تحلل ، والتي تستخدم على نطاق واسع كوسيلة راسخة وموثوقة لتعطيل الخلايا واستخراج المواد داخل الخلايا. التحلل بالموجات فوق الصوتية هو تقنية موثوقة لإعداد cis cتحتوي على سبيل المثال البلازميد ، مقايسات المستقبلات ، البروتينات ، الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي ، إلخ. نظرا لأنه يمكن تسوية شدة الموجات فوق الصوتية عن طريق ضبط معلمات العملية ، يمكن ضبط شدة الصوتنة المثلى من لينة جدا إلى مكثفة بشكل فردي لكل مادة ووسط لتلبية متطلبات التطبيق المحددة. الخطوات التالية للتحلل هي التجزئة وعزل العضيات و / أو استخراج البروتين وتنقيته. يجب فصل المادة المستخرجة (= المحللة) وتخضع لمزيد من التحقيقات أو التطبيقات ، على سبيل المثال للبحوث البروتينية.
المجانسات بالموجات فوق الصوتية UP100H (100 واط) و UP400St (400 واط) لإعداد العينات مثل التحلل والاستخراج.
بالمقارنة مع طرق تحلل الخلايا واستخراجها الأخرى ، فإن تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية له العديد من المزايا:
- سرعة: تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها هو طريقة سريعة يمكنها كسر الخلايا المفتوحة في غضون ثوان. هذا أسرع بكثير من الطرق الأخرى مثل التجانس أو ذوبان فريز أو طحن الخرز.
- نجاعة: يمكن استخدام تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها لمعالجة العينات الصغيرة أو الكبيرة أو المتعددة في وقت واحد ، مما يجعلها أكثر كفاءة من الطرق الأخرى التي تتطلب معالجة فردية للعينات الصغيرة.
- خالية من المواد الكيميائيةتحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها هي طريقة غير جراحية لا تتطلب استخدام مواد كيميائية أو إنزيمات قاسية.: هذا يجعلها مثالية للتطبيقات التي تحتاج إلى الحفاظ على سلامة محتويات الخلية. يمكن تجنب التلوث غير المرغوب فيه للعينات.
- غلة عالية: يمكن أن يؤدي تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها إلى استخراج غلة عالية من المحتويات الخلوية ، بما في ذلك الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات. وذلك لأن الموجات الصوتية عالية التردد تفتح الجدران الخلوية وتطلق المحتويات في المحلول المحيط.
- التحكم في درجة الحرارة: تسمح أجهزة الموجات فوق الصوتية المتطورة بالتحكم الدقيق في درجة حرارة العينة. وقد تم تجهيز Hielscher الرقمية بالموجات فوق الصوتية مع جهاز استشعار درجة الحرارة القابلة للتوصيل وبرنامج مراقبة درجة الحرارة.
- استنساخه: يمكن إعادة إنتاج بروتوكولات تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية بسهولة وحتى مطابقتها مع أحجام عينات مختلفة أكبر أو أصغر من خلال توسيع نطاق خطي بسيط.
- تنوعا: يمكن استخدام تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها لاستخراج مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والفطريات والخلايا النباتية والثدييات. يمكن استخدامه أيضا لاستخراج أنواع مختلفة من الجزيئات ، بما في ذلك البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي والليبيدات.
- إعداد في وقت واحد من العديد من العينات: Hielscher الفوق صوتيات يقدم العديد من الحلول لمعالجة العديد من العينات بشكل مريح في ظل نفس ظروف العملية بالضبط. هذا يجعل خطوة تحضير العينة من التحلل والاستخراج عالية الكفاءة وموفرة للوقت.
- سهل الاستخدام: معدات تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها سهلة الاستخدام وتتطلب الحد الأدنى من التدريب. المعدات اقتصادية أيضا لأنها استثمار واحد دون الحاجة إلى إعادة شراء التصرفات. هذا يجعلها جذابة لمجموعة واسعة من الباحثين والمختبرات.
بشكل عام ، يعد تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها طريقة سريعة وفعالة ويمكن التحكم فيها بدقة ومتعددة الاستخدامات لاستخراج المحتويات الخلوية. مزاياها على الطرق البديلة تجعلها خيارا جذابا لمجموعة واسعة من التطبيقات البحثية والصناعية.
مبدأ العمل من تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية
يستخدم تحلل الخلايا بالموجات فوق الصوتية واستخراجها موجات صوتية عالية التردد لتعطيل الخلايا واستخراج محتوياتها. تخلق الموجات الصوتية تغيرات في الضغط في السائل المحيط ، مما يتسبب في تكوين فقاعات صغيرة وانهيارها في عملية تعرف باسم التجويف. تولد هذه الفقاعات قوى ميكانيكية موضعية شديدة الكثافة يمكنها كسر الخلايا المفتوحة وإطلاق محتوياتها في المحلول المحيط.
عادة ما يتضمن تحلل الخلايا باستخدام الموجات فوق الصوتية الخطوات التالية:
- يتم وضع العينة في أنبوب أو حاوية مع عازلة سائلة.
- يتم إدخال مسبار بالموجات فوق الصوتية في العينة ، ويتم تطبيق موجات صوتية عالية التردد مع حوالي 20-30 كيلو هرتز.
- تسبب الموجات فوق الصوتية التذبذب والتجويف في السائل المحيط ، مما يولد قوى موضعية تكسر الخلايا المفتوحة وتطلق محتوياتها.
- يتم طرد العينة أو تصفيتها لإزالة أي حطام خلوي ، ويتم جمع المحتويات المستخرجة لتحليلها في المراحل النهائية.
تعمل الموجات فوق الصوتية القوية على تعطيل مصفوفة الخلايا للهياكل البيولوجية وإطلاق المركبات النشطة بيولوجيا. يتم تكثيف نقل الكتلة بين المواد النباتية والمذيب (على سبيل المثال ، العازلة). (الرسم: ©فيلخو وآخرون ، 2006)
عيوب طرق التحلل الشائعة
أثناء عملك في المختبرات، ربما تكون قد واجهت بالفعل متاعب تحلل الخلايا باستخدام بروتوكولات التحلل الميكانيكية أو الكيميائية التقليدية.
- التحلل الميكانيكي: غالبا ما تفتقر طرق التحلل الميكانيكي ، مثل الطحن بالملاط والمدقة أو التجانس باستخدام مكبس فرنسي أو مطحنة خرز أو نظام الجزء الثابت الدوار إلى خيارات التحكم الدقيق والضبط. هذا يعني أن استخدام الطحن والطحن يمكن أن يولد بسرعة قوى الحرارة والقص التي يمكن أن تلحق الضرر بالعينة وتشوه البروتينات. يمكن أن تستغرق أيضا وقتا طويلا وتتطلب كميات كبيرة من المواد الأولية.
- التحلل الكيميائي: يمكن أن تؤدي طرق التحلل الكيميائي ، مثل التحلل القائم على المنظفات ، إلى إتلاف العينة عن طريق تعطيل طبقة الدهون المزدوجة وتغيير طبيعة البروتينات. يمكن أن تتطلب أيضا خطوات متعددة وقد تترك ملوثات متبقية تتداخل مع التطبيقات النهائية. يمثل العثور على الجرعة المثلى من المنظفات تحديا إضافيا.
- دورات التجميد والذوبان: يمكن أن تتسبب دورات التجميد والذوبان في تمزق أغشية الخلايا ، لكن الدورات المتكررة يمكن أن تسبب أيضا تمسخ البروتين وتدهوره. يمكن أن تتطلب هذه الطريقة أيضا دورات متعددة ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وغالبا ما تؤدي إلى انخفاض الغلة.
- التحلل الأنزيمي: يمكن أن تكون طرق التحلل الأنزيمي خاصة بأنواع معينة من الخلايا وتتطلب خطوات متعددة ، مما يجعلها تستغرق وقتا طويلا. كما أنها تولد نفايات وتتطلب تحسينا دقيقا لتجنب تدهور العينة. غالبا ما تكون مجموعات التحلل الأنزيمي باهظة الثمن. إذا كان إجراء التحلل الأنزيمي الحالي يعطي نتائج غير كافية ، يمكن تطبيق صوتنة كطريقة تآزرية لتكثيف اضطراب الخلايا.
على النقيض من طرق تحلل الخلايا الميكانيكية والكيميائية التقليدية ، فإن الصوتنة هي أداة فعالة وموثوقة للغاية لتفكك الخلايا التي تسمح بالتحكم الكامل في معلمات الصوتنة. هذا يضمن انتقائية عالية على إطلاق المواد ونقاء المنتج. [راجع بالاسوندارام وآخرون ، 2009]
إنها مناسبة لجميع أنواع الخلايا ويمكن تطبيقها بسهولة على نطاق صغير وكبير – دائما في ظل ظروف خاضعة للرقابة. الموجات فوق الصوتية سهلة التنظيف. يتميز الخالط بالموجات فوق الصوتية دائما بوظيفة التنظيف المكاني (CIP) والتعقيم في المكان (SIP). يتكون sonotrode في قرن التيتانيوم الضخم الذي يمكن محوه أو شطفه في الماء أو المذيب (اعتمادا على وسيط العمل). صيانة الموجات فوق الصوتية يرجع إلى قوتها مهملة تقريبا.
بالموجات فوق الصوتية Lysis وتعطل الخلية
بشكل عام ، فإن تحلل العينات في المختبر يستغرق ما بين 15 ثانية ودقيقتين. بما أن شدة الصوتنة من السهل جدا ضبطها عن طريق تحديد زمن صوتنة وكذلك باختيار الجهاز المناسب ، فمن الممكن تعطيل أغشية الخلية برفق أو فجأة ، اعتمادًا على بنية الخلية وغرض التحلل ( مثل استخراج الحمض النووي يتطلب صوتنة أكثر ليونة ، واستخراج البروتين الكامل من البكتيريا يتطلب علاج مكثف أكثر كثافة بالموجات فوق الصوتية). يمكن مراقبة درجة الحرارة أثناء العملية من خلال جهاز استشعار درجة الحرارة المدمج ويمكن التحكم فيها بسهولة عن طريق التبريد (حمام جليدي أو خلايا تدفق مع جاكيتات تبريد) أو بواسطة صوتنة في الوضع النبضي. أثناء صوتنة النبض ، تسمح دورات انفجارات صوتية قصيرة مدتها 1-15 ثانية لتبديد الحرارة والتبريد خلال الفترات المتقطعة الأطول.
جميع العمليات يحركها الموجات فوق الصوتية هي تكرار تماما وقابلة للخطيا.
فيال تويتر هو مجانس بالموجات فوق الصوتية لإعداد معقم متزامن وموحد وسريع للعديد من العينات.
المجانسات بالموجات فوق الصوتية لتحلل الخلايا واستخراجها
تسمح أنواع مختلفة من أجهزة الموجات فوق الصوتية بمطابقة هدف إعداد العينة وضمان سهولة الاستخدام وراحة التشغيل. الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار هي الأجهزة الأكثر شيوعا في المختبر. إنها الأنسب لإعداد عينات صغيرة ومتوسطة الحجم بأحجام 0.1 مل حتى 1000 مل. أحجام الطاقة المختلفة و sonotrodes تسمح لتكييف الموجات فوق الصوتية لحجم العينة والوعاء للحصول على نتائج صوتنة الأكثر فعالية وكفاءة. جهاز التحقيق بالموجات فوق الصوتية هو الخيار الأفضل عندما يتعين تحضير عينات فردية.
إذا كان لا بد من إعداد المزيد من العينات ، على سبيل المثال 8-10 قوارير من محلول الخلية ، فإن الصوتنة غير المباشرة المكثفة مع أنظمة الموجات فوق الصوتية مثل VialTweeter أو cuphorn بالموجات فوق الصوتية هي أنسب طريقة تجانس لتحلل فعال. يتم صوتنة عدة قوارير في نفس الوقت ، بنفس الشدة. هذا لا يوفر الوقت فحسب ، بل يضمن أيضا نفس المعالجة لجميع العينات ، مما يجعل النتائج بين العينات موثوقة وقابلة للمقارنة. وعلاوة على ذلك، خلال صوتنة غير مباشرة عبر التلوث عن طريق غمر سونوترود بالموجات فوق الصوتية (المعروف أيضا باسم التحقيق بالموجات فوق الصوتية، القرن، طرف، أو إصبع) يتم تجنبها. نظرا لاستخدام قوارير متطابقة بشكل فردي لحجم العينة ، يتم حذف التنظيف الذي يستغرق وقتا طويلا وفقدان العينات بسبب صب الأوعية. لصوتنة موحدة من لوحات multiwell أو microtiter، Hielscher يقدم UIP400MTP.
لكميات أكبر، على سبيل المثال للإنتاج التجاري مقتطفات الخلية، ونظم بالموجات فوق الصوتية مستمرة مع مفاعل خلية تدفق هي الأكثر مناسبة. تدفق مستمر وحتى من المواد المجهزة يؤكد حتى صوتنة. جميع المعلمات من عملية التفكك فوق الصوتية يمكن أن يكون الأمثل وتعديلها لمتطلبات التطبيق ومواد معينة من الخلايا.
الإجراء المثالي لالناشر بالموجات فوق الصوتية من الخلايا البكتيرية:
- إعداد تعليق الخلية: خلية الكريات يجب أن توقف تماما في حل العازلة المجانسة (اختيار حل العازلة الخاصة بك متوافقة مع التحليل التالي، على سبيل المثال طريقة اللوني معين). إضافة الليزوزيم و / أو غيرها من المواد المضافة، إذا لزم الأمر (يجب أن تكون أيضا متوافقة مع وسائل الفصل / تنقية). خلط / التجانس الحل بلطف تحت صوتنة معتدل حتى يتم تحقيق الوقف الكامل.
- بالموجات فوق الصوتية تحلل: ضع العينة في حمام الثلج. لتمزق خلية، يصوتن تعليق في 60-90 رشقات نارية الثانية (باستخدام وضع النبض ultrasonicator الخاص بك).
- (. على سبيل المثال 10 دقيقة في 10000 ز س، في 4degC): فصل أجهزة الطرد المركزي في المحللة. فصل طاف من بيليه الخلية بعناية. وطاف هو مجموع المحللة الخلية. بعد الترشيح من طاف، يمكنك الحصول على السائل توضيح من البروتين الخلايا القابلة للذوبان.
التطبيقات الأكثر شيوعا لultrasonicators في علم الأحياء والتكنولوجيا الحيوية هي:
- استخراج الخلايا إعداد
- اضطراب الخميرة والبكتيريا والخلايا النباتية وأنسجة الخلايا الرخوة أو الصلبة والمواد النووية
- استخراج البروتين
- إعداد وعزل الإنزيمات
- إنتاج مستضدات
- استخراج الحمض النووي و / أو تجزئة المستهدفة
- إعداد الحويصلية
تعطيل الخلية مع الموجات فوق الصوتية من نوع التحقيق هو طريقة فعالة لإعداد العينة.
الجدول أدناه يعطيك لمحة عامة على الموجات فوق الصوتية لدينا لتعطيل الخلايا واستخراجها. انقر فوق نوع الجهاز للحصول على مزيد من المعلومات حول كل خالط بالموجات فوق الصوتية. سيسعد موظفونا الفنيون المدربون تدريبا جيدا وذوي الخبرات الطويلة بمساعدتك في اختيار أنسب الموجات فوق الصوتية لعيناتك!
| دفعة حجم | معدل المد و الجزر | الأجهزة الموصى بها |
|---|---|---|
| ما يصل إلى 10 قوارير أو أنابيب | زمالة المدمنين المجهولين | VialTweeter |
| لوحات متعددة الآبار / ميكروتيتر | زمالة المدمنين المجهولين | UIP400MTP |
| أنابيب / أوعية متعددة | زمالة المدمنين المجهولين | كوبهورن |
| 1 إلى 500ML | 10 إلى 200ML / دقيقة | UP100H |
| 10 إلى 1000 مل | 20 إلى 200 مل / دقيقة | Uf200 ः ر، UP200St |
| 10 إلى 2000ML | 20 إلى 400ML / دقيقة | UP400St |
تطبيقات متعددة من فروع الموجات فوق الصوتية في قطاعات التكنولوجيا الحيوية والهندسة الحيوية، علم الأحياء الدقيقة والبيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية وعلم المناعة، علم الجراثيم، الفيروسات، البروتينات، علم الوراثة، علم وظائف الأعضاء، وعلم الأحياء الخلوي، أمراض الدم، وعلم النبات.
التحلل: تكسير تراكيب الخلايا
خلايا محمية بواسطة غشاء البلازما شبه منفذ الذي يتكون في طبقة ثنائية-الفوسفات الدهون (أيضا البروتين الدهني طبقة ثنائية، التي شكلتها الدهون مسعور وجزيئات الفسفور ماء مع جزيئات البروتين جزءا لا يتجزأ)، ويخلق حاجزا بين الداخل الخلية (السيتوبلازم) و البيئة خارج الخلية. وتحاط الخلايا النباتية والخلايا بدائية النواة بجدار الخلية. بسبب طبقات متعددة سميك جدار الخلية من السليلوز، الخلايا النباتية هي أصعب لليز من الخلايا الحيوانية. داخل الخلية، مثل العضيات، نواة، الحبيبات الخيطية، واستقرت الهيكل الخلوي.
بواسطة الناشر الخلايا، وانها تهدف الى استخراج وفصل العضيات والبروتينات والحمض النووي، ومرنا أو الجزيئات الحيوية الأخرى.
الطرق التقليدية لتحلل الخلايا وعيوبها
هناك عدة طرق لالمحللة الخلايا، والتي يمكن تقسيمها إلى الطرق الميكانيكية والكيميائية، بما في ذلك استخدام المنظفات أو المذيبات، وتطبيق الضغط العالي، أو استخدام طاحونة حبة أو الصحافة الفرنسية. العيب الأكثر إشكالية من هذه الأساليب هو التحكم الصعبة وتعديل المعلمات العملية، وبالتالي التأثير.
يعرض الجدول أدناه العيوب الرئيسية لطرق التحلل الشائعة:
طاولة: طرق التقليدية للتحلل الخلية لها عيوب كبيرة
إجراء التحلل
تحلل هي عملية حساسة. خلال تحلل وتدمير حماية غشاء الخلية، ولكن التعطيل، تمسخ وتدهور البروتينات المستخرجة من بيئة unphysiological (الانحراف من درجة الحموضة القيمة) يجب منعها. لذلك، في تحلل العام والتي نفذت في حل العازلة. وتنشأ معظم الصعوبات من تعطيل الخلايا غير المنضبط مما أدى إلى إطلاق تشتته لجميع المواد داخل الخلايا أو / وتمسخ المنتج الهدف.
مراجع الادب
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.