تحسين تحليل HPLC عن طريق تحضير عينة موثوق به
يظل كروماتوغرافيا السوائل عالية الأداء (HPLC) أحد أهم التقنيات التحليلية لتحديد المركبات في المصفوفات المعقدة وتقدير كميتها. من مراقبة جودة المستحضرات الصيدلانية إلى المراقبة البيئية وتحليل الأغذية، يتم تقييم طرق HPLC لحساسيتها وانتقائيتها وقابليتها للتكرار. ومع ذلك، فإن موثوقية البيانات الكروماتوغرافية تعتمد بشكل كبير على خطوة واحدة حاسمة: تحضير عينة HPLC.
تثبت الأبحاث وإجراءات تحضير العينات الروتينية أن الاستخلاص وإعداد العينات بمساعدة الصوتنة يحسن بشكل كبير من كفاءة ودقة وسرعة تحليل HPLC. باستخدام الطاقة بالموجات فوق الصوتية لتعطيل المصفوفات وتعزيز نقل المواد التحليلية إلى المذيبات، يمكن للمختبرات الحصول على عمليات استخلاص أعلى، وأوقات استخلاص أقصر، ونتائج تحليلية أكثر قابلية للتكرار.
لماذا يعد تحضير العينة مهمًا في HPLC
في العديد من عمليات سير العمل التحليلية، فإن مصفوفة العينة – مثل المواد النباتية أو الأنسجة البيولوجية أو التربة أو الماء – مخاليط معقدة من المركبات التي يمكن أن تتداخل مع الفصل الكروماتوغرافي. لذلك فإن التحضير الفعال للعينات مطلوب لعزل المواد التحليلية وإزالة المواد المتداخلة وتركيز المركبات المستهدفة قبل الحقن في نظام HPLC.
غالبًا ما تتضمن تقنيات الاستخلاص التقليدية إجراءات مطولة وكميات كبيرة من المذيبات العضوية وخطوات تنظيف متعددة. يمكن أن تؤدي هذه الأساليب إلى التباين وزيادة التكاليف التشغيلية وإطالة الوقت الإجمالي للتحليل.
يوفر تحضير العينة بالموجات فوق الصوتية بديلاً فعالاً. تُدخل الموجات فوق الصوتية طاقة صوتية عالية التردد في وسط سائل، مما ينتج فقاعات تجويف مجهرية. عندما تنهار هذه الفقاعات، فإنها تولد قوى القص الموضعية وتأثيرات الخلط الدقيقة التي تعطل المصفوفات الصلبة وتسرع من نقل الكتلة. تعزز هذه العملية كفاءة الاستخلاص بشكل كبير.
UIP400MTP صوتي عالي الإنتاجية مع حامل أنابيب للقوارير ذاتية الفحص
الدليل العلمي: الصوتيات يحسن الأداء التحليلي
وقد أظهرت العديد من الدراسات التي استعرضها الأقران مزايا الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية في سير عمل HPLC.
فعلى سبيل المثال، استخدمت طريقة تم تطويرها لرصد مخلفات مبيدات الآفات في عينات المياه المعالجة بالموجات فوق الصوتية مع تحليل LC-MS/MS لتحديد تركيزات مبيد الكرباريل. في هذا النهج، تم استخلاص عينات المياه باستخدام الأسيتونيتريل تحت المعالجة بالموجات فوق الصوتية قبل التحليل الكروماتوغرافي. وقد حققت هذه الطريقة أداءً تحليليًا قويًا، بما في ذلك معدلات استرداد تتراوح بين 89.53% و101.72%، مما يؤكد دقة وموثوقية إجراء تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية.
وقد مكنت خطوة الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية من النقل الفعال للتحليلات من المصفوفة المائية إلى المذيب العضوي، مما قلل من استهلاك المذيبات وألغى الحاجة إلى إجراءات تنظيف واسعة النطاق. أظهرت الطريقة التحليلية التي تم التحقق من صحتها خطية ممتازة ودقة وحدود تقدير كمية، مما يسلط الضوء على فعالية الصوتنة في تدفقات العمل الكروماتوغرافي الحديثة. (راجع روداني وآخرون، 2018)
وقدمت دراسة أخرى تقنية التشتت بالموجات فوق الصوتية بمساعدة الموجات فوق الصوتية في المصفوفة ذات الطور الصلب (UA-MSPD) لتحديد الأولوروبين في أوراق الزيتون باستخدام تحليل HPLC. في هذه التقنية، تم خلط مسحوق النبات والمواد الماصة ثم تعريضها للموجات فوق الصوتية أثناء خطوة الشطف. عززت الموجات فوق الصوتية امتصاص المادة الماصة من سطح المادة الماصة مع تحسين الاستخلاص من مصفوفة العينة في الوقت نفسه. (راجع رشيديبور وحيدري، 2018)
أنتج الإجراء المحسّن بالموجات فوق الصوتية تحسينات تحليلية كبيرة، بما في ذلك:
- منحنيات معايرة خطية مع R² = 0.9979
- حدود الاكتشاف منخفضة تصل إلى 0.03 ميكروغرام ميكروغرام مل-¹
- معدلات الاسترداد تتراوح بين 90.2% و96.7%
تؤكد هذه النتائج أن الاستخلاص بمساعدة الموجات فوق الصوتية لا يسرع من تحضير العينة فحسب، بل يزيد أيضًا من عائد الاستخلاص مقارنةً بتقنيات تشتت الطور الصلب المصفوفة الكلاسيكية.
مسبار نوع صوتي UP200St لتحضير عينة HPLC
المزايا الرئيسية لإعداد العينة بالموجات فوق الصوتية لتحضير عينة HPLC
ويعزى الاعتماد المتزايد على الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية في المختبرات التحليلية إلى العديد من الفوائد القابلة للقياس.
- كفاءة استخراج أعلى في الاستخراج
يعمل التجويف الصوتي على تكسير المصفوفات الصلبة وتحسين تغلغل المذيبات. يعزز هذا من إطلاق المواد التحليلية ويزيد من معدلات الاسترداد، خاصةً بالنسبة للمركبات على مستوى التتبع في العينات المعقدة. - تقليل وقت تحضير العينة
يمكن للاستخلاص بالموجات فوق الصوتية في كثير من الأحيان إكمال تحضير العينة في غضون ثوانٍ أو دقائق. على سبيل المثال، حققت معلمات الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية المحسنة في UA-MSPD استردادًا فعالًا للتحليل في حوالي 30 ثانية من الصوتنة، مما يوضح كيف يمكن تسريع سير عمل التحليل بشكل كبير. - انخفاض استهلاك المذيبات
ونظرًا لأن الموجات فوق الصوتية تعزز نقل الكتلة، عادةً ما تكون هناك حاجة إلى أحجام أصغر من المذيبات. يؤدي انخفاض استخدام المذيبات إلى تحسين استدامة المختبر وخفض التكاليف التشغيلية. - تحسين قابلية التكرار
يضمن التوزيع المنتظم للطاقة بالموجات فوق الصوتية اتساق توزيع الطاقة بالموجات فوق الصوتية اتساق تعطيل العينة واستخراجها عبر التكرارات، مما يؤدي إلى دقة أفضل في القياسات التحليلية. - التوافق مع طرق الكروماتوغرافيا الحديثة
يندمج الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية بسهولة مع أنظمة الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية مع أنظمة HPLC وUHPLC وLC-MS، مما يجعله مناسبًا للبيئات التحليلية عالية الإنتاجية.
كروماتوجرام HPLC للمركبات الفينولية من مستخلص معزول بالموجات فوق الصوتية من أوراق Annona muricata باستخدام الموجات فوق الصوتية UP400S.
(دراسة ورسم: ©نولاسكو غونزاليس وآخرون ، 2022)
حلول الصوتيات العملية لإعداد عينة HPLC
بالنسبة للمختبرات التي تطبق الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية، توفر أجهزة Hielscher للمختبرات التي تطبق الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية تحكمًا دقيقًا في المعلمات مثل السعة والوقت ووضع النبض. ولذلك، فإن أجهزة Hielscher المختبرية بالموجات فوق الصوتية مناسبة بشكل خاص للمختبرات التحليلية.
اختيار جهاز صوتيات المختبر الأنسب لعينات HPLC الخاصة بك
| طراز سونيكاتور | مزايا HPLC | أفضل استخدام في إعداد عينة HPLC |
| VialTweeter متعدد الأنابيب Sonicator |
- صَوْننة متزامنة لما يصل إلى 10 قوارير محكمة الغلق بطاقة فوق صوتية متطابقة - معقمة: لا يوجد تلوث متبادل لأن العينات تظل مغلقة - ظروف استخلاص قابلة للتكرار بشكل كبير عبر الدفعات - التجويف الفعّال للعينات التحليلية صغيرة الحجم |
- التحضير عالي الإنتاجية للعينات البيئية أو الغذائية أو الصيدلانية - استخلاص أثر التحليل قبل تحليل HPLC أو UHPLC أو UHPLC أو LC-MS - عمليات سير العمل الموحدة التي تتطلب معالجة متطابقة لعينات متعددة |
| UIP400MTP الصوتنة Microplate |
- صوتنة بدون تلامس للأقراص المجهرية بأكملها (96 خلية، 384 خلية) - توزيع موحد للطاقة بالموجات فوق الصوتية عبر جميع الآبار - تمكين التشغيل الآلي والتكامل الآلي لسير العمل التحليلي - إنتاجية عالية مع تحكم دقيق في السعة ووقت الصوتنة |
- تدفقات عمل فحص UHPLC عالي الإنتاجية - مكتبات المركبات الصيدلانية وتحضير عينات الأيضات الصيدلانية - الاستخلاص القائم على اللوح لخطوط الأنابيب التحليلية LC-MS أو UHPLC |
| أجهزة صوتية مختبرية ذات طرف صغير (صوتنة مباشرة) |
- كثافة قصوى بالموجات فوق الصوتية لتعطيل المصفوفة بفعالية - الاستخلاص السريع جدًا للتحليلات من العينات الصلبة أو اللزجة أو غير المتجانسة - معلمات السعة والنبض القابلة للتعديل لظروف الاستخراج الأمثل - تعمل طاقة التجويف العالية على تحسين استعادة المواد التحليلية وعائد الاستخلاص |
- الاستخلاص من المصفوفات الصعبة مثل الأنسجة النباتية أو عينات الطعام أو البوليمرات - التجانس قبل استخلاص السائل السائل المنفصل أو الترشيح أو الاستخلاص السائل بالسائل - تطوير طريقة لتحضير عينة HPLC بالموجات فوق الصوتية عالية السعة بالموجات فوق الصوتية |
| كوبهورن (“حمام عالي الكثافة” للأكواب والأنابيب) |
- الصوتنة غير المباشرة تمنع التلوث بالمسبار - مجال فوق صوتي موحد لأنابيب متعددة في وقت واحد - مثالي للعينات المعقمة أو الخطرة أو المتطايرة التي يجب أن تظل محكمة الغلق - يبسِّط التعامل مع الطاقة القوية للتجويف مع الحفاظ على طاقة التجويف القوية |
- الاستخلاص المتوازي لعينات متعددة من HPLC في أنابيب طرد مركزي محكمة الغلق - تحضير العينات البيولوجية أو الصيدلانية أو البيئية - مهام سير العمل التي تتطلب صوتنة غير مباشرة خالية من التلوث |
الملاءمة العلمية للكيمياء التحليلية
بينما تتحرك الكيمياء التحليلية نحو ممارسات مختبرية أسرع وأكثر استدامة، أصبح تحضير العينات بالموجات فوق الصوتية تقنية تمكينية قوية. تدعم السونيكيشن تطوير طرق تحليلية سريعة مع استهلاك أقل للمذيبات، وتحسين كفاءة الاستخلاص، ومعايير تحقق قوية.
توضح المجموعة المتزايدة من المؤلفات حول الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية أن تحضير عينة HPLC بمساعدة الصوتنة ليس مجرد وسيلة مريحة – هو نهج معتمد علميًا يعزز الأداء التحليلي. من خلال الجمع بين الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية والتقنيات الكروماتوغرافية الحديثة، يمكن للمختبرات تحقيق الكشف الموثوق عن التحليلات النزرة في مصفوفات العينات المتزايدة التعقيد.
تدفقات عمل HPLC المعززة بالصوتنة
مع التقدم المستمر في الأجهزة التحليلية وتقنيات تحضير العينات، من المرجح أن يلعب الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية دورًا أكبر في مختبرات الكروماتوغرافيا. تتوافق قدرته على تبسيط سير العمل وتحسين جودة البيانات وتقليل التأثير البيئي بشكل جيد مع المتطلبات المتطورة للعلوم التحليلية الحديثة.
بالنسبة للكيميائيين التحليليين والمختبرات الصناعية التي تسعى إلى تحسين إعداد عينة HPLC، يوفر الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية حلاً مثبتًا وقابلًا للتطوير وقويًا من الناحية العلمية. من خلال دمج الصوتنة في بروتوكولات تحضير العينات الروتينية، يمكن للمختبرات تحسين كفاءة وموثوقية التحليل الكروماتوغرافي بشكل كبير.
التصميم والتصنيع والاستشارات – جودة صنع في ألمانيا
Hielscher الموجات فوق الصوتية معروفة جيدا لأعلى معايير الجودة والتصميم. المتانة والتشغيل السهل تسمح بالتكامل السلس للموجات فوق الصوتية لدينا في المنشآت الصناعية. يتم التعامل بسهولة مع الظروف القاسية والبيئات الصعبة بواسطة الموجات فوق الصوتية Hielscher.
Hielscher Ultrasonics هي شركة حاصلة على شهادة الأيزو وتركز بشكل خاص على الموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. بطبيعة الحال، الموجات فوق الصوتية Hielscher هي CE المتوافقة وتلبية متطلبات UL، وكالة الفضاء الكندية وبنفايات.
الأدب / المراجع
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
أسئلة مكررة
ما هو HPLC؟
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي تقنية فصل تحليلية تُستخدم لتحديد المكونات داخل المخلوط وقياسها وتنقيتها. في تقنية الفصل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC)، يحمل الطور السائل المتحرك السوائل المواد التحليلية الذائبة عبر عمود معبأ بطور ثابت تحت ضغط عالٍ. تتسبب الاختلافات في التفاعلات بين التحليلات والطور الثابت والطور المتحرك في فصل المركبات أثناء انتقالها عبر العمود. تقيس الكواشف مثل الأشعة فوق البنفسجية والأشعة المرئية أو الفلورسنت أو قياس الطيف الكتلي المركبات المنفصلة، مما يسمح بإجراء تحليل نوعي وكمي دقيق.
ما هي أنواع الكروماتوغرافيا السائلة؟
يمكن تصنيف الكروماتوغرافيا السائلة وفقًا لآلية الفصل المستخدمة بين المادة المحللة والطور الثابت والطور المتحرك. الأنواع الأكثر شيوعًا هي كروماتوغرافيا الطور العكسي، حيث تفصل المرحلة الثابتة غير القطبية المركبات بناءً على التفاعلات الكارهة للماء؛ وكروماتوغرافيا الطور العادي التي تستخدم مرحلة ثابتة قطبية وتفصل المركبات وفقًا للقطبية؛ وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني، حيث تفصل المراحل الثابتة المشحونة التحليلات بناءً على التفاعلات الأيونية؛ وكروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي التي تفصل الجزيئات وفقًا لحجمها الهيدروديناميكي ووزنها الجزيئي. وتشمل الطرق المتخصصة الأخرى كروماتوغرافيا التقارب وكروماتوغرافيا التفاعل المائي (HILIC)، التي تستهدف تفاعلات جزيئية محددة أو مركبات قطبية.
ما هي القوارير المستخدمة في HPLC؟
عادةً ما تستخدم تحليلات HPLC قوارير زجاجية أو بوليمرية صغيرة مصممة لاحتواء العينات المحضرة قبل الحقن في النظام الكروماتوغرافي. الشكل الأكثر شيوعًا هو القارورة ذاتية التحليل بسعة 2 مل، وهي متوافقة مع معظم أجهزة التحليل الكروماتوغرافي عالي السوائل HPLC. وعادةً ما تكون هذه القوارير مصنوعة من زجاج البورسليكات لضمان المقاومة الكيميائية والحد الأدنى من التفاعل مع المذيبات والتحليلات. اعتمادًا على نوع العينة، قد تشتمل القوارير على إدخالات للعينات منخفضة الحجم، وأغطية لولبية أو أغطية لولبية أو أغطية مجعدة، وحاجز مصنوع من مواد مثل PTFE/السيليكون للحفاظ على سلامة العينة.
ما هي قوارير جهاز أخذ العينات التلقائي؟
قوارير Autosampler عبارة عن حاويات عينة متخصصة مصممة لأنظمة الحقن الآلي في أجهزة HPLC وUHPLC. وهي تحتوي على محلول العينة المحضرة وتوضع في صينية جهاز أخذ العينات التلقائي، حيث يسحب النظام تلقائيًا حجمًا محددًا للحقن في العمود الكروماتوغرافي. يتم تصنيع القوارير ذاتية أخذ العينات بأبعاد دقيقة لضمان التوافق مع إبر أخذ العينات الآلية وتقليل تبخر العينة أو تلوثها أو امتصاصها. يتيح تصميمها إجراء تحليل عالي الإنتاجية وقابل للتكرار في مختبرات الكروماتوغرافيا الحديثة.
ما هي الخطوات في HPLC؟
يتألف سير العمل النموذجي للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) من عدة خطوات متسلسلة تضمن الفصل الموثوق به والكشف عن التحليلات.
- أولاً، يتم إجراء تحضير العينة لإذابة المادة المراد تحليلها وإزالة الجسيمات وغالبًا ما يتم استخلاص أو تركيز المركبات المستهدفة من مصفوفة العينة. قد تشمل هذه الخطوة الترشيح أو التخفيف أو تقنيات الاستخلاص مثل الاستخلاص بالموجات فوق الصوتية أو الاستخلاص في المرحلة الصلبة أو الاستخلاص السائل بالسائل.
- بعد ذلك، يتم وضع العينة المحضرة في قارورة HPLC وتحميلها في جهاز أخذ العينات التلقائي. يقوم جهاز أخذ العينات التلقائي بحقن كمية دقيقة من العينة في الطور المتحرك المتدفق.
- ثم تنقل مرحلة توصيل الطور المتحرك العينة المحقونة عبر النظام باستخدام مضخة عالية الضغط. يحمل الطور المتحرك المواد التحليلية عبر العمود الكروماتوغرافي بمعدل تدفق محكوم.
- داخل العمود الكروماتوغرافي، يحدث الفصل. يحتوي العمود على مرحلة ثابتة، وهي عادةً جسيمات معبأة ذات خصائص كيميائية محددة. عندما تنتقل التحليلات عبر العمود، تتفاعل بشكل مختلف مع الطور الثابت والطور المتحرك، مما يؤدي إلى شطبها في أوقات مختلفة.
- بعد الفصل، تمر المركبات من خلال كاشف، مثل كاشف الأشعة فوق البنفسجية والأشعة المرئية أو الفلورية أو كاشف قياس الطيف الكتلي. يقيس الكاشف وجود وتركيز المركبات المستخلصة ويحول الإشارة إلى بيانات إلكترونية.
- أخيرًا، يتم إجراء الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام برنامج كروماتوغرافي. يولد النظام مخططًا لونيًا تتوافق فيه القمم مع مركبات فردية. تساعد أزمنة احتباس الذروة في تحديد التحليلات، بينما تسمح مناطق الذروة أو الارتفاعات بتحديد تركيزها كميًا.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع الخالط بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء من المختبر ل الحجم الصناعي.