التحول الوراثي في الخلايا النباتية باستخدام الموجات فوق الصوتية

يُعد التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT) طريقة فعالة لإصابة الخلايا النباتية بجينات أجنبية باستخدام Agrobacterium ناقلًا لها. يسبب التجويف فوق الصوتي التثقيب بالموجات فوق الصوتية، الذي يمكن وصفه بأنه إحداث جروح مجهرية موجّهة في الأنسجة النباتية. ومن خلال هذه الجروح المجهرية المُحدثة بالموجات فوق الصوتية، يمكن نقل DNA ونواقل DNA بكفاءة إلى المصفوفة الخلوية.

التثقيب بالموجات فوق الصوتية – تعزيز التحول الخلوي بالموجات فوق الصوتية

عند تطبيق موجات فوق صوتية منخفضة التردد (نحو 20kHz) على المعلقات الخلوية، تسبب تأثيرات التجويف الصوتي زيادة عابرة في نفاذية أغشية الأنسجة الخلوية. يُعرف هذا التأثير فوق الصوتي بالتثقيب بالموجات فوق الصوتية، ويُستخدم لنقل الجينات إلى الخلايا أو الأنسجة.
تستند مزايا المعالجة بالموجات فوق الصوتية إلى مبدأ عملها الميكانيكي غير الحراري، الذي يجعلها غالبًا أكثر تنوعًا وأقل اعتمادًا على أنواع الخلايا. ويتيح تنوع تطبيقات التثقيب بالموجات فوق الصوتية إمكانية استخدام النباتات المعدلة وراثيًا، التي تتمتع بإمكانات كبيرة في الإنتاج الحيوي للبروتينات العلاجية البشرية المعقدة. ويمكن تعديل هذه المفاعلات الحيوية النباتية وراثيًا بسهولة، وهي تمنع التلوث المحتمل بمسببات الأمراض البشرية، ولا تضر بالبكتيريا التي تتوسط التحول (مثل Agrobacterium)، وتُعد وسيلة منخفضة التكلفة وفعالة للتخليق الحيوي.

التحول الخلوي بمساعدة الموجات فوق الصوتية

المعالجة بالموجات فوق الصوتية تقنية تستخدم موجات فوق صوتية منخفضة التردد لتحريك الجسيمات في المحلول ومزج المحاليل، مما يزيد معدل انتقال الكتلة والذوبان. وفي الوقت نفسه، يمكن للمعالجة بالموجات فوق الصوتية إزالة الغازات المذابة من السوائل. وفي التحول النباتي، تؤدي المعالجة بالموجات فوق الصوتية إلى تكوّن جروح مجهرية في الأنسجة النباتية وتعزز إيصال DNA العاري إلى البروتوبلاست النباتي.

بالنسبة إلى التحول الوراثي، يُعد التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT) الطريقة المفضلة، وتفوق كفاءته بدرجة كبيرة كفاءة المعالجة بالموجات فوق الصوتية المستخدمة لنقل DNA العاري ونواقل DNA مباشرة إلى البروتوبلاست. وقد أثبتت دراسات عديدة إمكانية استخدام التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT) لإحداث تفكيك ميكانيكي وتكوين جروح في الخلايا النباتية بفعل الموجات فوق الصوتية والتجويف الصوتي الناتج عنها. وتُحدث معالجة قصيرة بالموجات فوق الصوتية جروحًا مجهرية على سطح الأجزاء النباتية المستأصلة. وتسمح الخلايا المجروحة بنفاذ Agrobacterium إلى الأجزاء الأعمق من الأنسجة النباتية، مما يزيد احتمال إصابة الخلايا النباتية. كما تعزز المركبات الفينولية المُفرزة التحول. وتجعل الجروح المجهرية المُحدثة بالموجات فوق الصوتية نفاذ البكتيريا إلى الأجزاء النباتية المستأصلة أكثر سهولة أيضًا. وقد استُخدم SAAT بنجاح لإحداث التحول الوراثي في أنواع نباتية تُعد مقاومةً لـ Agrobacterium على وجه الخصوص.
تتمثل المزايا الرئيسية لـ SAAT في كونه طريقة بسيطة للغاية ومنخفضة التكلفة، وفي تعزيزه الكبير لنقل الجينات بوساطة Agrobacterium. وإلى جانب تطبيق SAAT بنجاح في تحويل Chenopodium rubrum L. وBeta vulgaris L.، استُخدم هذا النهج أيضًا في إنتاج الهولوذيفان المؤتلف غير الثابت حراريًا للنمط البري من Escherichia coli، ومساعدات اللقاح LT الطافرة من Escherichia coli في Nicotiana tabacum، حيث كُشفت أعلى عيارات IgG الجهازية النوعية لـ LT-B في الطيور.
(راجع Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

الإجراء العام لنقل الجينات عبر التثقيب بالموجات فوق الصوتية في الخلايا النباتية

1. تحضير المادة الوراثية: ابدأ بتحضير المادة الوراثية التي تريد إدخالها إلى الخلايا النباتية. وقد تكون هذه المادة DNA بلازميديًا أو RNA أو أحماضًا نووية أخرى.
2. عزل الخلايا النباتية: اعزل الخلايا النباتية التي تريد استهدافها. ويمكن عزل هذه الخلايا من أنسجة نباتية أو مزارع خلوية، بحسب تجربتك.
3. المعلق الخلوي: علّق الخلايا النباتية في وسط مناسب أو محلول منظّم. وهذا ضروري لضمان سلامة الخلايا ووجودها في حالة ملائمة لاستيعاب الجينات.
4. إعداد جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية: جهّز جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية المزود بمسبار، من خلال ضبط معلمات المعالجة مسبقًا، مثل السعة والزمن والطاقة ودرجة الحرارة. اغمر المسبار فوق الصوتي في المعلق الخلوي.
5. المعالجة بالموجات فوق الصوتية: ابدأ إجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية. يولّد الاهتزاز السريع لطرف المسبار فقاعات تجويف في السائل. وتتمدد هذه الفقاعات وتنهار بفعل الموجات فوق الصوتية، مما يولّد قوى ميكانيكية وتيارات مجهرية في المعلق.
6. التثقيب بالموجات فوق الصوتية: تُحدث القوى الميكانيكية والتيارات المجهرية الناتجة عن التجويف مسامًا وثقوبًا مؤقتة في أغشية الخلايا النباتية. ويمكن للمادة الوراثية الموجودة في المعلق أن تدخل الخلايا النباتية عبر هذه المسام.
7. الحضانة: بعد المعالجة بالتثقيب بالموجات فوق الصوتية، احضن الخلايا النباتية لإتاحة تعافيها واستقرار أغشيتها. وهذه خطوة حاسمة لضمان بقاء الخلايا ونجاح نقل الجينات.

نقل الجينات عبر Agrobacterium أو الجسيمات الشحمية

توجد طريقتان شائعتان لإدخال المادة الوراثية إلى الخلايا النباتية. وتستخدمان إما Agrobacterium، وهو جنس من البكتيريا سالبة الغرام، أو الجسيمات الشحمية ناقلًا للمادة الوراثية.

• التثقيب بالموجات فوق الصوتية بوساطة Agrobacterium: تُعد Agrobacterium tumefaciens بكتيريا شائعة الاستخدام في الهندسة الوراثية النباتية. وفي هذه الطريقة، يُدخل DNA البلازميدي المحتوي على الجين المطلوب إلى Agrobacterium، ثم تُخلط هذه البكتيريا بالخلايا النباتية. ويُخضع المعلق الخلوي للتثقيب بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية مزود بمسبار. وتعزز الطاقة فوق الصوتية انتقال المادة الوراثية من Agrobacterium إلى الخلايا النباتية. وتُستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع للتعديل الوراثي للنباتات.
• التثقيب بالموجات فوق الصوتية بوساطة الجسيمات الشحمية: الجسيمات الشحمية حويصلات قائمة على الدهون يمكنها حمل المادة الوراثية. وفي هذه الطريقة، تُخلط الجسيمات الشحمية المحمّلة بـ DNA بلازميدي أو أحماض نووية أخرى بالخلايا النباتية. ويُستخدم التثقيب بالموجات فوق الصوتية بواسطة جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية مزود بمسبار لتسهيل استيعاب الخلايا النباتية للجسيمات الشحمية. وتفكك الموجات فوق الصوتية الطبقات الدهنية الثنائية للجسيمات الشحمية، مطلقةً المادة الوراثية إلى الخلايا النباتية. ويفيد هذا النهج في دراسات التعبير الجيني العابر في الخلايا النباتية.

الفوائد المثبتة علميًا للتحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT)

طُبّق التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT) على أنواع نباتية عديدة. وتسبب معالجة قصيرة ولطيفة نسبيًا بالموجات فوق الصوتية لمزارع الخلايا النباتية تثقيبًا بالموجات فوق الصوتية، مما يسمح لاحقًا بنفاذ Agrobacterium بعمق بوصفه ناقلًا للجينات. ويمكنك أدناه الاطلاع على أمثلة لدراسات تبيّن التأثيرات المفيدة لـ SAAT.

تحويل الأشواغاندا بمساعدة الموجات فوق الصوتية

لتحسين كفاءة التحول في W. somnifera (المعروفة باسم الأشواغاندا أو الكرز الشتوي)، درس Dehdashti وزملاؤه (2016) استخدام الأسيتوسيرينغون (AS) والمعالجة بالموجات فوق الصوتية.
أُضيف الأسيتوسيرينغون (AS) في ثلاث مراحل: المزرعة السائلة لـ Agrobacterium، والإصابة بـ Agrobacterium، والزراعة المشتركة للأجزاء النباتية المستأصلة مع Agrobacterium. ووُجد أن إضافة 75 μM AS إلى المزرعة السائلة لـ Agrobacterium هي المثلى لتحفيز جينات vir.
أدى التطبيق الإضافي للمعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT) إلى أعلى تعبير جيني. ووُجد أن تعبير جين gusA في الجذور الشعرية كان الأفضل عند معالجة الأوراق وقمم الأفرع بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 و20s، على التوالي. وسُجلت كفاءة التحول للبروتوكول المحسّن عند 66.5 و59.5% للأجزاء المستأصلة من الأوراق وقمم الأفرع، على التوالي. وبالمقارنة مع بروتوكولات أخرى، وُجد أن كفاءة التحول لهذا البروتوكول المحسّن أعلى بمقدار 2.5 ضعف للأوراق و3.7 ضعف لقمم الأفرع. وأكدت تحليلات لطخة ساوثرن وجود 1–2 نسخة من الجين المنقول gusA في السلالات W1-W4، في حين كُشفت 1–4 نسخ من الجين المنقول في السلالة W5 الناتجة باستخدام البروتوكول المحسّن.

تأثير مدة التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT) في تواتر التحول في الأجزاء المستأصلة من أوراق (a) وقمم أفرع (b) W. somnifera
(الدراسة والرسم: © Dehdashti et al., 2016)

تحويل القطن بمساعدة الموجات فوق الصوتية

يبيّن Hussain et al. (2007) التأثيرات المفيدة لتحويل القطن بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية. ويُحدث التجويف الصوتي الناتج عن الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد جروحًا مجهرية على سطح الأنسجة النباتية وتحته (التثقيب بالموجات فوق الصوتية)، ويسمح لـ Agrobacterium بالانتقال إلى أعماق أكبر وفي كامل الأنسجة النباتية. ويزيد هذا النمط من إحداث الجروح احتمال إصابة الخلايا النباتية الواقعة في عمق النسيج. ولتقييم كفاءة التحول باستخدام SAAT، قيس تعبير جين GUS. ونظام المراسل GUS هو نظام جين مراسل، مفيد خصوصًا في علم الأحياء الجزيئي النباتي وعلم الأحياء الدقيقة. ومن خلال ضبط معلمات SAAT المختلفة، تعزز التعبير العابر لـ GUS في القطن بدرجة كبيرة باستخدام الأجنة الناضجة أجزاءً نباتية مستأصلة. وكُشف GUS لأول مرة بعد 24h من حضانة الأجزاء المستأصلة، وبحلول 48h كان تعبير GUS شديدًا للغاية، مما شكّل مؤشرًا مفيدًا على نجاح تحول الجزء المستأصل من القطن بعد التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT). وعند مقارنة تقنيات التحول المختلفة (وهي القذف الجيني، وAgro، وBAAT، وSAAT)، أظهر التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT) أفضل نتائج التحول بفارق كبير.

اختيار إجراء التحول بناءً على التعبير العابر لـ GUS. يُظهر التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (SAAT) تعبيرًا عابرًا أعلى بدرجة كبيرة.
(الدراسة والرسم: © Hussain et al., 2007)

حلول عالية الأداء بالموجات فوق الصوتية للتثقيب بالموجات فوق الصوتية وSAAT

تتمتع Hielscher Ultrasonics بخبرة طويلة في تطوير وتصنيع أجهزة معالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء للمختبرات والمرافق البحثية، وكذلك للإنتاج الصناعي بمعدلات معالجة مرتفعة للغاية. وتقدم Hielscher حلولًا متنوعة لعلم الأحياء الدقيقة وعلوم الحياة، لتلبية المتطلبات المختلفة اللازمة لأنسجة محددة ومعالجاتها. وللمعالجة المتزامنة بالموجات فوق الصوتية لعينات عديدة، تقدم Hielscher جهاز UIP400MTP للصفائح متعددة الآبار، وجهاز VialTweeter لمعالجة ما يصل إلى 10 قوارير بالموجات فوق الصوتية (مثل أنابيب Eppendorf)، أو جهاز CupHorn بالموجات فوق الصوتية. وتتراوح قدرات أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية المزودة بمسبار من 50 إلى 400 واط للمجانسات المختبرية، ومن 500 واط إلى 16kW للأنظمة الصناعية.
يُرجى التواصل معنا وإطلاعنا على تطبيقك ومتطلبات عمليتك. وسيسر موظفينا ذوي الخبرة الواسعة أن يوصوا بجهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية الأنسب لعمليتك البيولوجية.
يعطيك الجدول أدناه مؤشرًا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزتنا للمعالجة بالموجات فوق الصوتية: