التحول بوساطة الفاعلية الصوتية بمساعدة الصوت (SAAT) هو طريقة فعالة لإصابة الخلايا النباتية بجينات أجنبية باستخدام Agrobacterium كناقل. التجويف بالموجات فوق الصوتية يسبب sonoporation ، والتي يمكن وصفها بأنها الجرح الجزئي المستهدف للأنسجة النباتية. من خلال هذه الموجات فوق الصوتية يخلق جروح صغيرة ، يمكن نقل ناقلات الحمض النووي والحمض النووي بكفاءة إلى مصفوفة الخلية.

سونوبوراتيون – تحويل الخلايا المحسن بالموجات فوق الصوتية

عندما يتم تطبيق الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد (حوالي 20 كيلو هرتز) على معلقات الخلايا ، فإن تأثيرات التجويف الصوتي تسبب تخلل غشاء عابر على أنسجة الخلايا. يعرف هذا التأثير بالموجات فوق الصوتية باسم sonoporation ويستخدم لنقل الجينات إلى الخلايا أو الأنسجة.
تعتمد مزايا الموجات فوق الصوتية على مبدأ العمل الميكانيكي غير الحراري ، مما يجعل الصوتنة في كثير من الأحيان أكثر تنوعا وأقل اعتمادا على أنواع الخلايا. يفتح التطبيق متعدد الاستخدامات للرنين إمكانية استخدام النباتات المعدلة وراثيا ، والتي لها إمكانات كبيرة في الإنتاج الحيوي للبروتينات العلاجية البشرية المعقدة. ويمكن التلاعب بسهولة هذه المفاعلات الحيوية النباتية وراثيا، ومنع التلوث المحتمل بمسببات الأمراض البشرية، وعدم إتلاف البكتيريا التي تتوسط التحول (مثل Agrobacterium)، وهي طريقة غير مكلفة وفعالة للتخليق الحيوي.

تحويل الخلايا بمساعدة الموجات فوق الصوتية

الصوتنة هي تقنية تطبق الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد لتحريك الجسيمات في المحلول ، لخلط المحاليل ، وبالتالي زيادة معدل نقل الكتلة والذوبان. في الوقت نفسه ، يمكن للصوتنة إزالة الغازات الذائبة من السوائل. في تحول النبات ، سوف يسبب الصوتنة تكوين جروح دقيقة على الأنسجة النباتية وتعزيز توصيل الحمض النووي العاري إلى بروتوبلاست النبات.

بالنسبة للتحول الجيني ، فإن التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة Sonication (SAAT) هو الطريقة المفضلة ولديه كفاءة أعلى بكثير من الصوتنة المستخدمة لنقل الحمض النووي العاري وناقلات الحمض النووي مباشرة إلى protoplast. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن التحول بمساعدة الصوتنة بوساطة Agrobacterium (SAAT) يمكن استخدامه للحث على الاضطراب الميكانيكي وتشكيل الجروح على الخلايا النباتية بواسطة الموجات فوق الصوتية والتجويف الصوتي الناتج. علاج قصير بالموجات فوق الصوتية يخلق جروحا صغيرة على سطح explants. كما أن الخلايا المصابة ستسمح باختراق Agrobacterium في الجزء الأعمق من الأنسجة النباتية ، مما يزيد من احتمال إصابة الخلايا النباتية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المركبات الفينولية المفرزة تعزز التحول. الجروح الدقيقة المتولدة بالموجات فوق الصوتية تجعل اختراق البكتيريا للزرع أكثر جدوى أيضا. تم استخدام SAAT بنجاح للتحول الوراثي في الأنواع النباتية التي تعتبر بشكل خاص مقاومة للبكتيريا الزراعية.
كونها طريقة بسيطة للغاية وغير مكلفة ، فضلا عن التعزيز الكبير لنقل الجينات بوساطة Agrobacterium هي المزايا الرئيسية ل SAAT. وبصرف النظر عن التطبيق الناجح ل SAAT في تحويل Chenopodium rubrum L. و Beta vulgaris L. ، تم تطبيق هذا النهج أيضا في إنتاج المواد المساعدة المؤتلفة من نوع الإشريكية القولونية البرية من نوع الهولوتوكسين الحراري ولقاح LT المتحور من الإشريكية القولونية في Nicotiana tabacum ، حيث تم اكتشاف أعلى عيارات IgG الجهازية LT-B في الطيور.
(راجع Laere et al.، 2016؛ M. Klimek-Chodacka and R. Baranski، 2014)

الإجراء العام لنقل الجينات عن طريق الموجات فوق الصوتية في الخلايا النباتية

1. تحضير المادة الوراثية: ابدأ بتحضير المادة الوراثية التي تريد إدخالها في الخلايا النباتية. يمكن أن يكون هذا الحمض النووي البلازميدي أو الحمض النووي الريبي أو الأحماض النووية الأخرى.
2. عزل الخلايا النباتية: اعزل الخلايا النباتية التي تريد استهدافها. اعتمادا على تجربتك، قد يتم عزل هذه الخلايا من الأنسجة النباتية أو المزارع.
3. تعليق الخلية: تعليق الخلايا النباتية في وسط مناسب أو عازلة. هذا ضروري للتأكد من أن الخلايا صحية وفي حالة مواتية لامتصاص الجينات.
4. قم بإعداد سيارة سونيكاتور الخاصة بك: قم بإعداد صوتنة من نوع المسبار عن طريق معلمات الإعداد المسبق للصوتنة مثل السعة والوقت والطاقة ودرجة الحرارة. اغمر المسبار بالموجات فوق الصوتية في تعليق الخلية.
5. صوتنة: بدء إجراء صوتنة. يولد التذبذب السريع لطرف المسبار فقاعات تجويف في السائل. تتوسع هذه الفقاعات وتنهار بسبب الموجات فوق الصوتية ، مما يخلق قوى ميكانيكية وتدفق دقيق في التعليق.
6. سونوبوريشن: تخلق القوى الميكانيكية والتدفق الدقيق الناتج عن التجويف مسام وثقوبا مؤقتة في أغشية الخلايا النباتية. يمكن للمادة الوراثية الموجودة في المعلق أن تدخل الخلايا النباتية عبر هذه المسام.
7. حضانة المرض: بعد العلاج بالسننوبوريشن ، احتضان الخلايا النباتية للسماح لها باستعادة واستقرار أغشيتها. هذه خطوة حاسمة لضمان بقاء الخلية ونقل الجينات بنجاح.

نقل الجينات عن طريق البكتيريا الزراعية أو الجسيمات الشحمية

هناك نوعان شائعان لنقل الخلايا النباتية. يستخدمون إما agrobacterium ، جنس من البكتيريا سالبة الجرام ، أو الجسيمات الشحمية كحامل للمادة الوراثية.

• Agrobacterium بوساطة Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens هي بكتيريا شائعة الاستخدام في الهندسة الوراثية النباتية. في هذه الطريقة ، يتم إدخال الحمض النووي البلازميد الذي يحتوي على الجين المطلوب في Agrobacterium ، والذي يتم خلطه بعد ذلك مع الخلايا النباتية. يخضع تعليق الخلية للسونوبوريشن باستخدام صوتنة من نوع المسبار. تعزز الطاقة فوق الصوتية نقل المادة الوراثية من Agrobacterium إلى الخلايا النباتية. تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع للتعديل الوراثي للنباتات.
• الموجات فوق الصوتية بوساطة الجسيمات الشحمية: الجسيمات الشحمية هي حويصلات قائمة على الدهون يمكن أن تحمل المادة الوراثية. في هذه الطريقة ، يتم خلط الجسيمات الشحمية المحملة بالحمض النووي البلازميد أو الأحماض النووية الأخرى مع الخلايا النباتية. يتم استخدام Sonoporation باستخدام صوتنة من نوع المسبار لتسهيل امتصاص الجسيمات الشحمية من قبل الخلايا النباتية. تعمل الموجات فوق الصوتية على تعطيل الطبقات الثنائية الدهنية للجسيمات الشحمية ، وإطلاق المادة الوراثية في الخلايا النباتية. هذا النهج مفيد لدراسات التعبير الجيني العابر في الخلايا النباتية.

الفوائد المثبتة علميا للتحول بوساطة البكتيريا الزراعية بمساعدة الصوتنة (SAAT)

تم تطبيق التحول بوساطة البكتيريا الزراعية بمساعدة سونيكشن (SAAT) على العديد من الأنواع النباتية. علاج بالموجات فوق الصوتية قصيرة وخفيفة نسبيا من مزارع الخلايا النباتية يسبب sonoporation ، والذي يسمح في وقت لاحق اختراق عميق من Agrobacterium كناقل الجينات. أدناه يمكنك قراءة الدراسات النموذجية التي توضح الآثار المفيدة ل SAAT.

التحول بمساعدة الموجات فوق الصوتية من اشواغاندا

من أجل تحسين كفاءة التحول في W. somnifera (المعروفة باسم أشواغاندا أو الكرز الشتوي) ، قام Dehdashti وزملاؤه (2016) بالتحقيق في استخدام الأسيتوسيرينجون (AS) والصوتنة.
تمت إضافة Acetosyringone (AS) على ثلاث مراحل: ثقافة سائلة Agrobacterium ، عدوى Agrobacterium و co culture of explants with Agrobacterium. تم العثور على إضافة 75 ميكرومتر AS إلى ثقافة السائل Agrobacterium لتكون الأمثل لتحريض الجينات الفيروسية.
أدى التطبيق الإضافي للصوتنة (SAAT) إلى أعلى تعبير جيني. تم العثور على التعبير الجيني gusA في الجذور المشعرة ليكون أفضل عندما تم صوتنة الأوراق ونصائح تبادل لاطلاق النار لمدة 10 و 20s ، على التوالي. تم تسجيل كفاءة تحويل البروتوكول المحسن بنسبة 66.5 و 59.5٪ في حالة إزالة الأوراق وأطراف البراعم ، على التوالي. عند مقارنتها بالبروتوكولات الأخرى ، وجد أن كفاءة التحويل لهذا البروتوكول المحسن أعلى بمقدار 2.5 مرة للأوراق و 3.7 أضعاف أكثر لنصائح التصوير. أكدت تحليلات اللطخة الجنوبية 1-2 نسخة من الجين الوراثي gusA في الخطوط W1-W4 ، في حين تم اكتشاف 1-4 نسخ من الجينات المحورة في الخط W5 الناتج عن البروتوكول المحسن.

تأثير مدة التحول بوساطة البكتريا بمساعدة الصوتنة (SAAT) على تواتر تحول أوراق W. somnifera (أ) وطرف التصويب (ب)
(دراسة ورسم: © دهدشتي وآخرون، 2016)

تحويل القطن بمساعدة الموجات فوق الصوتية

يوضح حسين وآخرون (2007) الآثار المفيدة لتحويل القطن بمساعدة الصوتنة. يخلق التجويف الصوتي الناجم عن الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد جروحا دقيقة على سطح الأنسجة النباتية وتحتها (sonoporation) ويسمح ل Agrobacterium بالسفر بشكل أعمق وكامل في جميع أنحاء الأنسجة النباتية. تزيد موضة الجرح هذه من احتمال إصابة الخلايا النباتية الموجودة في عمق الأنسجة. من أجل تقييم كفاءة التحول في SAAT ، تم قياس التعبير الجيني GUS. نظام مراسل GUS هو نظام جيني مراسل ، مفيد بشكل خاص في البيولوجيا الجزيئية النباتية وعلم الأحياء الدقيقة. من خلال ضبط معلمات SAAT المختلفة ، تم تعزيز التعبير العابر GUS في القطن باستخدام الأجنة الناضجة كزرع خارجي بشكل كبير. تم اكتشاف GUS لأول مرة على مدار 24 ساعة بعد حضانة البثور وبحلول 48 ساعة ، كان تعبير GUS مكثفا للغاية والذي كان بمثابة مؤشر مفيد للتحول الناجح لإكسبات القطن بعد التحول بمساعدة الصوتنة Agrobacterium بوساطة (SAAT). أظهرت المقارنة بين تقنيات التحويل المختلفة (وهي البيولوجية، والزراعية، وBAAT، وSAAT)، والتحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة الصوتنة (SAAT) إلى حد بعيد أفضل نتائج التحول.

اختيار إجراء التحويل على أساس التعبير العابر عن GUS. يظهر التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة الصوت (SAAT) تعبيرا عابرا أعلى بكثير.
(دراسة ورسم: © حسين وآخرون، 2007)

حلول الموجات فوق الصوتية عالية الأداء ل Sonoporation و SAAT

تتمتع Hielscher Ultrasonics بخبرة طويلة في تطوير وتصنيع أجهزة الموجات فوق الصوتية عالية الأداء للمختبرات ومرافق البحوث وكذلك الإنتاج الصناعي مع إنتاجية عالية جدا. بالنسبة لعلم الأحياء الدقيقة وعلوم الحياة ، تقدم Hielscher حلولا مختلفة لاستيعاب المتطلبات المختلفة اللازمة لأنسجة معينة وعلاجاتها. للحصول على الموجات فوق الصوتية المتزامنة للعديد من العينات ، تقدم Hielscher UIP400MTP للوحات متعددة الآبار ، أو VialTweeter لصوتنة ما يصل إلى 10 قوارير (على سبيل المثال ، أنابيب Eppendorf) أو CupHorn بالموجات فوق الصوتية. تتوفر أجهزة الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار من 50 إلى 400 واط كمجانسات مختبرية ، بينما تغطي الأنظمة الصناعية نطاق الطاقة من 500 واط إلى 16 كيلو واط.
يرجى الاتصال بنا وإعلامنا بمتطلبات طلبك والعملية. سيكون من دواعي سرور موظفينا ذوي الخبرة الجيدة أن يوصوا بالموجات فوق الصوتية الأنسب للعملية البيولوجية الخاصة بك.
الجدول أدناه يعطيك مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لultrasonicators لدينا: