التحول الوراثي في الخلايا النباتية باستخدام الموجات فوق الصوتية

يعد التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة Sonication (SAAT) طريقة فعالة لإصابة الخلايا النباتية بجينات غريبة باستخدام Agrobacterium كناقل. التجويف بالموجات فوق الصوتية يسبب sonoporation ، والتي يمكن وصفها بأنها الجرح الجزئي المستهدف للأنسجة النباتية. من خلال هذه الجروح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية ، يمكن نقل ناقلات الحمض النووي والحمض النووي بكفاءة إلى مصفوفة الخلية.

سونوبوريشن – تحويل الخلايا المعززة بالموجات فوق الصوتية

عندما يتم تطبيق الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد (حوالي 20 كيلو هرتز) على معلقات الخلايا ، فإن تأثيرات التجويف الصوتي تسبب نفاذية غشاء عابرة على أنسجة الخلايا. يعرف هذا التأثير بالموجات فوق الصوتية باسم sonoporation ويستخدم لنقل الجينات إلى الخلايا أو الأنسجة.
وتستند مزايا الموجات فوق الصوتية على مبدأ العمل الميكانيكية غير الحرارية ، مما يجعل صوتنة في كثير من الأحيان أكثر تنوعا وأقل اعتمادا على أنواع الخلايا. يفتح التطبيق المتنوع للسونوبوريشن إمكانية استخدام النباتات المعدلة وراثيا ، والتي لديها إمكانات كبيرة في الإنتاج الحيوي للبروتينات العلاجية البشرية المعقدة. يمكن التلاعب بهذه المفاعلات الحيوية النباتية وراثيا بسهولة ، ومنع التلوث المحتمل بمسببات الأمراض البشرية ، وعدم إتلاف البكتيريا الوسيطة للتحول (مثل Agrobacterium) ، وهي طريقة غير مكلفة وفعالة للتخليق الحيوي.

تحويل الخلايا بمساعدة الموجات فوق الصوتية

Sonication هي تقنية تطبق الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد لإثارة الجسيمات في المحلول ، لخلط المحاليل ، وبالتالي زيادة معدل نقل الكتلة والذوبان. في الوقت نفسه ، يمكن صوتنة إزالة الغازات الذائبة من السوائل. في تحول النبات ، سوف يتسبب الصوتنة في تكوين الجروح الدقيقة على الأنسجة النباتية وتعزيز توصيل الحمض النووي العاري إلى البروتوبلاست النباتية.

بالنسبة للتحول الجيني ، فإن التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة Sonication (SAAT) هو الطريقة المفضلة وله كفاءة أعلى بكثير من الصوتنة المستخدمة لنقل نواقل الحمض النووي والحمض النووي العارية مباشرة إلى البروتوبلاست. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن التحول بمساعدة Agrobacterium (SAAT) يمكن استخدامها للحث على تعطيل ميكانيكي وتشكيل الجروح على الخلايا النباتية عن طريق الموجات فوق الصوتية والتجويف الصوتي الناتج. العلاج بالموجات فوق الصوتية القصيرة يخلق جروحا دقيقة على سطح النباتات. حيث أن الخلايا المصابة ستسمح باختراق Agrobacterium في الجزء الأعمق من الأنسجة النباتية ، مما يزيد من احتمال إصابة الخلايا النباتية. بالإضافة إلى ذلك ، تعزز المركبات الفينولية المفرزة التحول. الجروح الدقيقة التي تم إنشاؤها بالموجات فوق الصوتية تجعل اختراق البكتيريا أكثر جدوى أيضا. تم استخدام SAAT بنجاح للتحول الوراثي في الأنواع النباتية التي تعتبر مقاومة بشكل خاص للبكتيريا الزراعية.
كونها طريقة بسيطة للغاية وغير مكلفة ، فضلا عن التعزيز الكبير لنقل الجينات بوساطة Agrobacterium هي المزايا الرئيسية ل SAAT. بصرف النظر عن التطبيق الناجح ل SAAT في تحويل Chenopodium rubrum L. و Beta vulgaris L. ، تم تطبيق هذا النهج أيضا في إنتاج الهوتوكسين المؤتلف من النوع البري من الإشريكية القولونية ومواد مساعدة لقاح LT الطافرة للإشريكية القولونية في Nicotiana tabacum ، حيث تم اكتشاف أعلى عيارات IgG الجهازية الخاصة ب LT-B في الطيور.
(راجع Laere et al.، 2016؛ M. Klimek-Chodacka and R. Baranski، 2014)

الإجراء العام لنقل الجينات عن طريق الموجات فوق الصوتية في الخلايا النباتية

1. تحضير المادة الوراثية: ابدأ بتحضير المادة الوراثية التي تريد إدخالها في الخلايا النباتية. يمكن أن يكون هذا الحمض النووي البلازميد أو الحمض النووي الريبي أو الأحماض النووية الأخرى.
2. عزل الخلايا النباتية: اعزل الخلايا النباتية التي تريد استهدافها. اعتمادا على تجربتك، قد يتم عزل هذه الخلايا من الأنسجة النباتية أو المزارع.
3. تعليق الخلية: تعليق الخلايا النباتية في وسط مناسب أو عازلة. هذا ضروري للتأكد من أن الخلايا صحية وفي حالة مواتية لامتصاص الجينات.
4. قم بإعداد سيارة سونيكاتور الخاصة بك: قم بإعداد صوتنة من نوع المسبار عن طريق معلمات الإعداد المسبق للصوتنة مثل السعة والوقت والطاقة ودرجة الحرارة. اغمر المسبار بالموجات فوق الصوتية في تعليق الخلية.
5. صوتنة: بدء إجراء صوتنة. التذبذب السريع لطرف المسبار يولد فقاعات تجويف في السائل. تتوسع هذه الفقاعات وتنهار بسبب الموجات فوق الصوتية ، مما يخلق قوى ميكانيكية وتدفق دقيق في التعليق.
6. سونوبوريشن: تخلق القوى الميكانيكية والتدفق الدقيق الناتج عن التجويف مسام وثقوبا مؤقتة في أغشية الخلايا النباتية. يمكن للمادة الوراثية الموجودة في المعلق أن تدخل الخلايا النباتية عبر هذه المسام.
7. حضانة المرض: بعد العلاج بالسننوبوريشن ، احتضان الخلايا النباتية للسماح لها باستعادة واستقرار أغشيتها. هذه خطوة حاسمة لضمان بقاء الخلية ونقل الجينات بنجاح.

نقل الجينات عن طريق البكتيريا الزراعية أو الجسيمات الشحمية

هناك نوعان شائعان لنقل الخلايا النباتية. يستخدمون إما agrobacterium ، جنس من البكتيريا سالبة الجرام ، أو الجسيمات الشحمية كحامل للمادة الوراثية.

• Agrobacterium بوساطة Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens هي بكتيريا شائعة الاستخدام في الهندسة الوراثية النباتية. في هذه الطريقة ، يتم إدخال الحمض النووي البلازميد الذي يحتوي على الجين المطلوب في Agrobacterium ، والذي يتم خلطه بعد ذلك مع الخلايا النباتية. يخضع تعليق الخلية للسونوبوريشن باستخدام صوتنة من نوع المسبار. تعزز الطاقة فوق الصوتية نقل المادة الوراثية من Agrobacterium إلى الخلايا النباتية. تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع للتعديل الوراثي للنباتات.
• الموجات فوق الصوتية بوساطة الجسيمات الشحمية: الجسيمات الشحمية هي حويصلات قائمة على الدهون يمكن أن تحمل المادة الوراثية. في هذه الطريقة ، يتم خلط الجسيمات الشحمية المحملة بالحمض النووي البلازميد أو الأحماض النووية الأخرى مع الخلايا النباتية. يتم استخدام Sonoporation باستخدام صوتنة من نوع المسبار لتسهيل امتصاص الجسيمات الشحمية من قبل الخلايا النباتية. تعمل الموجات فوق الصوتية على تعطيل الطبقات الثنائية الدهنية للجسيمات الشحمية ، وإطلاق المادة الوراثية في الخلايا النباتية. هذا النهج مفيد لدراسات التعبير الجيني العابر في الخلايا النباتية.

فوائد مثبتة علميا للتحول بوساطة البكتيريا الزراعية بمساعدة Sonication (SAAT)

تم تطبيق التحول بوساطة البكتيريا الزراعية بمساعدة Sonication (SAAT) على العديد من الأنواع النباتية. العلاج بالموجات فوق الصوتية القصيرة والمعتدلة نسبيا لثقافات الخلايا النباتية يسبب sonoporation ، والذي يسمح في وقت لاحق تغلغل عميق من Agrobacterium كناقل الجينات. أدناه يمكنك قراءة الدراسات النموذجية التي توضح الآثار المفيدة ل SAAT.

التحول بمساعدة الموجات فوق الصوتية من اشواغاندا

من أجل تحسين كفاءة التحول في W. somnifera (المعروفة باسم أشواغاندا أو الكرز الشتوي) ، قام Dehdashti وزملاؤه (2016) بالتحقيق في استخدام الأسيتوسيرينجون (AS) والصوتنة.
تمت إضافة الأسيتوسيرينجون (AS) على ثلاث مراحل: الثقافة السائلة Agrobacterium ، عدوى Agrobacterium والاستزراع المشترك للنباتات مع Agrobacterium. تم العثور على إضافة 75 ميكرومتر AS إلى مزرعة سائل Agrobacterium ليكون الأمثل لتحريض جينات vir.
أدى التطبيق الإضافي للصوتنة (SAAT) إلى أعلى تعبير جيني. تم العثور على التعبير الجيني gusA في الجذور المشعرة ليكون أفضل عندما تم صوتنة الأوراق وأطراف تبادل لاطلاق النار لمدة 10 و 20 ثانية ، على التوالي. تم تسجيل كفاءة تحويل البروتوكول المحسن بنسبة 66.5 و 59.5٪ في حالة نباتات الأوراق وأطراف البراعم ، على التوالي. عند مقارنتها بالبروتوكولات الأخرى ، وجد أن كفاءة التحويل لهذا البروتوكول المحسن أعلى بمقدار 2.5 مرة للأوراق و 3.7 أضعاف لأطراف التصوير. أكدت تحليلات اللطخة الجنوبية 1-2 نسخة من جين التحوير gusA في الخطوط W1-W4 ، بينما تم اكتشاف 1-4 نسخ من جين التحوير في الخط W5 الناتج عن البروتوكول المحسن.

تأثير مدة التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة الصوتنة (SAAT) على تردد التحول لأوراق W. somnifera (a) وطرف الساق (b)
(دراسة ورسم: © دهدشتي وآخرون ، 2016)

التحول بمساعدة الموجات فوق الصوتية من القطن

يوضح حسين وآخرون (2007) الآثار المفيدة لتحويل القطن بمساعدة الصوتنة. يخلق التجويف الصوتي الناجم عن الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد جروحا دقيقة على سطح الأنسجة النباتية وتحتها (sonoporation) ويسمح ل Agrobacterium بالسفر بشكل أعمق وكامل في جميع أنحاء الأنسجة النباتية. تزيد طريقة الجرح هذه من احتمال إصابة الخلايا النباتية الموجودة في عمق الأنسجة. من أجل تقييم كفاءة تحويل SAAT ، تم قياس التعبير الجيني GUS. نظام مراسل GUS هو نظام جيني مراسل ، مفيد بشكل خاص في البيولوجيا الجزيئية النباتية وعلم الأحياء الدقيقة. بتعديل معلمات SAAT المختلفة ، تم تحسين التعبير العابر GUS في القطن باستخدام الأجنة الناضجة كزرع بشكل كبير. تم اكتشاف GUS لأول مرة بعد 24 ساعة من حضانة النباتات وبحلول 48 ساعة ، كان تعبير GUS مكثفا للغاية والذي كان بمثابة مؤشر مفيد للتحول الناجح لمصنع القطن بعد التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة الصوتنة (SAAT). أظهرت المقارنة بين تقنيات التحول المختلفة (وهي biolistic ، Agro ، BAAT ، SAAT) ، التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة الصوتنة (SAAT) إلى حد بعيد أفضل نتائج التحول.

اختيار إجراء التحويل على أساس التعبير العابر ل GUS. يظهر التحول بوساطة Agrobacterium بمساعدة Sonication (SAAT) تعبيرا عابرا أعلى بكثير.
(دراسة ورسم: © حسين وآخرون ، 2007)

حلول الموجات فوق الصوتية عالية الأداء ل Sonoporation و SAAT

Hielscher Ultrasonics من ذوي الخبرة منذ فترة طويلة في تطوير وتصنيع الموجات فوق الصوتية عالية الأداء للمختبرات ومرافق البحوث وكذلك الإنتاج الصناعي مع إنتاجية عالية جدا. لعلم الأحياء الدقيقة وعلوم الحياة، Hielscher يقدم حلول مختلفة لاستيعاب المتطلبات المختلفة اللازمة لأنسجة معينة وعلاجاتها. للموجات فوق الصوتية في وقت واحد من العديد من العينات Hielscher يقدم UIP400MTP للوحات multiwell، وVialTweeter لصوتنة تصل إلى 10 قارورة (على سبيل المثال، أنابيب Eppendorf) أو بالموجات فوق الصوتية CupHorn. تتوفر الموجات فوق الصوتية من نوع المسبار من 50 إلى 400 واط كمجانسات معملية ، بينما تغطي الأنظمة الصناعية نطاق الطاقة من 500 واط إلى 16 كيلو واط.
يرجى الاتصال بنا وإخبارنا بطلبك ومتطلبات العملية. سيكون من دواعي سرور موظفينا ذوي الخبرة الجيدة أن يوصي بالموجات فوق الصوتية الأنسب لعمليتك البيولوجية.
يمنحك الجدول أدناه مؤشرا على قدرة المعالجة التقريبية لأجهزة الموجات فوق الصوتية لدينا: