Ultraljudsassisterad tunnfilmshydratisering för framställning av liposomer

Liposomer är sfäriska vesiklar som består av ett eller flera fosfolipiddubbelskikt som omsluter en vattenhaltig kärna. Tack vare sin förmåga att inkapsla hydrofila, lipofila och amfifila föreningar används liposomer i stor utsträckning inom läkemedel, nutraceutika, kosmetika och livsmedel. Deras biologiska nedbrytbarhet, biokompatibilitet och icke-immunogena egenskaper gör dem till särskilt attraktiva leveranssystem.
Bland de olika metoderna för framställning av liposomer är tunnfilmshydratisering (TFH) fortfarande en av de mest etablerade och mångsidiga teknikerna. I kombination med kontrollerad ultraljudsbehandling möjliggör denna metod framställning av liposomer i nanostorlek med förbättrad homogenitet, inkapslingseffektivitet och stabilitet.

Ultraljudets roll vid tunnfilmshydratisering

Tunnfilmshydratisering ger inledningsvis främst multilamellära vesiklar (MLV) med relativt stora diametrar och breda storleksfördelningar. På grund av sin storlek uppvisar dessa vesiklar begränsat cellulärt upptag och minskad biotillgänglighet, särskilt i tillämpningar som kräver effektiv membraninteraktion eller vävnadspenetration. Därför används ultraljudsbehandling med sond som ett kontrollerat steg för storleksreduktion för att omvandla MLV till små unilamellära liposomer eller liposomer i nanostorlek med ett snävare polydispersitetsindex. Nanoliposomer vars storlek har reducerats med ultraljud ger ett avsevärt högre förhållande mellan ytarea och volym, förbättrad kolloidal stabilitet och ökad cellulär internalisering, vilket resulterar i överlägsen biotillgänglighet och leveransförmåga.

1. Verkningsmekanism
   Högintensivt ultraljud genererar akustisk kavitation – bildning och kollaps av mikroskopiska bubblor – som ger upphov till lokala skjuvkrafter, mikroströmning och kortvariga höga tryckgradienter.

   Dessa effekter leder till:

   • Sönderdelning av stora multilamellära vesiklar
   • Fragmentering och omorganisation av dubbelskikt
   • Bildning av små unilamellära vesiklar (SUV)
   • Snävare partikelstorleksfördelning

   I nanoliposomala system som framställs genom tunnfilm + ultraljudsdispergering uppnås tillförlitligt genomsnittliga partikeldiametrar i storleksordningen ~80 nm med låg polydispersitet.

2. Processfördelar
   Ultraljudsassisterad TFH ger:
   • Minskad partikelstorlek (nanometerområdet)
   • Lägre polydispersitetsindex (PDI)
   • Ökad inkapslingseffektivitet
   • Förbättrad kolloidal stabilitet
   • Förbättrad termisk och oxidativ stabilitet hos inkapslade föreningar

   Dessa förbättringar är avgörande för att stabilisera oxidationskänsliga bioaktiva ämnen såsom fleromättade fettsyror.

Efter bildningen av en lipidfilm och efterföljande rehydratisering används ultraljudsbehandling för att främja inneslutningen av aktiva ingredienser i liposomerna. Dessutom ger ultraljudsbehandlingen önskad liposomstorlek.

Allmän anvisning: framställning av liposomer genom ultraljudsassisterad tunnfilmshydratisering

1. Material och formulering
   1. Välj fosfolipid (t.ex. lecitin / fosfatidylkolin) och eventuellt kolesterol.
   2. Välj lipidförhållande utifrån stabilitetsbehoven.

   Ett lecitin/kolesterol-förhållande på omkring 40:20 gav stabila nanoliposomer med hög zetapotential och lågt PDI i ett livsmedelsrelaterat system.

2. Upplösning av lipider (organisk fas)
   1. Lös upp fosfolipid + kolesterol i ett flyktigt organiskt lösningsmedel (t.ex. kloroform).
   2. Om funktionella tillsatser kräver ett hjälplösningsmedel, lös upp dem separat (t.ex. i metanol) och kombinera lösningarna.

   Detta tillvägagångssätt beskrivs uttryckligen för liposomer som framställs genom tunnfilmshydratisering med kloroform (lipider) och metanol (tillsats).

3. Bildning av tunnfilm
   1. Överför lipidlösningen till en rundkolv.
   2. Avlägsna lösningsmedlen genom rotationsindunstning vid måttlig temperatur (t.ex. 40 °C) under reducerat tryck tills en torr, homogen film bildas.
4. Hydratisering av lipidfilm
   1. Hydratisera lipidfilmen med en vattenfas som innehåller den aktiva substansen (eller buffert vid framställning av tomma liposomer).
   2. Hydratisera under omrörning och vid förhöjd temperatur (över lipidens fasövergångstemperatur vid behov).

   Exempel från en biomedicinsk formulering: hydrering med HEPES-buffert (pH 7,4) och omrörning vid 60°C i 6 h.

5. Storleksreduktion med ultraljud
   Efter hydreringen innehåller dispersionen vanligtvis multilamellära vesiklar och deras storlek måste reduceras.

   Allmänna rekommendationer för ultraljudsbehandlingssteget:

   • Använd ultraljudsbehandling med sond.
   • Använd pulsad ultraljudsbehandling för att reglera temperaturen.
   • Håll provet i ett isbad eller använd extern kylning.

   Exempel på protokoll för ultraljudsbehandling med Hielschers ultraljudsapparat UP200Ht:
   Totalt 15 min, 10 s PÅ / 5 s AV, 100 W, 100% amplitud. (jfr Truszkowska et al., 2025 och Ahmadi et al, 2021)

6. Valfri efterbehandling
   Beroende på tillämpningen:
   • Avlägsna förening som inte har inkapslats genom centrifugering/filtrering.
   • Tvätta och resuspendera i färsk buffert.

   Exempel: avlägsnande av obundet material genom centrifugering och resuspendering beskrivs för rening av liposomer.

7. Karakterisering
   De bifogade studierna betraktar genomgående följande som väsentliga kvalitetsmått:
   • Partikelstorlek (nm)
   • Polydispersitetsindex (PDI)
   • Zetapotential
   • Inkapslingseffektivitet
   • Morfologi (TEM/SEM)
   • Stabilitet under lagring

   Exempel på resultat som visar god kvalitet hos nanoliposomer omfattar:
   Storlek ≈82 nm, PDI ≈0,06, zetapotential ≈−56 mV, inkapslingseffektivitet ≈76,5%.

   Praktiska anmärkningar
   Kolesterol förbättrar stabiliteten. Studierna anger uttryckligen att tillsats av kolesterol kan förbättra liposomernas stabilitet genom att hämma fosfolipidernas fasövergång.

Fördelar med Hielschers ultraljudssystem för liposomproduktion

Hielscher Ultrasonics erbjuder avancerade ultraljudsprocessorer som är särskilt konstruerade för liposomproduktion i laboratorieskala, pilotskala och full industriell skala. Dessa system är särskilt väl lämpade för ultraljudsassisterad tunnfilmshydrering, där exakt kontroll av den akustiska energin är avgörande för att uppnå en definierad partikelstorlek, snäv storleksfördelning och reproducerbar produktkvalitet.
I laboratorieskala ger Hielschers ultraljudsapparater exakt amplitudreglering, reproducerbar energitillförsel, programmerbar pulsdrift och integrerad temperaturövervakning. Denna kontrollnivå säkerställer jämn kavitationsintensitet och mycket reproducerbar storlek hos nanoliposomerna med utmärkt enhetlighet mellan satser. Sådan processtabilitet är avgörande vid formuleringsutveckling, särskilt när viktiga parametrar som ultraljudsbehandlingstid, akustisk effekt, lipidsammansättning och inkapslingseffektivitet optimeras.

Industriell liposomproduktion

För industriell tillverkning är Hielschers system konstruerade för linjär uppskalning, vilket gör det möjligt att överföra processparametrar som fastställts i laboratorieskala till pilot- och produktionsenheter samtidigt som motsvarande energitäthet och processförhållanden bibehålls. Ultraljudsreaktorer med kontinuerligt flöde möjliggör liposomproduktion med hög genomströmning, jämn energifördelning och kortare bearbetningstider. Systemen är byggda för robust drift dygnet runt, alla dagar i veckan, med hög energieffektivitet och lågt underhållsbehov. Dessutom kan de integreras i produktionsmiljöer som uppfyller GMP-kraven, inklusive system med slutna kretslopp, automatiserade processlinjer och renrumsinstallationer. Dessa egenskaper gör Hielschers ultraljudsteknik lämplig för tillverkning av liposomer för läkemedel, nutraceutiska produkter och livsmedel i industriell skala.

Ultraljudsassisterad tunnfilmshydrering är en mycket effektiv, kontrollerbar och skalbar metod för produktion av nanoliposomer. Vetenskapliga belägg visar att kombinationen av TFH och ultraljud avsevärt förbättrar partikelstorleksfördelningen, inkapslingseffektiviteten och stabiliteten hos känsliga bioaktiva föreningar.
Hielschers ultraljudsapparater ger:

• Exakt energikontroll
• Reproducerbara resultat i nanoskala
• Smidig uppskalning från laboratorium till industriell produktion
• Möjlighet till kontinuerlig bearbetning
• Robust och GMP-kompatibel drift

För forskningslaboratorier som utvecklar avancerade liposomala formuleringar och för industriella tillverkare som producerar högvärdiga läkemedel eller nutraceutiska produkter erbjuder Hielschers ultraljudssystem en tekniskt överlägsen och ekonomiskt skalbar lösning för liposomframställning genom ultraljudsassisterad tunnfilmshydrering.

Tabellen nedan ger en uppfattning om den ungefärliga bearbetningskapaciteten hos våra ultraljudsapparater:

Jämförelse med andra ultraljudsassisterade metoder för liposomframställning

Även om tunnfilmshydrering används i stor utsträckning – särskilt i laboratorier och inom forskning och utveckling – förbättrar ultraljud även flera andra metoder för liposomframställning:

• Omvänd fasavdunstning – Ultraljud förbättrar emulgering och vesikelbildning.
• Etanolinjektionsmetoder – Ultraljudsbehandling finjusterar partikelstorleken och minskar aggregeringen.
• Direkt dispergering av lecitin – Ultraljud möjliggör snabb liposombildning från fosfolipidsuspensioner.
• Sonoporering av förbildade liposomer – Akustisk energi ökar tillfälligt membranets permeabilitet för aktiv inlastning.
• Storleksreduktion efter bildning – Ultraljudsbehandling används rutinmässigt för att reducera multilamellära vesiklar till system i nanoskala.

Ultraljud är därmed inte enbart ett hjälpsteg utan en central möjliggörande teknik inom olika strategier för liposomal produktion.

Konstruktion, tillverkning och rådgivning – ultraljudsapparater tillverkade i Tyskland

Hielschers ultraljudsapparater är allmänt erkända för sin höga kvalitet, robusta konstruktion och avancerade konstruktionsstandarder. Deras hållbarhet och användarvänliga drift möjliggör smidig integrering i industriella produktionsanläggningar. Även under tuffa driftsförhållanden och i krävande miljöer ger Hielschers ultraljudsapparater tillförlitlig prestanda och konsekventa resultat.

Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger stor vikt vid att tillverka högpresterande ultraljudssystem som kombinerar den senaste tekniken med praktisk användbarhet. Alla Hielschers ultraljudsapparater uppfyller CE-kraven och uppfyller dessutom kraven enligt UL, CSA och RoHS.