Sonikacija za izboljšanje razgradnje celic alg in ekstrakcije

Alge, tako makroalge kot mikroalge, vsebujejo številne dragocene spojine, ki se uporabljajo kot hranilna živila, aditivi za živila, gorivo ali surovina za gorivo. Za sproščanje ciljnih snovi iz celic alg je potrebna zmogljiva in učinkovita tehnika razgradnje celic. Ultrazvočni ekstraktorji so zelo učinkoviti in zanesljivi pri ekstrakciji bioaktivnih spojin iz rastlin, alg in gliv. Ultrazvočni ekstraktorji Hielscher, ki so na voljo za laboratorijsko, namizno in industrijsko uporabo, so uveljavljeni pri proizvodnji celičnih ekstraktov v proizvodnji živil, farmacevtskih izdelkov in biogoriv.

Alge kot dragocen vir za prehrano in gorivo

Celice alg so vsestranski vir bioaktivnih in energijsko bogatih spojin, kot so beljakovine, ogljikovi hidrati, lipidi in druge bioaktivne snovi ter alkani. Zato so alge vir hrane in prehranskih spojin ter goriv.
Mikroalge so cenjen vir lipidov, ki se uporabljajo za prehrano in kot surovina za biogoriva (npr. biodizel). Sevi morskega fitoplanktona Dicrateria, kot je Dicrateria rotunda, so znani kot alge, ki proizvajajo bencin in lahko sintetizirajo vrsto nasičenih ogljikovodikov (n‐alkanov) od C₁₀H₂₂ do C₃₈H₇₈, ki se razvrščajo med bencin (C10–C15), dizelska goriva (C16–C20) in kurilna olja (C21–C38).
Zaradi svoje hranilne vrednosti se alge uporabljajo kot »funkcionalna živila« ali »nutracevtiki«. Pomembna mikrohranila, pridobljena iz alg, vključujejo karotenoide astaksantin, fukoksantin in zeaksantin, fukoidan, laminari in druge glukane, ki se med številnimi drugimi bioaktivnimi snovmi uporabljajo kot prehranska dopolnila in farmacevtski izdelki. Karagenan, alginat in drugi hidrokoloidi se uporabljajo kot aditivi za živila. Lipidi alg se uporabljajo kot veganski vir omega-3 ter tudi kot gorivo ali surovina za proizvodnjo biodizla.

Razgradnja celic alg in ekstrakcija z močnostnim ultrazvokom

Ultrazvočni ekstraktorji oziroma preprosto ultrazvočne naprave se uporabljajo za ekstrakcijo dragocenih spojin iz majhnih vzorcev v laboratoriju in za obsežno komercialno proizvodnjo.
Celice alg so zaščitene s kompleksnimi matriksi celičnih sten, ki jih sestavljajo lipidi, celuloza, beljakovine, glikoproteini in polisaharidi. Osnovo večine celičnih sten alg tvori mikrofibrilarna mreža znotraj gelu podobnega beljakovinskega matriksa; nekatere mikroalge pa imajo anorgansko togo steno, sestavljeno iz frustul iz opalnega silicijevega dioksida ali kalcijevega karbonata. Za pridobivanje bioaktivnih spojin iz biomase alg je potrebna učinkovita tehnika razgradnje celic. Poleg tehnoloških dejavnikov ekstrakcije (tj. metode ekstrakcije in opreme) na učinkovitost razgradnje celic alg in ekstrakcije močno vplivajo tudi različni dejavniki, odvisni od alg, kot so sestava celične stene, mesto želene biomolekule v celicah mikroalg in rastna faza mikroalg med zbiranjem.

Kako delujeta ultrazvočna razgradnja celic alg in ekstrakcija?

Ko se visokointenzivni ultrazvočni valovi prek ultrazvočne sonde (znane tudi kot ultrazvočni rog ali sonotroda) vnašajo v tekočino ali suspenzijo, zvočni valovi potujejo skozi tekočino in pri tem ustvarjajo izmenjujoče se cikle visokega in nizkega tlaka. Med temi cikli visokega in nizkega tlaka nastajajo drobni vakuumski mehurčki ali votlinice. Kavitacijski mehurčki nastanejo, ko lokalni tlak med cikli nizkega tlaka pade dovolj globoko pod tlak nasičene pare, katerega vrednost določa natezna trdnost tekočine pri določeni temperaturi. Ti rastejo skozi več ciklov. Ko ti vakuumski mehurčki dosežejo velikost, pri kateri ne morejo več absorbirati energije, mehurček med ciklom visokega tlaka silovito implodira. Implozija kavitacijskih mehurčkov je silovit proces z visoko gostoto energije, ki v tekočini ustvarja močne udarne valove, turbulenco in mikrocurke. Poleg tega lokalno nastajajo zelo visoki tlaki in zelo visoke temperature. Ti ekstremni pogoji zlahka razgradijo celične stene in membrane ter učinkovito, uspešno in hitro sprostijo znotrajcelične spojine. Znotrajcelične spojine, kot so beljakovine, polisaharidi, lipidi, vitamini, minerali in antioksidanti, je tako mogoče učinkovito ekstrahirati z močnostnim ultrazvokom.

Ultrazvočna kavitacija za razgradnjo celic in ekstrakcijo

Pri izpostavljenosti intenzivni ultrazvočni energiji se stena ali membrana katere koli vrste celic (vključno z rastlinskimi celicami, celicami sesalcev, alg, gliv, bakterij itd.) razgradi, mehanske sile ultrazvočne kavitacije z visoko gostoto energije pa celico raztrgajo na manjše delce. Ko se celična stena poruši, se celični metaboliti, kot so beljakovine, lipidi, nukleinske kisline in klorofil, sprostijo tako iz matriksa celične stene kot iz notranjosti celice ter preidejo v okoliško gojišče ali topilo.
Zgoraj opisani mehanizem ultrazvočne oziroma akustične kavitacije močno razgradi celotne celice alg ali plinske in tekočinske vakuole znotraj celic. Ultrazvočna kavitacija, vibracije, turbulenca in mikrotokovi spodbujajo prenos snovi med notranjostjo celice in okoliškim topilom, tako da se biomolekule (tj. metaboliti) učinkovito in hitro sprostijo. Sonikacija je namreč povsem mehanska obdelava, ki ne zahteva agresivnih, strupenih in/ali dragih kemikalij.
Visokointenzivni nizkofrekvenčni ultrazvok ustvarja ekstremne pogoje z visoko gostoto energije, za katere so značilni visoki tlaki, temperature in velike strižne sile. Te fizikalne sile spodbujajo razgradnjo celičnih struktur, da se znotrajcelične spojine sprostijo v medij. Zato se nizkofrekvenčni ultrazvok pogosto uporablja za ekstrakcijo bioaktivnih snovi in goriv iz alg. V primerjavi s konvencionalnimi metodami ekstrakcije, kot so ekstrakcija s topilom, mletje s kroglicami ali visokotlačna homogenizacija, ultrazvočna ekstrakcija izstopa po sproščanju večine bioaktivnih spojin (kot so lipidi, beljakovine, polisaharidi in mikrohranila) iz sonoporirane in razgrajene celice. Ob ustreznih procesnih pogojih ultrazvočna ekstrakcija zagotavlja vrhunske izkoristke ekstrakcije v zelo kratkem času obdelave. Visokozmogljivi ultrazvočni ekstraktorji na primer pri uporabi ustreznega topila dosegajo odlično učinkovitost ekstrakcije iz alg. V kislem ali alkalnem mediju postane celična stena alg porozna in nagubana, kar omogoča večje izkoristke pri nizki temperaturi (pod 60°C) in kratkem času sonikacije (manj kot 3 ure). Kratko trajanje ekstrakcije pri zmernih temperaturah preprečuje razgradnjo fukoidana, zato se pridobi zelo bioaktiven polisaharid.
Sonikacija je tudi metoda za pretvorbo fukoidana z visoko molekulsko maso v fukoidan z nizko molekulsko maso, ki je zaradi svoje razvejitev proste strukture bistveno bolj bioaktiven. Zaradi visoke bioaktivnosti in biološke dostopnosti je fukoidan z nizko molekulsko maso zanimiva spojina za farmacevtske izdelke in sisteme za dostavo zdravil.

Študije primerov: ultrazvočna ekstrakcija spojin iz alg

Učinkovitost ultrazvočne ekstrakcije in optimizacija njenih parametrov sta bili obsežno raziskani. Spodaj so predstavljeni primeri rezultatov ekstrakcije s sonikacijo iz različnih vrst alg.

Ekstrakcija beljakovin iz spiruline z manotermosonikacijo

Raziskovalna skupina prof. Chemata (Univerza v Avignonu) je preučevala učinke manotermosonikacije (MTS) na ekstrakcijo beljakovin (kot je fikocianin) iz suhih cianobakterij Arthrospira platensis (znanih tudi kot spirulina). Manotermosonikacija (MTS) je uporaba ultrazvoka v kombinaciji s povišanimi tlaki in temperaturami za intenziviranje procesa ultrazvočne ekstrakcije.
»Glede na eksperimentalne rezultate je MTS spodbudila prenos snovi (visoka efektivna difuzivnost, De) in omogočila pridobitev 229% več beljakovin (28,42 ± 1,15 g/100 g DW) kot konvencionalni proces brez ultrazvoka (8,63 ± 1,15 g/100 g DW). Z 28,42 g beljakovin na 100 g suhe biomase spiruline v ekstraktu je bil v 6 efektivnih minutah z neprekinjenim procesom MTS dosežen 50% izkoristek pridobivanja beljakovin. Mikroskopska opazovanja so pokazala, da je akustična kavitacija vplivala na filamente spiruline prek različnih mehanizmov, kot so fragmentacija, sonoporacija in razgradnja teksture. Ti različni pojavi olajšajo ekstrakcijo, sproščanje in solubilizacijo bioaktivnih spojin spiruline.« [Vernès et al., 2019]

Posnetki celotnih filamentov spiruline z optično mikroskopijo med časovnim potekom obdelave z MTS. Merilna črtica (slika A) = 50 μm za vse slike.
slika in študija: ©Vernès et al. 2019

Ultrazvočna ekstrakcija fukoidana in glukanov iz Laminaria digitata

Raziskovalna skupina dr. Tiwarija pri TEAGASC je preučevala ekstrakcijo polisaharidov, tj. fukoidana, laminarina in skupnih glukanov, iz makroalge Laminaria digitata z ultrazvočno napravo UIP500hdT. Preučevani parametri ekstrakcije s pomočjo ultrazvoka (UAE) so pomembno vplivali na ravni fukoze, FRAP in DPPH. Pri optimiziranih pogojih temperature (76◦C), časa (10 min) in ultrazvočne amplitude (100%) ter ob uporabi 0,1 M HCl kot topila so bile za fukozo, skupne glukane, FRAP in DPPH dosežene ravni 1060,75 mg/100 g ds, 968,57 mg/100 g ds, 8,70 μM trolox/mg fde oziroma 11,02%. Opisani pogoji UAE so bili nato uspešno uporabljeni pri drugih gospodarsko pomembnih rjavih makroalgah (L. hyperborea in A. nodosum) za pridobivanje ekstraktov, bogatih s polisaharidi. Ta študija dokazuje uporabnost UAE za izboljšanje ekstrakcije bioaktivnih polisaharidov iz različnih vrst makroalg.

Ultrazvočna ekstrakcija fitokemikalij iz F. vesiculosus in P. canaliculata

Raziskovalna skupina García-Vaquera je primerjala različne nove tehnike ekstrakcije, vključno z visokozmogljivo ultrazvočno ekstrakcijo, ultrazvočno-mikrovalovno ekstrakcijo, mikrovalovno ekstrakcijo, ekstrakcijo s hidrotermalno pomočjo in ekstrakcijo s pomočjo visokega tlaka, da bi ocenila učinkovitost ekstrakcije iz vrst rjavih mikroalg Fucus vesiculosus in Pelvetia canaliculata. Za sonikacijo so uporabili ultrazvočni ekstraktor Hielscher UIP500hdT. Analiza izkoristkov ekstrakcije je pokazala, da je ultrazvočna ekstrakcija dosegla najvišje izkoristke večine fitokemikalij iz obeh F. vesiculosus. To pomeni, da so bili najvišji izkoristki spojin, ekstrahiranih iz F. vesiculosus z ultrazvočnim ekstraktorjem UIP500hdT , naslednji: skupna vsebnost fenolov (445,0 ± 4,6 mg ekvivalentov galne kisline/g), skupna vsebnost florotaninov (362,9 ± 3,7 mg ekvivalentov floroglucinola/g), skupna vsebnost flavonoidov (286,3 ± 7,8 mg ekvivalentov kvercetina/g) in skupna vsebnost taninov (189,1 ± 4,4 mg ekvivalentov katehina/g).
V svoji raziskavi je skupina zaključila, da bi bila uporaba ekstrakcije s pomočjo ultrazvoka »v kombinaciji s 50% etanolno raztopino kot ekstrakcijskim topilom lahko obetavna strategija za ekstrakcijo TPC, TPhC, TFC in TTC, hkrati pa bi zmanjšala sočasno ekstrakcijo neželenih ogljikovih hidratov iz obeh vrst, F. vesiculosus in P. canaliculata, z obetavnimi možnostmi uporabe teh spojin kot farmacevtskih izdelkov, nutracevtikov in kozmecevtikov.« [García-Vaquero et al., 2021]

Povečanje merila manotermosonikacije na Univerzi v Avignonu z ultrazvočnimi napravami Hielscher: od laboratorijske opreme UIP1000hdT (A) do opreme za pilotno merilo UIP4000hdT (B, C in D). Na sliki D je shematsko prikazan prečni prerez ultrazvočne pretočne celice FC100K.
slika in študija: ©Vernès et al. 2019

Visokozmogljivi ultrazvočni ekstraktorji za razgradnjo alg

Najsodobnejša ultrazvočna oprema Hielscher omogoča popoln nadzor nad procesnimi parametri, kot so amplituda, temperatura, tlak in vnos energije.
Pri ultrazvočni ekstrakciji je mogoče parametre, kot so velikost delcev surovine, vrsta topila, razmerje med trdno snovjo in topilom ter čas ekstrakcije, spreminjati in optimizirati za najboljše rezultate.
Ker je ultrazvočna ekstrakcija netermična metoda ekstrakcije, se prepreči toplotna razgradnja bioaktivnih sestavin v surovini, kot so alge.
Na splošno prednosti, kot so visok izkoristek, kratek čas ekstrakcije, nizka temperatura ekstrakcije in majhne količine topila, uvrščajo sonikacijo med vrhunske metode ekstrakcije.

Ultrazvočna ekstrakcija: uveljavljena v laboratoriju in industriji

Ultrazvočna ekstrakcija se široko uporablja za ekstrakcijo vseh vrst bioaktivnih spojin iz rastlin, alg, bakterij in celic sesalcev. Uveljavila se je kot preprosta, stroškovno učinkovita in zelo učinkovita metoda, ki druge tradicionalne tehnike ekstrakcije presega z višjimi izkoristki ekstrakcije in krajšim trajanjem obdelave.
Ker so laboratorijski, namizni in povsem industrijski ultrazvočni sistemi lahko dostopni, je ultrazvočna ekstrakcija danes dobro uveljavljena in zaupanja vredna tehnologija. Ultrazvočni ekstraktorji Hielscher so po vsem svetu nameščeni v industrijskih predelovalnih obratih, ki proizvajajo bioaktivne spojine živilske in farmacevtske kakovosti.

Standardizacija procesov s Hielscher Ultrasonics

Ekstrakti iz alg, ki se uporabljajo v živilih, farmacevtskih izdelkih ali kozmetiki, morajo biti proizvedeni v skladu z dobro proizvodno prakso (GMP) in standardiziranimi specifikacijami obdelave. Digitalni ekstrakcijski sistemi Hielscher Ultrasonics so opremljeni z inteligentno programsko opremo, ki omogoča preprosto in natančno nastavljanje ter nadzor procesa sonikacije. Samodejno beleženje podatkov zapisuje vse parametre ultrazvočnega procesa, kot so ultrazvočna energija (skupna in neto energija), amplituda, temperatura in tlak (kadar so nameščeni temperaturni in tlačni senzorji), skupaj z datumskim in časovnim žigom na vgrajeno kartico SD. Tako lahko pregledate vsako ultrazvočno obdelano šaržo. Hkrati sta zagotovljeni ponovljivost in stalno visoka kakovost izdelkov.

Spodnja tabela prikazuje približno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih naprav: