Fermentație asistată cu ultrasunete pentru producția de bioetanol

Fermentația asistată cu ultrasunete poate intensifica producția de bioetanol prin favorizarea descompunerii carbohidraților complecși în zaharuri mai simple, făcându-le mai ușor disponibile pentru ca drojdia să le transforme în etanol. Simultan, sonicarea îmbunătățește și eficiența permeabilității peretelui celular al drojdiei, permițând o eliberare mai rapidă a etanolului și o producție globală crescută. Astfel, fermentația bioetanolului asistată cu ultrasunete conduce la rate de conversie mai mari și la randamente îmbunătățite.

Fermentație

Fermentația poate fi un proces aerob (= fermentație oxidativă) sau anaerob, utilizat în aplicații biotehnologice pentru transformarea materialului organic de către culturi celulare bacteriene, fungice sau alte culturi celulare biologice ori de către enzime. Prin fermentație, energia este extrasă din oxidarea compușilor organici, de ex. a carbohidraților.
Zahărul este cel mai comun substrat al fermentației, din care rezultă după fermentație produse precum acid lactic, lactoză, etanol și hidrogen. În cazul fermentației alcoolice, etanolul – în special pentru utilizare drept combustibil, dar și pentru băuturi alcoolice – este produs prin fermentație. Atunci când anumite tulpini de drojdie, precum Saccharomyces cerevisiae metabolizează zahărul, celulele de drojdie transformă materia primă în etanol și dioxid de carbon.

Ecuațiile chimice de mai jos rezumă conversia:

Dacă materia primă este amidonul, de ex. din porumb, mai întâi amidonul trebuie transformat în zahăr. Pentru bioetanolul utilizat drept combustibil, este necesară hidroliza pentru conversia amidonului. De obicei, hidroliza este accelerată prin tratament acid sau enzimatic ori printr-o combinație a ambelor. În mod normal, fermentația se desfășoară la aproximativ 35–40 °C.
Prezentare generală a diferitelor procese de fermentație:

Alimente:

• producție & conservare
• produse lactate (fermentație lactică), de ex. iaurt, lapte bătut, kefir
• legume fermentate lactic, de ex. kimchi, miso, natto, tsukemono, varză murată
• dezvoltarea aromelor, de ex. sos de soia
• descompunerea agenților tananți, de ex. ceai, cacao, cafea, tutun
• băuturi alcoolice, de ex. bere, vin, whisky

Medicamente:

• producția de compuși medicali, de ex. insulină, acid hialuronic

Biogaz/ etanol:

• îmbunătățirea producției de biogaz/ bioetanol

Diverse lucrări de cercetare și teste la scară de laborator de masă și la scară pilot au arătat că ultrasunetele îmbunătățesc procesul de fermentație, făcând mai multă biomasă disponibilă pentru fermentația enzimatică. În secțiunea următoare vor fi detaliate efectele ultrasunetelor într-un lichid.

Efectele procesării lichidelor cu ultrasunete

Cu ultrasunete de mare putere/ joasă frecvență se pot genera amplitudini mari. Astfel, ultrasunetele de mare putere/ joasă frecvență pot fi utilizate pentru procesarea lichidelor, cum ar fi amestecarea, emulsionarea, dispersarea și dezaglomerarea sau măcinarea.
La sonicarea lichidelor la intensități ridicate, undele sonore care se propagă în mediul lichid generează cicluri alternante de presiune înaltă (compresie) și de presiune joasă (rarefiere), cu rate care depind de frecvență. În timpul ciclului de presiune joasă, undele ultrasonice de intensitate ridicată creează mici bule de vid sau goluri în lichid. Când bulele ating un volum la care nu mai pot absorbi energie, ele colapsează violent în timpul unui ciclu de presiune înaltă. Acest fenomen se numește cavitație. Cavitația, adică „formarea, creșterea și colapsul imploziv al bulelor într-un lichid. Colapsul cavitațional produce încălzire locală intensă (~5000 K), presiuni ridicate (~1000 atm) și rate enorme de încălzire și răcire (>109 K/sec)” și jeturi de lichid (~400 km/h)”. (Suslick 1998)

Există diferite mijloace de generare a cavitației, de exemplu duzele de înaltă presiune, mixerele rotor-stator sau procesoarele cu ultrasunete. În toate aceste sisteme, energia introdusă este transformată în frecare, turbulențe, unde și cavitație. Fracțiunea din energia introdusă care este transformată în cavitație depinde de mai mulți factori care descriu mișcarea echipamentului generator de cavitație în lichid. Intensitatea accelerației este unul dintre cei mai importanți factori care influențează transformarea eficientă a energiei în cavitație. O accelerație mai mare creează diferențe de presiune mai mari. Aceasta, la rândul ei, crește probabilitatea formării bulelor de vid în locul formării undelor care se propagă prin lichid. Astfel, cu cât accelerația este mai mare, cu atât este mai mare fracțiunea din energie care este transformată în cavitație.
În cazul unui traductor ultrasonic, amplitudinea oscilației descrie intensitatea accelerației. Amplitudinile mai mari conduc la o generare mai eficientă a cavitației. Pe lângă intensitate, lichidul ar trebui accelerat astfel încât să se creeze pierderi minime sub formă de turbulențe, frecare și generare de unde. În acest scop, modul optim este o direcție unilaterală de mișcare. Modificând intensitatea și parametrii procesului de sonicare, ultrasunetele pot fi foarte dure sau foarte blânde. Acest lucru face din ultrasunete un instrument foarte versatil pentru diverse aplicații.

Aplicațiile blânde, care utilizează sonicare ușoară în condiții blânde, includ degazarea, emulsionarea, precum și activarea enzimelor. Aplicațiile dure cu ultrasunete de intensitate mare/ putere mare (în mare parte sub presiune ridicată) sunt măcinarea umedă, dezaglomerarea și reducerea dimensiunii particulelor, precum și dispersarea. Pentru multe aplicații, cum ar fi extracția, dezintegrarea sau sonochimia, intensitatea ultrasonică necesară depinde de materialul specific care urmează să fie sonicat. Prin varietatea parametrilor, care pot fi adaptați procesului individual, ultrasunetele permit găsirea punctului optim pentru fiecare proces în parte.
Pe lângă o conversie remarcabilă a puterii, ultrasonicarea oferă marele avantaj al controlului deplin asupra celor mai importanți parametri: amplitudine, presiune, temperatură, vâscozitate și concentrație. Aceasta oferă posibilitatea de a ajusta toți acești parametri cu scopul de a găsi parametrii ideali de procesare pentru fiecare material specific. Rezultatul este o eficacitate mai mare, precum și o eficiență optimizată.

Ultrasunetele pentru îmbunătățirea proceselor de fermentație, explicate exemplificativ prin producția de bioetanol

Bioetanolul este un produs al descompunerii biomasei sau a materiei biodegradabile din deșeuri de către bacterii anaerobe sau aerobe. Etanolul produs este utilizat în principal ca biocombustibil. Acest lucru face din bioetanol o alternativă regenerabilă și ecologică la combustibilii fosili, cum ar fi gazul natural.
Pentru a produce etanol din biomasă, se pot utiliza ca materie primă zahărul, amidonul și materialul lignocelulozic. La scară de producție industrială, zahărul și amidonul sunt în prezent predominante, deoarece sunt avantajoase din punct de vedere economic.
Modul în care ultrasunetele îmbunătățesc un proces individual al clientului, cu o materie primă specifică și în condiții date, poate fi verificat foarte simplu prin teste de fezabilitate. Într-o primă etapă, sonicarea unei cantități mici din suspensia de materie primă cu un dispozitiv de laborator cu ultrasunete va arăta dacă ultrasunetele afectează materia primă.

Testarea fezabilității

În prima fază de testare, este potrivit să se introducă o cantitate relativ mare de energie ultrasonică într-un volum mic de lichid, deoarece astfel crește șansa de a vedea dacă se pot obține rezultate. Un volum mic de probă scurtează, de asemenea, timpul de utilizare a unui dispozitiv de laborator și reduce costurile primelor teste.
Undele ultrasonice sunt transmise în lichid de suprafața sonotrodei. Sub suprafața sonotrodei, intensitatea ultrasunetelor este cea mai mare. Prin urmare, sunt preferate distanțe scurte între sonotrodă și materialul sonicat. Când este expus un volum mic de lichid, distanța față de sonotrodă poate fi menținută scurtă.
Tabelul de mai jos prezintă niveluri tipice de energie/volum pentru procesele de sonicare după optimizare. Deoarece primele încercări nu vor fi efectuate la configurația optimă, o intensitate și o durată de sonicare de 10 până la 50 de ori valoarea tipică vor arăta dacă există sau nu vreun efect asupra materialului sonicat.

Proces	Energie/ Volum	Volumul probei	Putere	Timp
Simplu	< 100Ws/mL	10mL	50W	< 20 sec
Mediu	100Ws/mL până la 500Ws/mL	10mL	50W	20 până la 100 sec
Dur	> 500Ws/mL	10mL	50W	>100 sec

Tabelul 1 – Valori tipice de sonicare după optimizarea procesului

Puterea efectiv introdusă în cursul testelor poate fi înregistrată prin înregistrarea integrată a datelor (UP200Ht și UP200St), prin interfața PC sau cu un wattmetru. În combinație cu datele înregistrate privind setarea amplitudinii și temperatura, rezultatele fiecărei încercări pot fi evaluate și se poate stabili o valoare de bază pentru energie/volum.
Dacă în timpul testelor a fost aleasă o configurație optimă, performanța acestei configurații ar putea fi verificată într-o etapă de optimizare și ar putea fi, în final, extinsă la scară comercială. Pentru a facilita optimizarea, se recomandă insistent să se examineze și limitele sonicării, de ex. temperatura, amplitudinea sau energia/volumul pentru formulări specifice. Deoarece ultrasunetele ar putea genera efecte negative asupra celulelor, substanțelor chimice sau particulelor, nivelurile critice pentru fiecare parametru trebuie examinate pentru a limita optimizarea ulterioară la intervalul de parametri în care efectele negative nu sunt observate. Pentru studiul de fezabilitate se recomandă unități mici de laborator sau de masă, pentru a limita cheltuielile cu echipamentele și probele în astfel de încercări. În general, unitățile de 100 până la 1.000 de wați servesc foarte bine scopurilor studiului de fezabilitate. (cf. Hielscher 2005)

Optimizare

Rezultatele obținute în timpul studiilor de fezabilitate pot indica un consum de energie destul de ridicat raportat la volumul mic tratat. Însă scopul testului de fezabilitate este în primul rând de a arăta efectele ultrasunetelor asupra materialului. Dacă în testarea de fezabilitate au apărut efecte pozitive, trebuie depuse eforturi suplimentare pentru optimizarea raportului energie/volum. Aceasta înseamnă explorarea configurației ideale a parametrilor ultrasonici pentru a obține cel mai mare randament folosind cât mai puțină energie posibil, astfel încât procesul să fie cât mai rezonabil și mai eficient din punct de vedere economic. Pentru a găsi configurația optimă a parametrilor – obținerea beneficiilor urmărite cu un aport minim de energie – corelația dintre cei mai importanți parametri amplitudine, presiune, temperatură și compoziția lichidului trebuie investigată. În această a doua etapă, se recomandă trecerea de la sonicarea în șarjă la o configurație de sonicare continuă cu reactor cu celulă de flux, deoarece importantul parametru al presiunii nu poate fi influențat în cazul sonicării în șarjă. În timpul sonicării în șarjă, presiunea este limitată la presiunea ambientală. Dacă procesul de sonicare trece printr-o cameră cu celulă de flux presurizabilă, presiunea poate fi crescută (sau redusă), ceea ce, în general, afectează drastic cavitația ultrasonică. Prin utilizarea unei celule de flux, se poate determina corelația dintre presiune și eficiența procesului. Procesoarele cu ultrasunete cu o putere între 500 de wați și 2000 de wați sunt cele mai potrivite pentru optimizarea unui proces.

Extinderea la scară pentru producția comercială

Dacă a fost găsită configurația optimă, extinderea ulterioară la scară este simplă, deoarece procesele cu ultrasunete sunt complet reproductibile la scară liniară. Aceasta înseamnă că, atunci când ultrasunetele sunt aplicate unei formulări lichide identice, la o configurație identică a parametrilor de procesare, este necesară aceeași energie pe volum pentru a obține un rezultat identic, indiferent de scara procesării. (Hielscher 2005). Acest lucru face posibilă implementarea configurației optime a parametrilor ultrasonici la dimensiunea producției la scară completă. Practic, volumul care poate fi procesat cu ultrasunete este nelimitat. Sunt disponibile sisteme comerciale cu ultrasunete de până la 16.000 de wați per unitate, care pot fi instalate în clustere. Astfel de clustere de procesoare cu ultrasunete pot fi instalate în paralel sau în serie. Prin instalarea în cluster a procesoarelor cu ultrasunete de mare putere, puterea totală este aproape nelimitată, astfel încât fluxurile de volum mare pot fi procesate fără probleme. De asemenea, dacă este necesară o adaptare a sistemului cu ultrasunete, de ex. pentru a ajusta parametrii la o formulare lichidă modificată, aceasta se poate face în majoritatea cazurilor prin schimbarea sonotrodei, a boosterului sau a celulei de flux. Scalabilitatea liniară, reproductibilitatea și adaptabilitatea ultrasunetelor fac această tehnologie inovatoare eficientă și rentabilă.

Parametrii procesării cu ultrasunete

Procesarea lichidelor cu ultrasunete este descrisă de o serie de parametri. Cei mai importanți sunt amplitudinea, presiunea, temperatura, vâscozitatea și concentrația. Rezultatul procesului, cum ar fi dimensiunea particulelor, pentru o configurație dată a parametrilor, este o funcție a energiei pe volumul procesat. Funcția se modifică odată cu modificarea parametrilor individuali. În plus, puterea efectivă de ieșire pe unitatea de suprafață a sonotrodei unei unități cu ultrasunete depinde de parametri. Puterea de ieșire pe unitatea de suprafață a sonotrodei este intensitatea de suprafață (I). Intensitatea de suprafață depinde de amplitudine (A), presiune (p), volumul reactorului (VR), temperatură (T), vâscozitate (η) și altele.

Impactul cavitației generate depinde de intensitatea de suprafață. În același mod se corelează și rezultatul procesului. Puterea totală de ieșire a unei unități cu ultrasunete este produsul dintre intensitatea de suprafață (I) și aria suprafeței (S):

P [W] I [W / mm²]* S[mm²]

Amplitudine

Amplitudinea oscilației descrie drumul (de ex. 50 µm) pe care îl parcurge suprafața sonotrodei într-un timp dat (de ex. 1/20.000s la 20kHz). Cu cât amplitudinea este mai mare, cu atât este mai mare rata cu care presiunea scade și crește la fiecare cursă. În plus, deplasarea de volum a fiecărei curse crește, rezultând un volum de cavitație mai mare (dimensiunea și/sau numărul bulelor). Atunci când sunt aplicate dispersiilor, amplitudinile mai mari prezintă o capacitate distructivă mai mare asupra particulelor solide. Tabelul 1 prezintă valori generale pentru unele procese cu ultrasunete.

Presiune

Punctul de fierbere al unui lichid depinde de presiune. Cu cât presiunea este mai mare, cu atât punctul de fierbere este mai ridicat, și invers. Presiunea ridicată permite cavitația la temperaturi apropiate de punctul de fierbere sau peste acesta. De asemenea, crește intensitatea imploziei, care este legată de diferența dintre presiunea statică și presiunea de vapori din interiorul bulei (cf. Vercet et al. 1999). Deoarece puterea și intensitatea ultrasonică se modifică rapid odată cu variațiile de presiune, este preferabilă o pompă cu presiune constantă. La alimentarea cu lichid a unei celule de flux, pompa trebuie să poată gestiona fluxul specific de lichid la presiuni adecvate. Pompele cu diafragmă sau cu membrană; pompele cu tub flexibil, cu furtun sau cu strângere; pompele peristaltice; ori pompele cu piston sau cu plunjer vor crea fluctuații alternante de presiune. Sunt preferate pompele centrifuge, pompele cu roți dințate, pompele spirale și pompele cu cavitate progresivă, care furnizează lichidul de sonicat la o presiune continuu stabilă. (Hielscher 2005)

Temperatură

Prin sonicarea unui lichid, puterea este transmisă în mediu. Deoarece oscilația generată ultrasonic provoacă turbulențe și frecare, lichidul sonicat – în conformitate cu legea termodinamicii – se va încălzi. Temperaturile ridicate ale mediului procesat pot fi distructive pentru material și pot reduce eficacitatea cavitației ultrasonice. Celulele de flux ultrasonice inovatoare sunt echipate cu o manta de răcire (vezi imaginea). Astfel, este asigurat controlul exact al temperaturii materialului în timpul procesării cu ultrasunete. Pentru sonicarea în pahar de laborator a volumelor mai mici, se recomandă o baie de gheață pentru disiparea căldurii.

Vâscozitate și concentrație

Procedeele ultrasonice de măcinare și dispersare sunt procese în fază lichidă. Particulele trebuie să se afle într-o suspensie, de ex. în apă, ulei, solvenți sau rășini. Prin utilizarea sistemelor ultrasonice cu flux continuu, devine posibilă sonicarea materialelor foarte vâscoase, păstoase.
Procesoarele cu ultrasunete de mare putere pot funcționa la concentrații destul de ridicate de solide. O concentrație ridicată asigură eficacitatea procesării cu ultrasunete, deoarece efectul de măcinare ultrasonică este cauzat de coliziunile dintre particule. Investigațiile au arătat că rata de rupere a silicei este independentă de concentrația de solide până la 50% din greutate. Procesarea masterbatch-urilor cu un raport ridicat de material concentrat este o procedură de producție obișnuită care utilizează ultrasonicarea.

Putere și intensitate vs. energie

Intensitatea de suprafață și puterea totală descriu doar intensitatea procesării. Volumul probei sonicate și timpul de expunere la o anumită intensitate trebuie luate în considerare pentru a descrie un proces de sonicare, astfel încât acesta să fie scalabil și reproductibil. Pentru o configurație dată a parametrilor, rezultatul procesului, de ex. dimensiunea particulelor sau conversia chimică, va depinde de energia pe volum (E/V).

Rezultat = f (E /V )

Unde energia (E) este produsul dintre puterea de ieșire (P) și timpul de expunere (t).

E[Ws] = P[W]*t[s]

Modificările configurației parametrilor vor modifica funcția rezultatului. Aceasta, la rândul ei, va varia cantitatea de energie (E) necesară pentru o valoare dată a probei (V) pentru a obține o anumită valoare a rezultatului. Din acest motiv, nu este suficient să se aplice o anumită putere ultrasonică unui proces pentru a obține un rezultat. Este necesară o abordare mai sofisticată pentru a identifica puterea necesară și configurația parametrilor la care puterea trebuie introdusă în materialul procesat. (Hielscher 2005)

Producția de bioetanol asistată cu ultrasunete

Se știe deja că ultrasunetele îmbunătățesc producția de bioetanol. Se recomandă îngroșarea lichidului cu biomasă până la o suspensie foarte vâscoasă, care să poată fi totuși pompată. Reactoarele cu ultrasunete pot gestiona concentrații destul de ridicate de solide, astfel încât procesul de sonicare să poată fi desfășurat cât mai eficient. Cu cât suspensia conține mai mult material, cu atât mai puțin lichid purtător, care nu va beneficia de procesul de sonicare, va fi tratat. Deoarece introducerea de energie într-un lichid provoacă încălzirea lichidului conform legii termodinamicii, aceasta înseamnă că energia ultrasonică este aplicată, pe cât posibil, materialului țintă. Printr-un astfel de design eficient al procesului, se evită încălzirea risipitoare a excesului de lichid purtător.
Ultrasunetele facilitează extracția materialului intracelular și îl fac astfel disponibil pentru fermentația enzimatică. Tratamentul ușor cu ultrasunete poate intensifica activitatea enzimatică, dar pentru extracția din biomasă vor fi necesare ultrasunete mai intense. Prin urmare, enzimele trebuie adăugate în suspensia de biomasă după sonicare, deoarece ultrasunetele intense inactivează enzimele, ceea ce reprezintă un efect nedorit.

Rezultate actuale obținute prin cercetarea științifică:

Studiile lui Yoswathana et al. (2010) privind producția de bioetanol din paie de orez au arătat că combinarea pretratamentului acid și a ultrasunetelor înainte de tratamentul enzimatic a condus la un randament de zahăr crescut de până la 44% (raportat la paiele de orez). Aceasta demonstrează eficacitatea combinării pretratamentului fizic și chimic înainte de hidroliza enzimatică a materialului lignocelulozic în zahăr. 

Graficul 2 ilustrează grafic efectele pozitive ale iradierii ultrasonice în timpul producției de bioetanol din paie de orez. (Cărbunele vegetal a fost utilizat pentru detoxifierea probelor pretratate în urma pretratamentului acid/ enzimatic și a pretratamentului cu ultrasunete.)

Într-un alt studiu recent, a fost examinată influența ultrasonicării asupra nivelurilor extracelulare și intracelulare ale enzimei β-galactozidază. Sulaiman et al. (2011) au reușit să îmbunătățească substanțial productivitatea producției de bioetanol, utilizând ultrasunete la temperatură controlată, care au stimulat creșterea drojdiei Kluyveromyces marxianus (ATCC 46537). Autorii lucrării rezumă că sonicarea intermitentă cu ultrasunete de putere (20 kHz) la cicluri de funcționare de ≤20% a stimulat producția de biomasă, metabolismul lactozei și producția de etanol la K. marxianus, la o intensitate de sonicare relativ ridicată de 11,8Wcm². În cele mai bune condiții, sonicarea a crescut concentrația finală de etanol de aproape 3,5 ori față de control. Aceasta a corespuns unei creșteri de 3,5 ori a productivității de etanol, dar a necesitat 952W de putere suplimentară introdusă prin sonicare per metru cub de mediu de cultură. Această cerință suplimentară de energie s-a încadrat cu siguranță în normele operaționale acceptabile pentru bioreactoare și, în cazul produselor de valoare ridicată, ar putea fi compensată cu ușurință prin productivitatea crescută.

Concluzie: beneficiile fermentației asistate cu ultrasunete

Tratamentul cu ultrasunete s-a dovedit a fi o tehnică eficientă și inovatoare pentru creșterea randamentului de bioetanol. În primul rând, ultrasunetele sunt utilizate pentru extragerea materialului intracelular din biomasă, cum ar fi porumbul, boabele de soia, paiele, materialul lignocelulozic sau deșeurile vegetale.

• Creșterea randamentului de bioetanol
• Dezintegrare/ distrugerea celulelor și eliberarea materialului intracelular
• Descompunere anaerobă îmbunătățită
• Activarea enzimelor prin sonicare ușoară
• Îmbunătățirea eficienței procesului prin suspensii cu concentrație ridicată

Testarea simplă, extinderea reproductibilă la scară și instalarea ușoară (inclusiv în fluxurile de producție deja existente) fac din ultrasunete o tehnologie profitabilă și eficientă. Sunt disponibile procesoare industriale cu ultrasunete fiabile pentru procesarea comercială, care fac posibilă sonicarea unor volume de lichid practic nelimitate.