Prepararea lipozomilor cu ultrasunete

Lipozomii produși cu ultrasunete prezintă o eficiență de înglobare foarte ridicată, o capacitate mare de încărcare și o dimensiune sferică uniform redusă. Astfel, lipozomii obținuți cu ultrasunete oferă o biodisponibilitate excelentă. Hielscher Ultrasonics oferă ultrasonicatoare pentru producția fiabilă de lipozomi de calitate farmaceutică în regim discontinuu (batch) și continuu.

Avantajele producției de lipozomi cu ultrasunete

Încapsularea lipozomală cu ultrasunete este o tehnică utilizată pentru încapsularea medicamentelor sau a altor agenți terapeutici în lipozomi cu ajutorul energiei ultrasonice. În comparație cu alte metode de încapsulare în lipozomi, încapsularea cu ultrasunete are mai multe avantaje care o fac tehnica de producție superioară.

• Încărcare ridicată, eficiență ridicată de înglobare: Producția de lipozomi cu ultrasunete este bine cunoscută pentru obținerea de lipozomi cu o încărcare ridicată de ingrediente active, de ex. vitamina C, molecule de medicamente etc. Totodată, metoda de sonicare prezintă o eficiență ridicată de înglobare. Aceasta înseamnă că un procent ridicat din substanța activă este încapsulat prin ultrasonicare. În concluzie, acest lucru face din ultrasonicare o metodă extrem de eficientă pentru producția de lipozomi.
• Lipozomi de dimensiuni uniform reduse: Un avantaj al încapsulării lipozomale cu ultrasunete este capacitatea sa de a produce lipozomi foarte uniformi, cu o distribuție îngustă a dimensiunilor. Energia ultrasonică poate fi utilizată pentru a fragmenta lipozomii mai mari sau agregatele lipidice în lipozomi mai mici și mai uniformi. Aceasta conduce la o consecvență mai mare a dimensiunii și formei lipozomilor, ceea ce poate fi important pentru aplicațiile de administrare a medicamentelor, în care dimensiunea particulelor poate influența farmacocinetica și eficacitatea acestora.
• Aplicabil oricăror molecule: Un alt avantaj al încapsulării lipozomale cu ultrasunete este capacitatea sa de a încapsula o gamă largă de medicamente și alți agenți terapeutici. Tehnica poate fi utilizată pentru încapsularea atât a medicamentelor hidrofile, cât și a celor hidrofobe, lucru care poate fi dificil de realizat cu alte metode. În plus, energia ultrasonică poate fi utilizată pentru încapsularea macromoleculelor și a nanoparticulelor, care pot fi prea mari pentru a fi încapsulate cu alte metode.
• Rapid și fiabil: Încapsularea lipozomală cu ultrasunete este, de asemenea, un proces relativ simplu și rapid. Nu necesită utilizarea unor substanțe chimice agresive sau a unor temperaturi ridicate, care pot fi dăunătoare pentru agenții terapeutici încapsulați.
• Scalare: În plus, tehnica poate fi scalată cu ușurință pentru producția la scară largă, ceea ce o face o opțiune rentabilă pentru aplicațiile de administrare a medicamentelor.

Pe scurt, încapsularea lipozomală cu ultrasunete este o tehnică superioară pentru încapsularea în lipozomi datorită capacității sale de a produce lipozomi uniformi cu o distribuție îngustă a dimensiunilor, de a încapsula o gamă largă de agenți terapeutici, precum și datorită simplității și scalabilității sale.

După formarea unui film lipidic și rehidratarea ulterioară, sonicarea este utilizată pentru a favoriza înglobarea ingredientelor active în lipozom. În plus, sonicarea asigură obținerea dimensiunii dorite a lipozomilor.

Prepararea lipozomilor cu ultrasunete pentru produse farmaceutice și cosmetice

Lipozomii (vezicule pe bază de lipide), transferozomii (lipozomi ultradeformabili), etozomii (vezicule ultradeformabile cu conținut ridicat de alcool) și niozomii (vezicule sintetice) sunt vezicule microscopice care pot fi preparate artificial ca purtători globulari în care pot fi încapsulate molecule active. Aceste vezicule, cu diametre între 25 și 5000 nm, sunt adesea utilizate ca purtători de medicamente în industria farmaceutică și cosmetică, de exemplu pentru administrarea orală sau topică a medicamentelor, terapia genică și imunizare. Ultrasonicarea este o metodă dovedită științific pentru producția extrem de eficientă de lipozomi. Ultrasonicatoarele Hielscher produc lipozomi cu încărcări ridicate de ingrediente active și o biodisponibilitate superioară.

Lipozomi și formulări lipozomale

Lipozomii sunt sisteme veziculare unilamelare, oligolamelare sau multilamelare și sunt alcătuiți din același material ca membrana celulară (dublu strat lipidic). În funcție de compoziția și dimensiunea lor, lipozomii se diferențiază după cum urmează:

• vezicule multilamelare (MLV, 0,1-10μm)
• vezicule unilamelare mici (SUV, <100 nm)
• vezicule unilamelare mari (LUV, 100–500 nm)
• vezicule unilamelare gigantice (GUV, ≥1 μm)

Structura principală a lipozomilor este alcătuită din fosfolipide. Fosfolipidele au o grupare de cap hidrofilă și o grupare de coadă hidrofobă, formată dintr-un lanț hidrocarbonat lung.
Membrana lipozomală are o compoziție foarte asemănătoare cu cea a barierei cutanate, astfel încât lipozomii pot fi integrați cu ușurință în pielea umană. Pe măsură ce lipozomii fuzionează cu pielea, aceștia pot elibera agenții înglobați direct la destinație, unde substanțele active își pot îndeplini funcțiile. Astfel, lipozomii determină o creștere a penetrabilității/permeabilității pielii pentru agenții farmaceutici și cosmetici înglobați. De asemenea, și lipozomii fără agenți încapsulați, adică veziculele goale, sunt substanțe active puternice pentru piele, deoarece „phosphatidylcholin” încorporează doi compuși esențiali pe care organismul uman nu îi poate produce singur: acidul linoleic și colina.
Lipozomii sunt utilizați ca purtători biocompatibili pentru medicamente, peptide, proteine, „plasmic DNA”, oligonucleotide antisens sau ribozime, în scopuri farmaceutice, cosmetice și biochimice. Versatilitatea enormă în ceea ce privește dimensiunea particulelor și parametrii fizici ai lipidelor oferă un potențial atractiv pentru construirea unor vehicule personalizate pentru o gamă largă de aplicații. (Ulrich 2002)

Formarea lipozomilor cu ultrasunete

Lipozomii pot fi formați prin utilizarea ultrasunetelor. Materialul de bază pentru prepararea lipozomilor îl constituie moleculele „amphilic” derivate din lipidele membranelor biologice sau bazate pe acestea. Pentru formarea veziculelor unilamelare mici (SUV), dispersia lipidică este sonicată delicat – de ex. cu dispozitivul cu ultrasunete ținut în mână UP50H (50W, 30kHz), cu VialTweeter sau cu reactorul cu ultrasunete CupHorn – într-o baie de gheață. Durata unui astfel de tratament cu ultrasunete este de aprox. 5 – 15 minute. O altă metodă de producere a veziculelor unilamelare mici este sonicarea lipozomilor de tip vezicule multilamelare.
Dinu-Pirvu et al. (2010) raportează obținerea de transferozomi prin sonicarea MLV la temperatura camerei.
Hielscher Ultrasonics oferă diverse dispozitive cu ultrasunete, sonotrode și accesorii și poate astfel furniza cea mai potrivită configurație cu ultrasunete pentru o încapsulare lipozomală extrem de eficientă la orice scară.

Încapsularea cu ultrasunete a substanțelor active în lipozomi

Lipozomii funcționează ca purtători pentru ingrediente active precum vitamine, molecule terapeutice, peptide etc. Ultrasunetele sunt un instrument eficient pentru prepararea și formarea lipozomilor în vederea înglobării agenților activi. Simultan, sonicarea facilitează procesul de încapsulare și înglobare, astfel încât se obțin lipozomi cu o încărcare ridicată de ingrediente active. Înainte de încapsulare, lipozomii tind să formeze clustere din cauza interacțiunii sarcină-sarcină de suprafață a capetelor polare ale fosfolipidelor (cf. Míckova et al. 2008); în plus, aceștia trebuie deschiși. De exemplu, Zhu et al. (2003) descriu încapsularea pulberii de biotină în lipozomi prin ultrasonicare. Atunci când pulberea de biotină a fost adăugată în soluția de suspensie de vezicule, soluția a fost sonicată. După acest tratament, biotina a fost înglobată în lipozomi.
Aflați mai multe despre încapsularea cu ultrasunete a „peptrides” GLP-1 (de ex. semaglutida) în lipozomi!

Emulsii lipozomale prin ultrasonicare

Pentru a spori efectul nutritiv al cremelor hidratante sau anti-îmbătrânire, al loțiunilor, gelurilor și al altor formulări cosmeceutice, se adaugă emulgatori în dispersiile lipozomale pentru a stabiliza cantități mai mari de lipide. Însă investigațiile au arătat că capacitatea lipozomilor este, în general, limitată. Prin adăugarea de emulgatori, acest efect va apărea mai devreme, iar emulgatorii suplimentari determină o slăbire a afinității pentru barieră a fosfatidilcolinei. Nanoparticulele – alcătuite din fosfatidilcolină și lipide – reprezintă soluția acestei probleme. Aceste nanoparticule sunt formate dintr-o picătură de ulei acoperită de un monostrat de fosfatidilcolină. Utilizarea nanoparticulelor permite formulări capabile să absoarbă mai multe lipide și să rămână stabile, astfel încât nu mai sunt necesari emulgatori suplimentari.
Ultrasonicarea este o metodă dovedită pentru producția de nanoemulsii și nanodispersii. Ultrasunetele de mare intensitate furnizează puterea necesară pentru a dispersa o fază lichidă (faza dispersată) sub formă de picături mici într-o a doua fază (faza continuă). În zona de dispersare, bulele de cavitație care implodează provoacă unde de șoc intense în lichidul înconjurător și duc la formarea de jeturi de lichid cu viteză ridicată. Pentru a stabiliza picăturile nou formate ale fazei dispersate împotriva coalescenței, se adaugă în emulsie emulgatori (substanțe tensioactive, surfactanți) și stabilizatori. Deoarece coalescența picăturilor după fragmentare influențează distribuția finală a dimensiunii picăturilor, se utilizează emulgatori cu efect stabilizator eficient pentru a menține distribuția finală a dimensiunii picăturilor la un nivel egal cu distribuția imediat după fragmentarea picăturilor în zona de dispersare ultrasonică.

Dispersii lipozomale prin ultrasonicare

Dispersiile lipozomale pe bază de „phosphatidylchlorine” nesaturată prezintă o stabilitate insuficientă la oxidare. Stabilizarea dispersiei poate fi realizată cu ajutorul antioxidanților, de exemplu cu un complex de vitamine C și E.
 

Formarea lipozomilor prin metoda evaporării în fază inversă utilizând sonicarea

 
Ortan et al. (2002) au obținut rezultate bune în studiul lor privind prepararea cu ultrasunete a uleiului esențial de Anethum graveolens în lipozomi. După sonicare, dimensiunile lipozomilor au fost cuprinse între 70-150 nm, iar pentru MLV între 230-475 nm; aceste valori au rămas aproximativ constante și după 2 luni, dar au crescut după 12 luni, în special în dispersia SUV (vedeți histogramele de mai jos). Măsurarea stabilității, privind pierderea de ulei esențial și distribuția dimensiunilor, a arătat de asemenea că dispersiile lipozomale au menținut conținutul de ulei volatil. Acest lucru sugerează că înglobarea uleiului esențial în lipozomi a crescut stabilitatea uleiului.

Ortan et al. (2009): Stabilitatea dispersiilor MLV și SUV după 1 an. Formulările lipozomale au fost depozitate la 4±1 ºC.

Procesoarele cu ultrasunete Hielscher sunt dispozitivele ideale pentru aplicații în industria cosmetică și farmaceutică. Sistemele alcătuite din mai multe procesoare cu ultrasunete de până la 16.000 de wați fiecare oferă capacitatea necesară pentru a transpune această aplicație de laborator într-o metodă de producție eficientă, în vederea obținerii de emulsii fin dispersate în flux continuu sau în regim discontinuu (batch) – obținând rezultate comparabile cu cele ale celor mai bune omogenizatoare de înaltă presiune disponibile în prezent, precum valvele cu orificiu. Pe lângă această eficiență ridicată în emulsificarea continuă, dispozitivele cu ultrasunete Hielscher necesită foarte puțină întreținere și sunt foarte ușor de operat și de curățat. De fapt, ultrasunetele susțin curățarea și clătirea. Puterea ultrasonică este reglabilă și poate fi adaptată la anumite produse și cerințe de emulsificare. Sunt disponibile, de asemenea, reactoare speciale cu celulă de flux care îndeplinesc cerințele avansate CIP (clean-in-place) și SIP (sterilize-in-place).

Întrebări frecvente despre lipozomi

Ce tipuri de lipozomi se disting?

Lipozomii sunt clasificați în diferite tipuri în funcție de dimensiunea lor și de numărul de straturi duble pe care le conțin. Aceste categorii includ:

• Vezicule unilamelare mici (SUV): Aceștia sunt cei mai mici lipozomi, cu un singur dublu strat lipidic.
• Vezicule unilamelare mari (LUV): Mai mari decât SUV, acestea au, de asemenea, un singur dublu strat.
• Vezicule multilamelare (MLV): Acestea conțin mai multe straturi duble concentrice.
• Vezicule multiveziculare (MVV): Acestea sunt alcătuite din mai multe vezicule mai mici în interiorul unei vezicule mai mari.

 
Alte tipuri specializate includ:

• Lipozomi PEGilați: Lipozomi modificați cu polietilenglicol (PEG) pentru a spori stabilitatea și timpul de circulație.
• Nanolipozomi: Lipozomi foarte mici, utilizați de obicei pentru administrarea țintită a medicamentelor.

Ce structuri veziculare pot prezenta lipozomii?

Lipozomii sunt clasificați în continuare, în funcție de structura veziculară, în șapte tipuri principale:

• Vezicule mari multilamelare (MLV): Conțin mai multe straturi duble.
• Vezicule oligolamelare (OLV): Au câteva straturi duble.
• Vezicule unilamelare mici (SUV): Cele mai mici, cu un singur dublu strat.
• Vezicule unilamelare de dimensiuni medii (MUV): Dimensiune intermediară, cu un singur dublu strat.
• Vezicule unilamelare mari (LUV): Mai mari, cu un singur dublu strat.
• Vezicule unilamelare gigantice (GUV): Foarte mari, cu un singur dublu strat.
• Vezicule multiveziculare (MVV): Mai multe vezicule în interiorul unei singure vezicule mari.

Care sunt diferențele dintre lipozomi și niozomi?

Lipozomii și niozomii diferă în principal prin compoziția lor:
Lipozomi: Alcătuiți din fosfolipide cu lanț dublu, care pot fi fie neutre, fie încărcate electric.
Niozomi: Alcătuiți din surfactanți neîncărcați cu lanț simplu și colesterol.
Ambele structuri se formează prin sonicare, care favorizează asamblarea veziculelor cu dublu strat.

Care este dimensiunea ideală a unui lipozom?

Pentru administrarea terapeutică, dimensiunea ideală a unui lipozom este, teoretic, între 50 și 200 de nanometri în diametru. Acest interval de dimensiuni optimizează stabilitatea și biodisponibilitatea. Sonicarea este utilizată în mod obișnuit pentru a reduce vezicula la dimensiunea dorită.

Pot lipozomii transporta medicamente hidrofile?

Da, lipozomii pot transporta medicamente hidrofile. Aceștia sunt apreciați în aplicațiile biomedicale pentru capacitatea lor de a încapsula atât agenți hidrofobi, cât și hidrofili. În plus, oferă o biocompatibilitate și o biodegradabilitate ridicate, ceea ce îi face sisteme de administrare eficiente.

Cum se produc lipozomii?

Cele mai comune tehnici de preparare a lipozomilor sunt metoda filmului subțire și metoda evaporării în fază inversă.
Metoda hidratării filmului subțire:

1. Dizolvați lipidele într-un solvent organic.
2. Evaporați solventul pentru a forma un film lipidic subțire.
3. Hidratați filmul cu o soluție apoasă, utilizând sonicarea, pentru a forma vezicule multilamelare.

Metoda evaporării în fază inversă:

1. Dizolvați lipidele în apă și etanol.
2. Sonicați soluția la 60°C timp de aproximativ 10 minute pentru a obține o pastă lipidică.
3. Răciți suspensia lipidică și adăugați picătură cu picătură apă sau soluție tampon, sub agitare.
4. Hidratați suspensia timp de 1 oră pentru a forma vezicule multilamelare.
5. Reduceți dimensiunea lipozomilor prin sonicare suplimentară.

Ce sunt arheozomii?

Arheozomii sunt lipozomi produși din lipide de arhee, cunoscute pentru stabilitatea și rezistența lor la condiții extreme. Aceste proprietăți fac arheozomii deosebit de utili pentru administrarea medicamentelor și dezvoltarea vaccinurilor în medii dificile.

Cum se prepară arheozomii?

Procedura de sonicare conform Pise (2022): Arheozomii pot fi obținuți din fracția lipidică polară „PLF” a Sulfolobussolfataricus prin sonicare la 60°C, fără a fi necesară completarea cu lipide externe. La 0°C, lipidele polare din Sulfolobusacidocaldarius au fost sonicate eficient pentru a forma arheozomi. Arheozomii încărcați cu BMD și lipozomii convenționali, precum și lipidele de arhee izolate din Archaea H. salinarum și îmbogățite cu fosfatidilcolină, au fost obținuți prin tehnici de sonicare. Au fost create vezicule sonicate pentru administrare topică prin sonicarea dispersiilor MLV la o amplitudine de 80 la sută timp de 4 minute, utilizând un sonicator cu sondă Hielscher UP50H (vedeți imaginea din stânga).

Literatură/Referințe

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.