المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة في بروتيوميات شوتغن – مذكرة تطبيقية
تعتمد بروتيوميات شوتغن على تحضير العينات بكفاءة وبطريقة قابلة للتكرار لتحويل المواد البيولوجية المعقدة إلى ببتيدات جاهزة لتحليل LC-MS/MS. ويدعم جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP هذه العملية بإتاحة معالجة موحدة ومتوازية بالموجات فوق الصوتية للعينات صغيرة الحجم، مما يساعد المختبرات على تحسين التفكيك والاستخلاص وإعادة الإذابة في مسارات العمل القائمة على الصفائح الدقيقة. وتوضح هذه المذكرة التطبيقية كيفية دمج UIP400MTP في تحضير العينات البروتيومية، باستخدام مسار عمل منشور للحويصلات خارج الخلوية من دراسات PLA2G12A/Th17 بوصفه مثالاً اختُبر في المختبر.
المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة لزيادة قابلية تكرار بروتيوميات شوتغن
بالنسبة إلى باحثي البروتيوميات، يُعد تحضير العينات بطريقة قابلة للتكرار أمراً بالغ الأهمية للحصول على بيانات LC-MS/MS عالية الجودة. ويدعم جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP المعالجة الموحدة والمتوازية بالموجات فوق الصوتية في مسارات العمل القائمة على الصفائح ومسارات العمل ذات العينات صغيرة الحجم ومعدل معالجة العينات المرتفع.
وهو مفيد بشكل خاص للمختبرات التي تتعامل مع:
- مجموعات كبيرة من العينات تتطلب معالجة متسقة عبر العديد من الآبار
- مواد ذات كميات إدخال محدودة، حيث يجب تقليل فقد العينات والتباين إلى أدنى حد
- عينات غنية بالدهون، مثل الحويصلات خارج الخلوية
- مستحضرات بيولوجية معقدة تتطلب تفكيكاً أو استخلاصاً أو إعادة إذابة بكفاءة
- بروتيوميات شوتغن المقارنة، حيث تكون قابلية التكرار عبر الظروف والمكررات ضرورية
من خلال دمج المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة قبل الهضم، يمكن للباحثين تحسين جاهزية العينات من أجل:
- استخلاص البروتين وإعادة إذابته
- الهضم بالتريبسين/Lys-C
- اكتساب البيانات باستخدام Nano-LC/MS/MS
- التحليل البروتيومي الكمي اللاحق
تعرّف على كيفية إسهام المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة في تقليل التباين الناتج عن العمل اليدوي، وتحسين تفكيك العينات، وتحضير العينات البيولوجية المعقدة لتحليل LC-MS/MS موثوق.
يمكن أن تفيد المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة:
- المرافق المركزية للبروتيوميات
- مختبرات أبحاث الحويصلات خارج الخلوية (EV)
- مختبرات علم المناعة وبيولوجيا الخلية
- مجموعات الأبحاث الانتقالية
- فرق علوم الحياة التي توسّع نطاق عملها من تحضير عينة واحدة إلى مسارات عمل ذات معدل معالجة عينات أعلى
تحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع لتحليل بروتيوم الحويصلات خارج الخلوية
ما هي بروتيوميات شوتغن؟
أصبحت بروتيوميات شوتغن استراتيجية تحليلية محورية لتوصيف العينات البيولوجية المعقدة، بدءاً من محللات الخلايا الكاملة ومستخلصات الأنسجة وصولاً إلى العضيات المنقاة والحويصلات خارج الخلوية والعينات السريرية ذات كميات الإدخال المنخفضة. وتكمن قوتها الأساسية في الجمع بين هضم البروتين، والكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بمطيافية الكتلة الترادفية عالية الدقة، والاستدلال الحاسوبي على البروتينات انطلاقاً من الببتيدات. ومع ذلك، تتحدد جودة مجموعة بيانات البروتيوم النهائية قبل وصول العينة إلى مطياف الكتلة بوقت طويل. ويُعد تفكيك العينات بكفاءة، وإذابة البروتينات، وإزالة المواد المتداخلة، والهضم الإنزيمي القابل للتكرار، والاسترجاع الموثوق للببتيدات عوامل حاسمة لعمق التغطية والموثوقية الكمية.
وبالنسبة إلى باحثي البروتيوميات ومختبرات علوم الحياة التي تتعامل مع عينات محدودة أو ثمينة، غالباً ما يكون تحضير العينات هو عنق الزجاجة.
يضمن UIP400MTP تحضيراً موثوقاً للعينات ودمجاً سهلاً في مسارات العمل المختبرية القائمة
تحدي الحويصلات خارج الخلوية في البروتيوميات
تمثل الحويصلات خارج الخلوية (EVs)، على سبيل المثال، فئة من العينات ذات متطلبات عالية بشكل خاص. وهي جسيمات نانوية الحجم محاطة بغشاء وغنية بالدهون، ذات مردود بروتيني منخفض نسبياً واحتمال مرتفع لانتقال الدهون والأملاح والمنظفات وبروتينات المصل وغيرها من مكونات المصفوفة إلى المراحل اللاحقة. ويمكن لهذه الخصائص أن تؤثر سلباً في كفاءة الهضم والأداء الكروماتوغرافي وثبات الرش الكهربائي والتعرف على الببتيدات. لذلك، يجب أن يكون مسار تحضير العينات لبروتيوميات الحويصلات خارج الخلوية فعالاً بما يكفي لتفكيك بُنى الحويصلات وإذابة حمولتها البروتينية، مع الحفاظ على توافقه مع الهضم الإنزيمي اللاحق وتحليل LC-MS/MS.
وفي هذا السياق، توفر المعالجة بالموجات فوق الصوتية المتوافقة مع الصفائح الدقيقة نهجاً عملياً لمعالجة العينات بالتوازي وبطريقة قابلة للتكرار. وقد صُمم طرازا أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP (400 W) وUIP550MTP (550 W) لمعالجة العينات بالموجات فوق الصوتية في الصفائح متعددة الآبار والأوعية صغيرة الحجم، مما يدعم مسارات عمل ذات معدل معالجة عينات أعلى من أجهزة المعالجة التقليدية بالموجات فوق الصوتية ذات المسبار الواحد. ويُعد هذا الشكل جذاباً لمختبرات البروتيوميات لأنه يمكن أن يقلل التباين الناجم عن العمل اليدوي، ويحسّن المعالجة المتوازية لعينات متعددة، ويندمج بصورة أكثر سلاسة في مسارات تحضير العينات القائمة على الصفائح.
مثال على مسار عمل
يوفر مسار عمل حديث لبروتيوميات الحويصلات خارج الخلوية في بيولوجيا خلايا Th17 التي يقودها PLA2G12A مثالاً مفيداً اختُبر في المختبر على كيفية دمج جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP في تحضير عينات بروتيوميات شوتغن. وفي تلك السلسلة من الدراسات، عولجت عينات EV لتحليل البروتيوم باستخدام المعالجة بالميثانول، والمعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام UIP400MTP، والطرد المركزي، والتجفيف، والهضم باستخدام trypsin/Lys-C، وLC ذات التدفق النانوي المقترنة بـ MS الترادفية عالية الدقة. وقد نشر Mochizuki-Ono وزملاؤه العمل البيولوجي في عام 2026، حيث ساعد التحليل البروتيومي في توصيف كيفية تغيير PLA2G12A لبروتينات حمولة EV في سياق استجابات الخلايا التائية الممرضة.
جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح ذات 96 بئراً UIP400MTP لاستخلاص البروتين بمعدل معالجة عينات مرتفع
جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية: جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP
كمية الإدخال: ما يعادل 5 µg من بروتين الحويصلات خارج الخلوية
الهضم: تريبسين/Lys-C
القراءة التحليلية: Nano-LC-MS/MS / بروتيوميات DIA
تعليمات خطوة بخطوة: تحضير عينات الحويصلات خارج الخلوية بمساعدة UIP400MTP لبروتيوميات شوتغن
يصف مسار العمل هذا طريقة لتحضير عينات بروتيوميات شوتغن للحويصلات خارج الخلوية (EV) ذات كميات الإدخال المنخفضة باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP. وهو يستند إلى مسار عمل منشور لبروتيوميات الحويصلات خارج الخلوية، جرى فيه توحيد كميات إدخال عيناتها وتجفيفها ومعالجتها بالميثانول وبالموجات فوق الصوتية، وهضمها بالتريبسين/Lys-C، وتحميضها، وتحليلها باستخدام nano-LC-MS/MS.
هذا الإجراء مخصص لباحثي البروتيوميات ومختبرات علوم الحياة التي تحضّر الحويصلات خارج الخلوية أو غيرها من العينات البيولوجية صغيرة الحجم والغنية بالدهون لبروتيوميات شوتغن القائمة على تحليل الببتيدات الناتجة من هضم البروتينات.
نظرة عامة على مسار العمل
| المرحلة | الغرض | الناتج الرئيسي |
|---|---|---|
| تحضير الحويصلات خارج الخلوية | عزل عينات الحويصلات خارج الخلوية وغسلها وقياس كميتها | كمية إدخال موحدة من الحويصلات خارج الخلوية |
| تجفيف العينات | إزالة السائل قبل المعالجة بمساعدة المذيب | مادة مجففة من الحويصلات خارج الخلوية |
| المعالجة بالميثانول | دعم تفكيك مادة الحويصلات خارج الخلوية الغنية بالدهون | عينة مبللة بالميثانول |
| المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام UIP400MTP | تعزيز التفكيك والاستخلاص والتجانس | عينة حويصلات خارج خلوية معالَجة |
| الهضم | إنتاج ببتيدات من بروتينات الحويصلات خارج الخلوية | ناتج هضم ببتيدي بالتريبسين/Lys-C |
| تحليل LC-MS/MS | فصل الببتيدات وكشفها وقياس كميتها | مجموعة بيانات بروتيومية |
| تحليل البيانات | التعرف على الببتيدات والبروتينات وقياس كمياتها | نتائج على مستوى البروتينات |
بروتوكول خطوة بخطوة
| الخطوة | التعليمات | المعلمات الحاسمة |
|---|---|---|
| 1 | حضّر عينات منقاة من الحويصلات خارج الخلوية باستخدام مسار العزل المعتمد في المختبر. | أزل الخلايا والحطام والملوثات الرئيسية قبل التحضير للتحليل البروتيومي. |
| 2 | قِس كمية البروتين في الحويصلات خارج الخلوية، على سبيل المثال باستخدام اختبار BCA. | وحّد جميع العينات بحيث تتساوى كميات إدخالها المكافئة للبروتين. |
| 3 | انقل ما يعادل 5 µg من بروتين الحويصلات خارج الخلوية إلى أنابيب PCR نظيفة أو أنابيب متوافقة صغيرة الحجم. | استخدم أنابيب منخفضة الارتباط عندما يكون فقد العينة مصدر قلق. |
| 4 | جفّف عينات الحويصلات خارج الخلوية تماماً. | تجنب التسخين المفرط؛ وتأكد من عدم بقاء أي سائل مرئي. |
| 5 | أضف 25 µL من الميثانول إلى كل عينة مجففة من الحويصلات خارج الخلوية. | تأكد من تبلل المادة المجففة بالكامل. |
| 6 | عالج العينات بالموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقائق باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP. | استخدم إعدادات متطابقة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية ومنطقاً موحداً لترتيب جميع العينات. |
| 7 | أخضع العينات المعالَجة بالموجات فوق الصوتية للطرد المركزي عند 19,000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4°C. | تجنب تحريك أي راسب أو مادة غير قابلة للذوبان بعد الطرد المركزي. |
| 8 | أزل بحذر 20 µL من السائل الطافي. | استخدم تقنية متسقة لنقل السوائل بالماصة لجميع العينات. |
| 9 | جفّف مادة العينة المتبقية تماماً. | انتقل مباشرة إلى الهضم، أو خزّن العينات فقط في ظروف تم التحقق من صلاحيتها. |
| 10 | أضف 4 µL من محلول التريبسين/Lys-C بتركيز 100 ng/µL في بيكربونات الأمونيوم بتركيز 50 mM. | حضّر محلول الإنزيم طازجاً أو استخدم أجزاء مقسمة مخزنة بصورة صحيحة. |
| 11 | عالج بالموجات فوق الصوتية لفترة وجيزة لإذابة المادة البروتينية المجففة في محلول الهضم. | اجمع كل السائل في قاع الأنبوب بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية. |
| 12 | أجرِ الهضم لمدة 2 ساعة عند 37°C مع الرج بسرعة 300 rpm. | أبقِ الأغطية مغلقة بإحكام لمنع التبخر. |
| 13 | أضف 1 µL من TFA بتركيز 1.25% لتحميض ناتج الهضم. | يوقف التحميض الهضم ويهيئ الببتيدات لتحليل LC-MS/MS. |
| 14 | انقل ناتج الهضم إلى قوارير أو صفائح متوافقة مع LC-MS. | تجنب نقل الحطام غير القابل للذوبان. |
| 15 | حلّل باستخدام nano-LC-MS/MS. | استخدم حجماً متسقاً للحقن، وتدرجاً متسقاً لـ LC، وإعدادات متسقة لاكتساب بيانات MS. |
| 16 | عالج البيانات الخام باستخدام برمجيات بروتيوميات DIA أو DDA أو البروتيوميات الموجهة، بحسب الاقتضاء. | طبّق قاعدة بيانات مناسبة، وخصوصية إنزيمية مناسبة، وإعدادات تعديلات مناسبة، وحدوداً مناسبة لمعدل الاكتشافات الكاذبة (FDR). |
(راجع Mochizuki-Ono et al., 2026)
جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح متعددة الآبار UIP400MTP
لماذا المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة؟
يتيح UIP400MTP معالجة موحدة ومتوازية بالموجات فوق الصوتية للعينات صغيرة الحجم. ويكون ذلك مفيداً عندما تكون قابلية التكرار، وانخفاض كمية إدخال العينة، ومعدل معالجة العينات المتعددة أموراً مهمة.
استخدم أي صفيحة دقيقة قياسية! تحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع باستخدام UIP400MTP
استخدم مسار العمل المرجعي لبروتيوميات الحويصلات خارج الخلوية كمية إدخال من الحويصلات تعادل 5 µg من البروتين، و25 µL من الميثانول، و3 دقائق من المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام UIP400MTP، والهضم بالتريبسين/Lys-C، والتحميض باستخدام TFA، والتحليل باستخدام nano-LC-MS/MS.
الخطوات الموصى بها لتحليل LC-MS/MS وتحليل البيانات
بعد الهضم والتحميض، يمكن تحليل العينات باستخدام كروماتوغرافيا سائلة ذات طور معكوس وتدفق نانوي مقترنة بمطيافية الكتلة الترادفية عالية الدقة. وفي مسار العمل المنشور، فُصلت الببتيدات على نظام nano-LC وحُللت باستخدام الاكتساب المستقل عن البيانات على مطياف كتلة Orbitrap.
| المرحلة | التوصية | الغرض |
|---|---|---|
| تحميل العينات | استخدم عمود احتجاز C18 أو ترتيباً مكافئاً لتحميل الببتيدات. | يركّز الببتيدات ويزيل الملوثات شديدة القطبية. |
| فصل الببتيدات | استخدم كروماتوغرافيا سائلة ذات طور معكوس وتدفق نانوي. | يحسّن فصل الببتيدات وحساسية MS. |
| اكتساب بيانات MS | استخدم DIA أو DDA أو MS الموجهة، تبعاً لتصميم الدراسة. | يولّد بيانات طيفية على مستوى الببتيدات. |
| البحث في قاعدة البيانات | استخدم قاعدة بيانات مرجعية مناسبة للنوع الحيوي. | يدعم التعرف على الببتيدات والبروتينات. |
| ضبط معدل الاكتشافات الكاذبة (FDR) | طبّق حدوداً لمعدل الاكتشافات الكاذبة على مستوى الببتيدات والبروتينات. | يضبط مستوى الثقة في التعرف. |
| القياس الكمي | صدّر جداول وفرة الببتيدات والأيونات السلفية والبروتينات. | يتيح المقارنة الإحصائية بين المجموعات. |
قائمة التحقق من ضبط الجودة
- تأكد من تساوي كميات إدخال الحويصلات خارج الخلوية المكافئة للبروتين في جميع العينات.
- استخدم ترتيبات عشوائية أو متوازنة لمعالجة العينات.
- حافظ على اتساق حجم الميثانول، ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، ومدة التجفيف، وحجم الهضم.
- راقب مردود الببتيدات والعدد الإجمالي للبروتينات التي تم التعرف عليها.
- تحقق من معدل مواقع القطع غير المنفذة وتوزيع أطوال الببتيدات.
- افحص شكل القمم الكروماتوغرافية وقابلية تكرار زمن الاحتجاز.
- أدرج عينات فارغة لمراقبة الانتقال المتبقي بين العينات.
- استخدم عينات مجمّعة لضبط الجودة في الدراسات الأكبر.
- قيّم معامل التباين للمكررات.
- استخدم تحليل المكونات الرئيسية (PCA) أو طرقاً ذات صلة لتحديد تأثيرات الدفعات أو العينات الشاذة.
توصيات التوثيق
عند نشر مسار العمل هذا أو توثيقه، أبلغ عن كمية إدخال الحويصلات خارج الخلوية، وتنسيق الصفيحة، وحجم الميثانول، والسعة ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام UIP400MTP، وظروف الطرد المركزي، وطريقة التجفيف، والمحلول المنظم للهضم، وتركيز الإنزيم، ومدة الهضم، وظروف التحميض، ومنصة LC-MS/MS، ونمط اكتساب البيانات، وإصدار البرمجيات، وقاعدة البيانات، وحد معدل الاكتشافات الكاذبة (FDR)، وطريقة توحيد القيم، ومسار العمل الإحصائي.
تسجّل جميع أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة تلقائياً معلمات العملية المهمة، مثل السعة ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية ودرجة الحرارة، مع ختم التاريخ والوقت، في ملف CVS على بطاقة SD المدمجة. لم يكن توثيق البيانات لضمان قابلية التكرار وضبط الجودة أسهل من ذلك قط!
في بروتيوميات DIA، استخدم إعدادات متسقة لاكتساب البيانات لجميع العينات، وأدرج عينات مجمّعة لضبط الجودة حيثما أمكن. راقب أعداد الأيونات السلفية وثبات زمن الاحتجاز وتباين المكررات.
مسار العمل هذا مثال اختُبر في المختبر لبروتيوميات الحويصلات خارج الخلوية. وبالنسبة إلى أنواع العينات الأخرى، حسّن كمية الإدخال، وظروف المذيب، ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، وحجم الهضم، واستراتيجية الحقن في LC-MS/MS قبل توسيع النطاق إلى دراسة كاملة.
الدراسة بالتفصيل: بروتيوميات شوتغن للحويصلات خارج الخلوية في دراسة PLA2G12A
توفر دراسة PLA2G12A مثالاً ملموساً على استخدام UIP400MTP في مسار عمل لبروتيوميات شوتغن. وكان السؤال البيولوجي هو كيف يعدّل الفوسفوليباز المفرَز PLA2G12A الحويصلات خارج الخلوية المشتقة من خلايا Th17، ومن ثم يؤثر في تمايز الخلايا التائية الممرضة. وأظهر المؤلفون أن PLA2G12A يعمل على أغشية EV لإنتاج الليسوفوسفوليبيدات، بما في ذلك 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine، وأن إشارات حمض الليسوفوسفاتيديك اللاحقة عبر LPA2 تسهم في تمايز خلايا Th17. وإضافة إلى الإشارات الدهنية، فحصت الدراسات أيضاً حمولة EV، بما في ذلك محتواها من RNA والبروتين، مما جعل بروتيوميات شوتغن مكوّناً مهماً في استراتيجية التوصيف.
وفي مسار تحضير EV، زُرعت خلايا Th17 في وسط يحتوي على مصل جنيني بقري أُزيلت منه الإكسوسومات. وأُخضعت السوائل الطافية للمزارع أولاً للطرد المركزي لإزالة الخلايا، ثم رُشحت عبر مرشح 0.22 µm، ورُكّزت بالترشيح الفائق/الطرد المركزي الفائق، وغُسلت، وأُعيد تعليقها في PBS، وقِيست كميتها باستخدام اختبار البروتين BCA. وقد ضمن هذا التحضير الأولي لـ EV إمكان إدخال كمية محددة من مادة EV، مكافئة للبروتين، إلى مسار العمل البروتيومي.
ولتحليل بروتيوميات شوتغن، استخدم المؤلفون عينات EV تعادل 5 µg من البروتين. وجُففت هذه العينات في أنابيب PCR، وأُضيف 25 µL من الميثانول. ثم عولجت العينات بالموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقائق باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP. وبعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، أُخضعت العينات للطرد المركزي عند 4°C لمدة 20 دقيقة عند 19,000 × g. وبعد إزالة 20 µL من السائل الطافي، أُخضعت العينات للطرد المركزي حتى الجفاف. ثم أُذيبت البروتينات بالمعالجة بالموجات فوق الصوتية في 4 µL من محلول trypsin/Lys-C بتركيز 100 ng/µL في بيكربونات الأمونيوم بتركيز 50 mM. وأُجري الهضم لمدة 2 ساعة عند 37°C مع الرج بسرعة 300 rpm. وحُمّض ناتج الهضم باستخدام 1 µL من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك بتركيز 1.25%، ثم أُخضع لـ LC ذات التدفق النانوي المقترنة بمطيافية الكتلة الترادفية عالية الدقة.
يبرز مسار العمل هذا عدة مبادئ مفيدة لبروتيوميات EV ذات كميات الإدخال المنخفضة. أولاً، وُحدت كمية الإدخال على أساس مكافئ البروتين، وهو أمر مهم عند مقارنة EV من أنماط جينية أو معالجات مختلفة. ثانياً، استُخدم الميثانول قبل المعالجة بالموجات فوق الصوتية، مما يدعم التفكيك والاستخلاص مع تجنب أنظمة المنظفات التي قد تعقّد تحليل LC-MS/MS. ثالثاً، كانت خطوة المعالجة بالموجات فوق الصوتية قصيرة وموحدة، وهو ما يتوافق مع معالجة العينات بالتوازي. رابعاً، أُجري الهضم باستخدام trypsin/Lys-C في حجم صغير جداً، مما يقلل التخفيف ويدعم استرجاع الببتيدات عند انخفاض كمية الإدخال. وأخيراً، قلّل الانتقال المباشر من الهضم إلى التحميض وتحليل LC-MS/MS خطوات المناولة غير الضرورية.
استخدمت طريقة LC-MS/MS اللاحقة فصلاً بطور معكوس وتدفق نانوي مقترناً بمطياف كتلة Q-Exactive HF Orbitrap. واحتُجزت العينات على عمود تمهيدي C18، ثم فُصلت على عمود تحليلي قطره الداخلي 50 µm عند 200 nL/min و40°C. وامتد التدرج من نسبة منخفضة من المذيب العضوي إلى 35% من المذيب B على مدى 60 دقيقة، تلاه غسل بنسبة مرتفعة من المذيب العضوي وإعادة الاتزان. وأُجري اكتساب بيانات MS في نمط الأيونات الموجبة باستخدام الاكتساب المستقل عن البيانات مع التفكك التصادمي ذي الطاقة الأعلى. وحُللت ملفات DIA الخام باستخدام DIA-NN 1.8 مع مكتبة طيفية متنبأ بها حاسوبياً.
استخلاص البروتين بمعدل معالجة عينات مرتفع باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح ذات 96 بئراً UIP400MTP
الأسئلة الشائعة
من الأكثر استفادة من المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة في بروتيوميات شوتغن؟
تُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة مفيدة بشكل خاص لمختبرات البروتيوميات التي تعالج عينات متعددة بالتوازي، بما في ذلك المرافق المركزية، ومجموعات أبحاث البروتيوم، ومختبرات علم المناعة، وفرق الأبحاث الانتقالية، ومختبرات علوم الحياة التي تتجه نحو مسارات عمل LC-MS/MS ذات معدل معالجة عينات أعلى. وتكتسب أهمية خاصة عندما تكون قابلية التكرار من عينة إلى أخرى أمراً حاسماً.
لماذا يُستخدم UIP400MTP بدلاً من جهاز معالجة تقليدي بالموجات فوق الصوتية مزود بمسبار؟
يعالج جهاز المعالجة التقليدي بالموجات فوق الصوتية المزود بمسبار العينات عادةً واحدة تلو الأخرى، ويتطلب تنظيفاً دقيقاً بين العينات لتقليل الانتقال المتبقي بينها. ويدعم طرازا أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP وUIP550MTP المعالجة المتوازية بالموجات فوق الصوتية في صيغة قائمة على الصفائح أو صغيرة الحجم، مما يساعد على تقليل المناولة اليدوية، وتحسين الاتساق، وتبسيط تحضير عينات متعددة. كما يتيحان الدمج بسهولة في مسارات العمل المؤتمتة.
أين تقع المعالجة بالموجات فوق الصوتية ضمن مسار عمل بروتيوميات شوتغن؟
تُطبّق المعالجة بالموجات فوق الصوتية عادةً خلال مرحلة تحضير العينات السابقة للهضم. ويمكن أن تدعم التفكيك والاستخلاص والتجانس وإعادة الإذابة قبل الهضم الإنزيمي بالتريبسين أو Lys-C أو مزيج من التريبسين/Lys-C.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضاً تطبيق المعالجة بالموجات فوق الصوتية أثناء الهضم لتسريع الهضم الإنزيمي للبروتينات بدرجة كبيرة. اكتشف إمكانات هضم البروتين بمعدل معالجة عينات مرتفع باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية للحصول على مسار عمل بروتيومي سريع!
هل المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة مفيدة لبروتيوميات الحويصلات خارج الخلوية؟
نعم. الحويصلات خارج الخلوية جسيمات غنية بالدهون ومحاطة بغشاء، وقد يصعب معالجتها بطريقة قابلة للتكرار. وفي دراسات PLA2G12A المشار إليها، عولجت عينات الحويصلات خارج الخلوية بالميثانول، وبالموجات فوق الصوتية باستخدام UIP400MTP، وجُففت، وهُضمت بالتريبسين/Lys-C، وحُللت باستخدام nano-LC/MS/MS.
ما أنواع العينات التي يمكن أن تستفيد من المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة؟
يمكن أن تكون المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة مفيدة لمحللات الخلايا، وكسور العضيات، والرواسب المناعية، وتجمعات البروتينات، والعينات الغنية بالأغشية، والحويصلات خارج الخلوية، وغيرها من المستحضرات البيولوجية صغيرة الحجم. وينبغي تحسين ظروف كل نوع من العينات من حيث شدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية ومدتها، وظروف المذيب، وكمية الإدخال، واستراتيجية الهضم.
هل تحل المعالجة بالموجات فوق الصوتية محل الهضم الإنزيمي؟
لا. تساعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية في تهيئة العينة للهضم بتحسين التفكيك أو الاستخلاص أو إعادة الإذابة. ولا يزال الهضم المحلل للبروتينات ضرورياً لإنتاج الببتيدات لبروتيوميات شوتغن القائمة على تحليل الببتيدات الناتجة من هضم البروتينات.
اقرأ المزيد عن هضم البروتين المعزز بالموجات فوق الصوتية في مسارات العمل البروتيومية!
هل يتوافق UIP400MTP مع البروتيوميات ذات كميات الإدخال المنخفضة؟
نعم، يُعد تنسيق الصفائح الدقيقة مناسباً جداً لمسارات العمل صغيرة الحجم التي يكون فيها الحفاظ على العينات واتساق المعالجة مهمين. وفي مسار العمل المنشور للحويصلات خارج الخلوية، أُجري التحضير للتحليل البروتيومي باستخدام كمية إدخال من الحويصلات تعادل 5 µg من البروتين.
هل يمكن أن تحسّن المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة قابلية التكرار؟
تدعم أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية قابلية التكرار بتطبيق ظروف موحدة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية على عينات متعددة. ومع ذلك، تسهم أيضاً عوامل أخرى، مثل عزل الخلايا أو الحويصلات خارج الخلوية، وتوحيد كميات الإدخال، وكفاءة الهضم، وثبات LC-MS/MS، ومعالجة البيانات، والتحليل الإحصائي، في قابلية تكرار البروتيوميات إجمالاً.
هل تحسّن المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة عمق التعرف على البروتينات؟
قد تسهم في تحسين عمق التعرف عندما يكون تفكيك العينات أو إعادة الإذابة عاملاً محدِّداً. ويعتمد التأثير على نوع العينة، وكيمياء البروتينات، واستراتيجية التنقية، وظروف الهضم، وأداء طريقة LC-MS/MS.
ما الذي ينبغي تحسينه قبل استخدام مسار العمل بصورة روتينية؟
تشمل المعلمات الرئيسية كمية إدخال العينة، وتركيب المحلول المنظم أو المذيب، وتنسيق الصفيحة، وسعة الموجات فوق الصوتية ومدة المعالجة بها، وظروف التجفيف، وحجم الهضم، وتركيز الإنزيم، ومدة الحضانة، وكمية الحقن في LC-MS/MS. ويُوصى بإجراء اختبارات أولية قبل تطبيق مسار العمل على مجموعة تجريبية كاملة.
هل يمكن استخدام مسار العمل هذا مع بروتيوميات DIA؟
نعم. استخدم مسار العمل المرجعي للحويصلات خارج الخلوية الاكتساب المستقل عن البيانات، تلاه التحليل باستخدام DIA-NN. وتُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية في الصفائح الدقيقة جزءاً من عملية تحضير العينات الأولية، ويمكن دمجها مع طرق بروتيوميات DIA أو DDA أو البروتيوميات الموجهة.
ما مقاييس ضبط الجودة التي ينبغي مراقبتها؟
تشمل مقاييس ضبط الجودة الموصى بها مردود الببتيدات، وعدد الببتيدات ومجموعات البروتينات التي تم التعرف عليها، ومعدل مواقع القطع غير المنفذة، وتوزيع أطوال الببتيدات، وشكل القمم الكروماتوغرافية، وثبات زمن الاحتجاز، ومعامل التباين للمكررات، والانتقال المتبقي بين العينات، وفصل المجموعات البيولوجية باستخدام PCA أو طرق ذات صلة.
ما الميزة الرئيسية لدمج طرازي أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP أو UIP550MTP في تحضير العينات للتحليل البروتيومي؟
الميزة الرئيسية هي المعالجة الموحدة والمتوازية للعينات صغيرة الحجم. ويساعد ذلك المختبرات على تقليل التباين الناتج عن العمل اليدوي وتحضير العينات البيولوجية المعقدة باتساق أكبر للهضم، واكتساب بيانات LC-MS/MS، والتحليل البروتيومي الكمي.
يمكن دمج أجهزة Hielscher للمعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة بسلاسة في مسارات العمل المؤتمتة.
الأدبيات / المراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
تصنّع Hielscher Ultrasonics مجانسات عالية الأداء بالموجات فوق الصوتية تتراوح أحجامها من الحجم المختبري إلى الحجم الصناعي.