استخدام الموجات فوق الصوتية على الألواح الدقيقة في علم البروتينات بطريقة «شوتغان» – ملاحظة حول الاستخدام
تعتمد البروتيوميات الشاملة (Shotgun proteomics) على تحضير العينات بكفاءة وقابلية للتكرار من أجل تحويل المواد البيولوجية المعقدة إلى ببتيدات جاهزة للتحليل بواسطة LC-MS/MS. ويدعم جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP هذه العملية من خلال تمكين المعالجة بالموجات فوق الصوتية المعيارية والمتوازية لعينات ذات أحجام صغيرة، مما يساعد المختبرات على تحسين عمليات التفتيت والاستخلاص وإعادة الذوبان في سير العمل القائم على الصفائح الدقيقة. تصف مذكرة التطبيق هذه كيفية دمج جهاز UIP400MTP في عملية تحضير عينات البروتيوميك، باستخدام سير عمل منشور خاص بالحويصلات خارج الخلية مستمد من دراسات PLA2G12A/Th17 كمثال تم اختباره مختبريًّا.
استخدام الموجات فوق الصوتية في الألواح الدقيقة لتحقيق قابلية أكبر لتكرار نتائج البروتيوميات باستخدام طريقة «شوتغان»
بالنسبة لباحثي علم البروتينات، يُعد التحضير القابل للتكرار للعينات أمرًا بالغ الأهمية للحصول على بيانات LC-MS/MS عالية الجودة. ويدعم جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP المعالجة بالموجات فوق الصوتية المعيارية والمتوازية في سير العمل القائم على الصفائح وسير العمل ذات الأحجام الصغيرة/الإنتاجية العالية.
وهو مفيد بشكل خاص للمختبرات التي تعمل في المجالات التالية:
- مجموعات العينات الكبيرة التي تتطلب معالجة متسقة عبر العديد من الآبار
- المواد ذات المدخلات المحدودة، حيث يجب تقليل فقدان العينات والتباين إلى أدنى حد ممكن
- العينات الغنية بالدهون، مثل الحويصلات خارج الخلية
- المستحضرات البيولوجية المعقدة التي تتطلب عملية تفتيت أو استخلاص أو إعادة إذابة فعالة
- البروتيوميات المقارنة باستخدام طريقة «الشوتغان»، حيث تُعد قابلية التكرار عبر مختلف الظروف والتجارب المتكررة أمرًا أساسيًّا
من خلال دمج المعالجة بالموجات فوق الصوتية للوحات الميكروية قبل عملية الهضم، يمكن للباحثين تحسين جاهزية العينات من أجل:
- استخلاص البروتين وإعادة إذابته
- الهضم بالتريبسين/Lys-C
- جمع البيانات باستخدام تقنية Nano-LC/MS/MS
- التحليل الكمي للبروتينات في المراحل النهائية
تعرف على كيفية مساهمة المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة في الحد من التباين الناتج عن العمليات اليدوية، وتحسين تفتيت العينات، وإعداد العينات البيولوجية المعقدة من أجل إجراء تحليل موثوق به باستخدام تقنية LC-MS/MS.
يمكن أن تفيد المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة في:
- المرافق الأساسية لعلم البروتينات
- مختبرات أبحاث السيارات الكهربائية
- مختبرات علم المناعة وعلم الأحياء الخلوي
- مجموعات البحث التطبيقي
- فرق علوم الحياة التي تتوسع من تحضير العينة الواحدة إلى سير عمل ذات إنتاجية أعلى
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
تحضير العينات بقدرة إنتاجية عالية لتحليل البروتوم الحويصلات خارج الخلية
ما المقصود بـ«البروتيوميات بالبندقية»؟
أصبحت البروتيوميات الشاملة استراتيجية تحليلية أساسية لتوصيف العينات البيولوجية المعقدة، بدءًا من محلولات الخلايا الكاملة ومستخلصات الأنسجة وصولًا إلى العضيات المنقاة والحويصلات خارج الخلية والعينات السريرية ذات المدخلات المحدودة. وتكمن قوتها الأساسية في الجمع بين هضم البروتينات، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الدقة المقترنة بمطياف الكتلة الترادفي، والاستدلال الحسابي من الببتيدات إلى البروتينات. ومع ذلك، فإن جودة مجموعة بيانات البروتوموم النهائية تتحدد قبل وقت طويل من وصول العينة إلى مطياف الكتلة. ويُعد كل من التفتيت الفعال للعينة، وإذابة البروتينات، وإزالة المواد المتداخلة، والهضم الإنزيمي القابل للتكرار، والاستخلاص القوي للببتيدات، عوامل حاسمة لعمق التغطية والموثوقية الكمية.
بالنسبة لباحثي علم البروتينات ومختبرات علوم الحياة التي تعمل مع عينات محدودة أو ثمينة، غالبًا ما يمثل تحضير العينات عقبة رئيسية.
يضمن UIP400MTP إعدادا موثوقا للعينات وتكاملا سهلا مع سير عمل المختبر الحالي
التحدي الذي تمثله الحويصلات خارج الخلية في علم البروتينات
تمثل الحويصلات خارج الخلية (EVs)، على سبيل المثال، فئة عينات تتطلب عناية خاصة. فهي جسيمات نانوية محاطة بغشاء وغنية بالدهون، وتتميز بمعدل إنتاج بروتيني منخفض نسبيًا واحتمال كبير لانتقال الدهون والأملاح والمنظفات وبروتينات المصل ومكونات المصفوفة الأخرى. ويمكن أن تؤثر هذه الخصائص سلبًا على كفاءة الهضم، وأداء الكروماتوغرافيا، واستقرار الرش الكهربائي، وتحديد الببتيدات. ولذلك، يجب أن يكون سير عمل التحضير الخاص بعلم البروتينات في الحويصلات خارج الخلية (EV) قويًا بما يكفي لتفكيك هياكل الحويصلات وتحويل البروتينات المحمولة إلى حالة قابلة للذوبان، مع الحفاظ في الوقت نفسه على التوافق مع عمليات الهضم الإنزيمي اللاحقة والتحليل باستخدام LC-MS/MS.
وفي هذا السياق، يُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية المتوافقة مع الألواح الدقيقة نهجًا عمليًّا لمعالجة العينات بشكل متكرر ومتوازي. تم تصميم طرازي جهاز الموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة من Hielscher، وهما UIP400MTP (400 واط) وUIP550MTP (550 واط)، لمعالجة العينات بالموجات فوق الصوتية في الألواح متعددة الحفر والأوعية ذات الحجم الصغير، مما يدعم سير عمل ذو إنتاجية أعلى مقارنة بأجهزة الموجات فوق الصوتية التقليدية ذات المجس الواحد. بالنسبة لمختبرات البروتينوميات، يُعد هذا الشكل جذابًا لأنه يمكنه تقليل التباين الناتج عن العمل اليدوي، وتحسين المعالجة المتوازية لعينات متعددة، والاندماج بشكل أكثر طبيعية في مسارات إعداد العينات القائمة على الألواح.
سير عمل نموذجي
يُعد مسار العمل البروتوميكي الحديث الخاص بالحويصلات خارج الخلية في بيولوجيا خلايا Th17 التي يحركها PLA2G12A مثالاً مفيداً ومُختبَرًا في المختبر على كيفية دمج جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP في عملية تحضير العينات للبروتوميات بطريقة «شوتغان». في سلسلة الدراسات تلك، تمت معالجة عينات الحويصلات خارج الخلية (EV) لتحليل البروتيوم باستخدام المعالجة بالميثانول، والمعالجة بالموجات فوق الصوتية بجهاز UIP400MTP، والطرد المركزي، والتجفيف، والهضم بالتريبسين/Lys-C، والتحليل الكروماتوغرافي السائل (LC) بتدفق نانوي مقترن بمسطح الطيف الكتلي الترادفي عالي الدقة. وقد تم الإبلاغ عن هذا العمل البيولوجي لأول مرة كنسخة مسبقة على منصة bioRxiv، ثم نُشر لاحقًا في مجلة Cell Reports، حيث ساعد تحليل البروتينوم في تحديد كيفية قيام PLA2G12A بتغيير بروتينات حمولة الجسيمات الحيوية (EV) في سياق استجابات الخلايا التائية المسببة للأمراض.
جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP المخصص للوحات ذات 96 حفرة لاستخراج البروتينات بقدرة إنتاجية عالية
جهاز الموجات فوق الصوتية: UIP400MTP ميكروبليت سونيكاتير
المدخلات: ما يعادل 5 ميكروغرام من بروتين EV
الهضم: التريبسين/Lys-C
القراءة: البروتيوميات باستخدام تقنية Nano-LC-MS/MS / DIA
إرشادات تفصيلية: تحضير عينات المركبات الكهربائية بمساعدة جهاز UIP400MTP من أجل البروتيوميات باستخدام تقنية «شوتغان»
يصف هذا المسار العملي طريقة لإعداد عينات البروتيوميات باستخدام تقنية «شوتغان» للحويصلات خارج الخلية (EV) تتطلب مدخلات قليلة، وذلك باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP. ويستند هذا المسار إلى مسار عمل منشور في مجال البروتيوميات الخاصة بالحويصلات خارج الخلية (EV)، حيث تم توحيد عينات الحويصلات خارج الخلية وتجفيفها ومعالجتها بالميثانول ومعالجتها بالموجات فوق الصوتية وهضمها باستخدام التربسين/Lys-C وتحويلها إلى بيئة حمضية وتحليلها بواسطة تقنية nano-LC-MS/MS.
تُعد هذه الطريقة مخصصة لباحثي علم البروتينات ومختبرات علوم الحياة التي تقوم بإعداد الجسيمات الخارجية (EVs) أو غيرها من العينات البيولوجية ذات الحجم الصغير والغنية بالدهون، من أجل إجراء تحليل البروتينات بطريقة «الشوتغان» التصاعدية.
نظرة عامة على سير العمل
| المرحلة | الغرض | النتائج الرئيسية |
|---|---|---|
| التحضير لسيارات الكهرباء | عزل عينات الجسيمات خارج الخلية (EV) وغسلها وقياس كميتها | مدخلات EV المعيارية |
| تجفيف العينات | تخلص من السائل قبل المعالجة بمساعدة المذيبات | مادة EV المجففة |
| المعالجة بالميثانول | دعم تعطيل مادة الجسيمات الخارجية الغنية بالدهون | عينة مبللة بالميثانول |
| التصويبة بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز UIP400MTP | تشجيع التغيير الجذري، والاستخراج، والتجانس | عينة EV المعالجة |
| هضم | توليد الببتيدات من بروتينات الجسيمات خارج الخلية | هضم الببتيدات بواسطة التريبسين/ليز-سي |
| تحليل LC-MS/MS | فصل الببتيدات وكشفها وقياس كميتها | مجموعة بيانات البروتيوميات |
| تحليل البيانات | تحديد الببتيدات والبروتينات وقياس كمياتها | نتائج مستويات البروتين |
بروتوكول تفصيلي خطوة بخطوة
| درج | التعليمات | المعلمات الحاسمة |
|---|---|---|
| 1 | قم بإعداد عينات EV المنقاة باستخدام إجراءات العزل المعمول بها في المختبر. | قم بإزالة الخلايا والحطام والملوثات الرئيسية قبل الشروع في تحضير العينات لدراسة البروتينات. |
| 2 | قياس كمية البروتين الموجود في EV، على سبيل المثال باستخدام اختبار BCA. | توحيد جميع العينات بحيث تكون مدخلاتها متساوية من حيث مكافئ البروتين. |
| 3 | انقل ما يعادل 5 ميكروغرام من بروتين EV إلى أنابيب PCR نظيفة أو أنابيب متوافقة ذات حجم صغير. | استخدم أنابيب ذات قوة ربط منخفضة في الحالات التي يُخشى فيها فقدان العينة. |
| 4 | قم بتجفيف عينات EV تمامًا. | تجنب ارتفاع درجة الحرارة بشكل مفرط؛ وتأكد من عدم وجود أي سائل ظاهر. |
| 5 | أضف 25 ميكرولتر من الميثانول إلى كل عينة من عينات الجسيمات الخارجية المجففة. | تأكد من أن المادة المجففة مبللة تمامًا. |
| 6 | قم بمعالجة العينات بالموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقائق باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP. | استخدم إعدادات المعالجة بالموجات فوق الصوتية ومنطق الترتيب نفسه في جميع العينات. |
| 7 | قم بفصل العينات المعالجة بالموجات الصوتية في جهاز الطرد المركزي بسرعة 19,000 × g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. | تجنب تحريك أي حبيبات أو مواد غير قابلة للذوبان بعد عملية الطرد المركزي. |
| 8 | اسحب بعناية 20 ميكرولتر من السائل الطافي. | استخدم تقنية سحب العينات بالماصة بشكل متسق مع جميع العينات. |
| 9 | جفف العينة المتبقية تمامًا. | انتقل مباشرةً إلى عملية الهضم أو قم بتخزينه فقط في ظل ظروف تم التحقق من صحتها. |
| 10 | أضف 4 ميكرولتر من محلول التريبسين/Lys-C بتركيز 100 نانوغرام/ميكرولتر في محلول بيكربونات الأمونيوم 50 مليمولار. | قم بإعداد محلول إنزيمي طازج أو استخدم عينات مخزنة بشكل سليم. |
| 11 | قم بالتعريض للموجات فوق الصوتية لفترة وجيزة لإذابة المادة البروتينية المجففة في محلول الهضم. | اجمع كل السائل الموجود في قاع الأنبوب بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية. |
| 12 | يُهضم المزيج لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع التقليب بسرعة 300 دورة في الدقيقة. | احرص على إغلاق الأغطية بإحكام لمنع التبخر. |
| 13 | أضف 1 ميكرولتر من حمض الفورميك 1.25% لتحمض محلول الهضم. | يؤدي التحمض إلى إيقاف عملية الهضم وإعداد الببتيدات للتحليل بواسطة LC-MS/MS. |
| 14 | انقل المستخلص إلى قوارير أو لوحات متوافقة مع تقنية LC-MS. | تجنب نقل الحطام غير القابل للذوبان. |
| 15 | تحليل باستخدام تقنية nano-LC-MS/MS. | استخدم حجم حقن ثابتًا، وتدرج LC، وإعدادات ثابتة لالتقاط بيانات MS. |
| 16 | معالجة البيانات الأولية باستخدام برامج DIA أو DDA أو برامج البروتيوميات الموجهة، حسب الاقتضاء. | استخدم قاعدة البيانات المناسبة، وخصوصية الإنزيم، وإعدادات التعديل، وعتبات FDR. |
صوتنة لوحة متعددة الآبار UIP400MTP
لماذا يُستخدم المعالجة بالموجات فوق الصوتية للوحات الميكروية؟
يتيح جهاز UIP400MTP إجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية بشكل متوازٍ وموحد لعينات ذات أحجام صغيرة. ويُعد ذلك مفيدًا عندما تكون قابلية التكرار، وقلة كمية العينة المدخلة، وإنتاجية معالجة عينات متعددة من الأمور المهمة.
استخدم أي لوحة ميكروية قياسية! تحضير العينات بقدرة إنتاجية عالية باستخدام جهاز UIP400MTP
استخدم مسار عمل البروتيوميات الخاص بالجسيمات الخارجية (EV) المشار إليه كمية مدخلة من الجسيمات الخارجية تعادل 5 ميكروغرام من البروتين، و25 ميكرولتر من الميثانول، ومعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز UIP400MTP لمدة 3 دقائق، وهضم بالتريبسين/Lys-C، وتحمض باستخدام حمض TFA، وتحليل بواسطة تقنية nano-LC-MS/MS.
خطوات LC-MS/MS الموصى بها وتحليل البيانات
بعد عملية الهضم والتحمض، يمكن تحليل العينات باستخدام كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي بتدفق نانوي مقترنة بمطياف الكتلة الترادفي عالي الدقة. وفي سير العمل المنشور، تم فصل الببتيدات على نظام كروماتوغرافيا السائل النانوي وتحليلها بواسطة تقنية «الاقتناء المستقل عن البيانات» على مطياف الكتلة من طراز Orbitrap.
| المرحلة | توصية | الغرض |
|---|---|---|
| تحميل العينة | استخدم مصيدة C18 أو أي نظام مكافئ لتحميل الببتيدات. | يعمل على تركيز الببتيدات وإزالة الشوائب شديدة القطبية. |
| فصل الببتيدات | استخدم كروماتوغرافيا السائل ذات التدفق النانوي والمرحلة العكسية. | يحسّن فصل الببتيدات وحساسية الطيف الكتلي. |
| الاستحواذ على شركة MS | استخدم طريقة DIA أو DDA أو MS الموجهة، حسب تصميم الدراسة. | يُنتج بيانات طيفية على مستوى الببتيدات. |
| البحث في قاعدة البيانات | استخدم قاعدة بيانات مرجعية مناسبة للأنواع. | يدعم تحديد الببتيدات والبروتينات. |
| التحكم في FDR | تطبيق عتبات معدل الاكتشاف الخاطئ للببتيدات والبروتينات. | يتحكم في درجة الثقة في تحديد الهوية. |
| التحديد الكمي | تصدير جداول وفرة الببتيدات والسلائف والبروتينات. | يتيح إجراء مقارنة إحصائية بين المجموعات. |
قائمة مراجعة مراقبة الجودة
- تأكد من تساوي كمية البروتين المكافئ للطاقة الكهربائية (EV) في جميع العينات.
- استخدم تخطيطات معالجة العينات العشوائية أو المتوازنة.
- يجب الحفاظ على ثبات حجم الميثانول، ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، ومدة التجفيف، وحجم عملية الهضم.
- مراقبة معدل إنتاج الببتيدات وتحديد أنواع البروتينات الإجمالية.
- تحقق من معدل الانقسام الفائت وتوزيع أطوال الببتيدات.
- افحص شكل الذروة الكروماتوغرافية وقابلية تكرار زمن الاستبقاء.
- أدرج فراغات لمراقبة الترحيل.
- استخدم عينات مراقبة الجودة المجمعة في الدراسات الأكبر حجمًا.
- تقييم معامل التباين المتكرر.
- استخدم تحليل المكونات الرئيسية (PCA) أو الأساليب ذات الصلة لتحديد تأثيرات الدُفعات أو العينات الشاذة.
توصيات بشأن تدوين المحاضر
عند نشر أو توثيق سير العمل هذا، يجب الإبلاغ عن كمية مدخلات EV، وشكل اللوحة، وحجم الميثانول، والسعة، ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية لجهاز UIP400MTP، وظروف الطرد المركزي، وطريقة التجفيف، ومحلول الهضم، وتركيز الإنزيم، ومدة الهضم، وظروف التحمض، منصة LC-MS/MS، ووضع التقاط البيانات، وإصدار البرنامج، وقاعدة البيانات، وعتبة FDR، وطريقة التوحيد، وسير العمل الإحصائي.
تقوم جميع أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة من Hielscher بتسجيل معلمات العملية المهمة تلقائيًا، مثل السعة ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية ودرجة الحرارة، مع توثيق التاريخ والوقت، في شكل ملف CSV على بطاقة SD المدمجة. لم يكن تسجيل البيانات من أجل قابلية التكرار ومراقبة الجودة أسهل من أي وقت مضى!
بالنسبة لعلم البروتينات باستخدام تقنية DIA، استخدم إعدادات جمع بيانات متسقة في جميع العينات، وقم بتضمين عينات مراقبة الجودة المجمعة حيثما أمكن ذلك. راقب أعداد السلائف، واستقرار زمن الاحتفاظ، وتقلب التكرارات.
يُعد هذا المسار العملي مثالاً تم اختباره مختبريًّا في مجال البروتيوميات الخاصة بالمركبات الكهربائية. بالنسبة لأنواع العينات الأخرى، يجب تحسين كمية العينة المدخلة، وظروف المذيب، ومدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية، وحجم عملية الهضم، واستراتيجية الحقن في جهاز LC-MS/MS قبل توسيع نطاق الدراسة لتشمل دراسة كاملة.
الدراسة بالتفصيل: دراسة البروتيوميات باستخدام تقنية EV Shotgun في جين PLA2G12A
تقدم دراسة PLA2G12A مثالاً ملموساً على استخدام UIP400MTP في مسار عمل البروتيوميك «الشوتغان». وكان السؤال البيولوجي المطروح هو: كيف يقوم الفوسفوليباز المفرز PLA2G12A بتعديل الحويصلات خارج الخلية المشتقة من خلايا Th17، وبالتالي يؤثر على تمايز الخلايا التائية المسببة للأمراض. أظهر المؤلفون أن PLA2G12A يعمل على أغشية الحويصلات خارج الخلية لإنتاج الليزوفوسفوليبيدات، بما في ذلك 1-أوليويل-ليزوفوسفاتيديل إيثانولامين، وأن إشارات حمض الليزوفوسفاتيديك اللاحقة عبر LPA2 تساهم في تمايز الخلايا Th17. وبالإضافة إلى إشارات الدهون، فحصت الدراسات أيضًا حمولة الحويصلات خارج الخلية، بما في ذلك محتوى الحمض النووي الريبي (RNA) والبروتينات، مما جعل علم البروتينات الشامل (shotgun proteomics) مكونًا مهمًا في استراتيجية التوصيف.
في مسار عمل تحضير EV، تمت زراعة خلايا Th17 في وسط يحتوي على مصل جنيني بقري خالٍ من الإكسوسومات. تم أولاً طرد سوائل الاستزراع لإزالة الخلايا، ثم ترشيحها عبر مرشح 0.22 ميكرومتر، وتركيزها عن طريق الترشيح الفائق/الطرد المركزي الفائق، وغسلها، وإعادة تعليقها في محلول PBS، وقياس كميتها باستخدام اختبار البروتين BCA. وقد ضمنت عملية تحضير الجسيمات خارج الخلية (EV) هذه إمكانية نقل كمية محددة من مادة الجسيمات خارج الخلية (EV)، تعادل كمية معينة من البروتين، إلى عملية تحليل البروتينات.
لإجراء التحليل البروتومي الشامل، استخدم المؤلفون عينات من الجسيمات الخارجية (EV) تعادل 5 ميكروغرام من البروتين. جُففت هذه العينات في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ثم أُضيف إليها 25 ميكرولتر من الميثانول. بعد ذلك، خضعت العينات للمعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 3 دقائق باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP. بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، تم طرد العينات عند 4°C لمدة 20 دقيقة عند 19,000 × g. وبعد إزالة 20 ميكرولتر من السائل الطافي، تم طرد العينات حتى الجفاف. ثم تم إذابة البروتينات بالتعريض للموجات فوق الصوتية في 4 ميكرولتر من محلول التريبسين/Lys-C بتركيز 100 نانوغرام/ميكرولتر في 50 مليمولار من بيكربونات الأمونيوم. أُجريت عملية الهضم لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع الهز بسرعة 300 دورة في الدقيقة. تم تحمض المنتج الناتج عن الهضم باستخدام 1 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 1.25٪، ثم خضع لتحليل كروماتوغرافيا السائل النانوية (nano-flow LC) المقترنة بمطياف الكتلة الترادفي عالي الدقة.
يُبرز مسار العمل هذا عدة مبادئ مفيدة في مجال البروتيوميات الخاصة بالجسيمات الحيوية (EV) ذات المدخلات المنخفضة. أولاً، تمت معايرة المدخلات وفقاً لمكافئ البروتين، وهو أمر مهم عند مقارنة الجسيمات الحيوية من أنماط جينية أو معالجات مختلفة. ثانياً، استُخدم الميثانول قبل المعالجة بالموجات فوق الصوتية، مما ساعد على تفتيت الجسيمات واستخلاصها مع تجنب استخدام أنظمة المنظفات التي قد تعقّد عملية التحليل بواسطة LC-MS/MS. ثالثًا، كانت خطوة المعالجة بالموجات فوق الصوتية قصيرة وموحدة، وهو ما يتوافق مع المعالجة المتوازية للعينات. رابعًا، أُجري الهضم باستخدام التريبسين/Lys-C في حجم صغير جدًّا، مما قلل من التخفيف وساعد على استخلاص الببتيدات من العينات ذات المدخلات المنخفضة. وأخيرًا، أدى الانتقال المباشر من مرحلة الهضم إلى مرحلة التحمض ثم إلى تحليل LC-MS/MS إلى تقليل خطوات المعالجة غير الضرورية إلى أدنى حد.
استخدمت طريقة LC-MS/MS في المرحلة النهائية فصل الطور العكسي بتدفق نانوي مقترنًا بمطياف كتلة Q-Exactive HF Orbitrap. تم احتجاز العينات في عمود تمهيدي من نوع C18، ثم تم فصلها في عمود تحليلي بقطر داخلي يبلغ 50 ميكرومتر بمعدل تدفق 200 نانولتر/دقيقة ودرجة حرارة 40 درجة مئوية. امتد التدرج من مذيب عضوي منخفض إلى 35% من المذيب B على مدار 60 دقيقة، تلاه غسل بمذيب عضوي عالي وإعادة التوازن. تم إجراء التقاط MS في وضع الأيونات الموجبة باستخدام التقاط مستقل عن البيانات مع تفكك تصادمي عالي الطاقة. تم تحليل الملفات الأولية لـ DIA باستخدام برنامج DIA-NN 1.8 مع مكتبة طيفية متوقعة حاسوبياً.
استخلاص البروتينات بقدرة إنتاجية عالية مع لوحة سونيكاتور 96 بئر UIP400MTP
أسئلة مكررة
من الذي يستفيد أكثر من استخدام الموجات فوق الصوتية في الألواح الدقيقة في علم البروتينات بطريقة «شوتغان»؟
تُعد تقنية المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة مفيدة بشكل خاص لمختبرات البروتيوميات التي تعالج عينات متعددة بشكل متوازٍ، بما في ذلك المرافق الأساسية، ومجموعات أبحاث البروتيوميات، ومختبرات علم المناعة، وفرق الأبحاث التطبيقية، ومختبرات علوم الحياة التي تتجه نحو سير عمل LC-MS/MS ذات إنتاجية أعلى. وتكتسب هذه التقنية أهمية خاصة عندما تكون قابلية التكرار بين العينات أمراً بالغ الأهمية.
لماذا يُفضل استخدام جهاز UIP400MTP بدلاً من جهاز الموجات فوق الصوتية التقليدي المزود بمسبار؟
عادةً ما يعالج جهاز الموجات فوق الصوتية التقليدي العينات واحدة تلو الأخرى، ويتطلب تنظيفًا دقيقًا بين كل عينة وأخرى للحد من انتقال المواد. تدعم طرازات أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة UIP400MTP وUIP550MTP المعالجة المتوازية بالموجات فوق الصوتية في صيغة تعتمد على الصفائح أو ذات الحجم الصغير، مما يساعد على تقليل المعالجة اليدوية وتحسين الاتساق وتبسيط عملية تحضير العينات المتعددة. كما تتيح هذه الأجهزة سهولة الدمج في سير العمل الآلي.
ما هو دور المعالجة بالموجات فوق الصوتية في سير عمل البروتيوميات باستخدام طريقة «الشوتغان»؟
عادةً ما يتم استخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية خلال مرحلة التحضير المسبق للعينات قبل عملية الهضم. ويمكن أن تساعد هذه المعالجة في تفتيت الخلايا، والاستخلاص، والتجانس، وإعادة الذوبان قبل إجراء عملية الهضم الإنزيمي باستخدام التربسين، أو Lys-C، أو خليط من التربسين وLys-C.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضًا استخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية أثناء عملية الهضم لتسريع عملية الهضم الإنزيمي للبروتينات بشكل ملحوظ. اكتشف إمكانات هضم البروتينات بقدرة معالجة عالية باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية من أجل سير عمل سريع في مجال البروتيوميات!
هل يُعد استخدام الموجات فوق الصوتية على الألواح الدقيقة مفيدًا في علم البروتينات الخاصة بالحويصلات خارج الخلية؟
نعم. الحويصلات خارج الخلية هي جسيمات غنية بالدهون ومحاطة بغشاء، وقد يكون من الصعب معالجتها بطريقة قابلة للتكرار. في الدراسات المشار إليها حول PLA2G12A، عولجت عينات الحويصلات خارج الخلية بالميثانول، وعولجت بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز UIP400MTP، ثم جُففت، وهُضمت باستخدام التربسين/Lys-C، وحُللت بواسطة تقنية nano-LC/MS/MS.
ما هي أنواع العينات التي يمكن أن تستفيد من المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام الألواح الدقيقة؟
يمكن أن يكون المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام الألواح الدقيقة مفيدة في معالجة مستخلصات الخلايا، وفصائل العضيات، والمستخلصات المناعية، وتكتلات البروتينات، والعينات الغنية بالأغشية، والحويصلات خارج الخلية، وغيرها من المستحضرات البيولوجية ذات الحجم الصغير. وينبغي تحسين كل نوع من العينات من حيث شدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية ومدتها، وظروف المذيب، وكمية العينة المدخلة، واستراتيجية الهضم.
هل يحل المعالجة بالموجات فوق الصوتية محل الهضم الإنزيمي؟
لا. تساعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية في تجهيز العينة لعملية الهضم من خلال تحسين عملية التفتيت أو الاستخلاص أو إعادة الذوبان. ولا تزال عملية الهضم البروتيني ضرورية لتوليد الببتيدات اللازمة لعلم البروتينات «الشتغون» (shotgun) القائم على نهج «من الأسفل إلى الأعلى».
اقرأ المزيد عن هضم البروتينات المدعوم بالموجات فوق الصوتية في سير عمل البروتيوميات!
هل جهاز UIP400MTP متوافق مع تقنيات البروتيوميك ذات المدخلات المنخفضة؟
نعم، يُعد تنسيق الألواح الدقيقة مناسبًا تمامًا لسير العمل الذي يتضمن أحجامًا صغيرة من العينات، حيث يُعد الحفاظ على العينات والمعالجة المتسقة أمرين مهمين. وفي سير العمل المنشور المتعلق بالجسيمات خارج الخلية (EV)، تم إجراء التحضير البروتيني باستخدام مدخلات من الجسيمات خارج الخلية (EV) تعادل 5 ميكروغرام من البروتين.
هل يمكن أن يؤدي استخدام الموجات فوق الصوتية في الألواح الدقيقة إلى تحسين قابلية التكرار؟
تدعم أجهزة الموجات فوق الصوتية من Hielscher قابلية التكرار من خلال تطبيق شروط معيارية للمعالجة بالموجات فوق الصوتية على عينات متعددة. ومع ذلك، هناك عوامل أخرى، مثل عزل الخلايا أو الجسيمات خارج الخلية (EV)، وتوحيد المدخلات، وكفاءة الهضم، واستقرار LC-MS/MS، ومعالجة البيانات، والتحليل الإحصائي، تساهم هي الأخرى في قابلية التكرار الإجمالية في مجال البروتيوميات.
هل يؤدي استخدام الموجات فوق الصوتية في الألواح الدقيقة إلى تحسين دقة تحديد البروتينات؟
قد يسهم ذلك في تحسين عمق التحديد عندما يكون تفتيت العينة أو إعادة إذابتها عاملاً مقيداً. ويعتمد هذا التأثير على نوع العينة، والخصائص الكيميائية للبروتين، واستراتيجية التنقية، وظروف الهضم، وأداء طريقة LC-MS/MS.
ما الذي يجب تحسينه قبل استخدام مسار العمل بشكل روتيني؟
تشمل المعلمات الرئيسية: عينة الإدخال، وتركيب المخزن المؤقت أو المذيب، وشكل اللوحة، وسعة الموجات فوق الصوتية ومدتها، وظروف التجفيف، وحجم عملية الهضم، وتركيز الإنزيم، ووقت الحضانة، وكمية الحقن في جهاز LC-MS/MS. يُوصى بإجراء اختبار تجريبي قبل تطبيق سير العمل على مجموعة تجريبية كاملة.
هل يمكن استخدام هذا المسار العملي مع علم البروتينات في DIA؟
نعم. استخدمت عملية العمل المشار إليها في مجال EV تقنية «الاقتناء المستقل عن البيانات» (DIA)، تليها تحليل DIA-NN. ويُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الميكروية جزءًا من عملية تحضير العينات الأولية، ويمكن دمجها مع تقنيات DIA أو DDA أو طرق البروتيوميات الموجهة.
ما هي مؤشرات مراقبة الجودة التي ينبغي رصدها؟
تشمل مؤشرات مراقبة الجودة الموصى بها: إنتاجية الببتيدات، وعدد الببتيدات والمجموعات البروتينية التي تم تحديدها، ومعدل الانقسام الفائت، وتوزيع أطوال الببتيدات، وشكل الذروة الكروماتوغرافية، واستقرار زمن الاحتجاز، ومعامل التباين بين التكرارات، والتحمل، وفصل المجموعات البيولوجية باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) أو الطرق ذات الصلة.
ما هي الميزة الرئيسية لدمج أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة من طرازي UIP400MTP أو UIP550MTP في عملية تحضير عينات علم البروتينات؟
وتتمثل الميزة الرئيسية في المعالجة المعيارية والمتوازية للعينات ذات الحجم الصغير. ويساعد ذلك المختبرات على الحد من التباين الناتج عن العمليات اليدوية، وإعداد العينات البيولوجية المعقدة بطريقة أكثر اتساقًا من أجل عملية الهضم، وجمع البيانات باستخدام تقنية LC-MS/MS، والتحليل البروتيني الكمي.
يمكن دمج أجهزة الموجات فوق الصوتية للصفائح الدقيقة من Hielscher بسلاسة في سير العمل الآلي.
الأدب / المراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher الفوق صوتيات بتصنيع الخالط بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء من المختبر ل الحجم الصناعي.