Provförberedelse med hög genomströmning för mitokondriell diagnostik
Mitokondriell diagnostik inom forskning och kliniker utförs med hjälp av olika tekniker som sekvensering, PCR och biokemiska analyser. Dessa metoder används för att identifiera DNA-mutationer och mäta mitokondriell funktion. Sekvensering hjälper till att upptäcka genetiska mutationer, medan PCR kan kvantifiera specifika DNA-sekvenser. Biokemiska analyser utvärderar funktionaliteten hos mitokondriella proteiner och enzymer.
Diagnostiken av mitokondriella sjukdomar är särskilt svår på grund av den uttalade kliniska variabiliteten hos dessa sjukdomar samt på grund av det komplexa samspelet mellan två olika ärftliga genom: mitokondriellt DNA (mtDNA) och kärngenomet.
DNA-extraktion och fragmentering med hjälp av ultraljudsbehandling
DNA-extraktion från muskelvävnad är särskilt användbart vid misstanke om vävnadsspecifika förändringar i mtDNA. Dessa förändringar kan innefatta deletioner av mtDNA vid kronisk progressiv extern oftalmoplegi (CPEO), punktmutationer av mtDNA vid mitokondriella myopatier eller utarmning av mtDNA vid Alpers syndrom. Det DNA som utvinns från muskelvävnad kan sedan användas för olika genetiska tester, såsom Southern blot och långdistans-PCR för deletioner, realtids-PCR för utarmning eller sekvensering för punktmutationer.
Ultraljudsbehandling, med hjälp av intensiva ultraljudsvågor, används för flera tillämpningar inom mitokondriell diagnostik. Det används för att lysera celler för att extrahera intracellulärt innehåll som mitokondrier och DNA, för att skjuva DNA som mtDNA och nDNA för sekvensering och för att homogenisera prover.
UIP400MTP Plate Sonicator för provberedning med hög genomströmning Enhetligt sonikerar prover i flerbrunns- och 96-brunnsplattor
Hur man isolerar mitokondrier från celler och vävnader
Mitokondriell isolering består av två viktiga steg: att störa celler för att frigöra deras innehåll och att använda differentiell centrifugering för att separera och återvinna mitokondriella fraktioner.
ultraljudsbehandling
Hielscher sonikatorer är kompatibla med standard lysbuffertar och kit, vilket gör dem lämpliga för isolering av mitokondrier. Ultraljudsbehandling tjänar två huvudsyften:
- Celllys: Ultraljudsvågorna stör cellmembranen och frigör intracellulärt innehåll.
- Mitokondriell störning: Ultraljudsbehandling i ett efterföljande steg kan bryta upp mitokondrierna för att frigöra mitokondriella proteiner eller mitokondriellt DNA.
- mtDNA-fragmentering: Ultraljudsbehandling är en pålitlig teknik för att skjuva mitokondriellt DNA för sekvensering.
Multi-well plate sonicator UIP400MTP möjliggör provberedning av mitokondriella prover med hög genomströmning. I samband med differentiell centrifugering, ultraljudsbehandling förbättrar effektiviteten av mitokondriell isolering, vilket säkerställer höga utbyten av intakta mitokondrier som är lämpliga för olika nedströms applikationer.
Hielscher UIP400MTP multiwell platta sonikator Fungerar med vilken standardplatta som helst
Ultraljudssonden med flera brunnar erbjuder UIP400MTP många fördelar för provberedning med hög genomströmning, t.ex. vid mitokondriell diagnostik.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator för provberedning med hög genomströmning inom biomarkördiagnostik.
Exemplariska instruktioner för ultraljud mtDNA-fragmentering
Förberedelse och extraktion:
- C57BL/6-möss avlivades genom cervikal luxation.
- Levern extraherades snabbt och tvättades i iskall steril PBS.
Isolering av mitokondrier:
- Mitokondrierna isolerades med hjälp av en 2-ml Dounce vävnadskvarn och ett mitokondriellt isoleringskit för vävnad.
- Initial centrifugering vid 700× g och 3 000× g.
- Utför ytterligare två tvättsteg med buffert C.
DNA-isolering:
- Pelleten från den första centrifugeringen vid 700× g användes för att isolera kärn-DNA (nDNA).
- DNA isolerades med hjälp av spinnkolonner.
- Mitokondriellt DNA (mtDNA) extraherades från isolerade mitokondrier.
- Nukleärt DNA (nDNA) extraherades från råa kärnextrakt, båda från levervävnad från möss.
DNA-fragmentering:
- DNA fragmenterades på is med hjälp av en 30 kHz/50-W ultraljudssonikator UP50H med en 0,5 mm mikrospetssonotrode vid 14 μm i 2 × 30 sekunder.
Fragmentering, visualisering och kvantifiering:
- Fragmentering efter ultraljud visualiserades på en 1% agarosgel med SYBR säkert DNA-färgämne.
- Den relativa förekomsten av mtDNA och nDNA bestämdes med qPCR.
(jfr Mariero et al., 2019)
För provberedning med hög genomströmning underlättar multi-well plate sonicator UIP400MTP framställningen av stora provantal i standard 96-brunnars, multi-brunnar och mikrotiterplattor.
Läs mer om fördelarna med provförberedelse med hög genomströmning med hjälp av UIP400MTP!
Tips för optimal mitokondriell isolering med hjälp av ultraljudsbehandling:
- Temperaturreglering: Utför alla steg vid ett temperaturområde på 0°C till 4°C. Detta är avgörande för att upprätthålla mitokondriernas integritet och funktionalitet.
- Effektivitet och hastighet: Arbeta snabbt och rena mitokondrierna endast i den utsträckning som krävs för din specifika applikation. Överdriven manipulation kan leda till betydande förluster av mitokondriellt innehåll.
- Utspädning av suspensioner: Upprätthåll låga koncentrationer av cell- och organellsuspensioner under hela isoleringsprocessen. Detta bidrar till att minimera riskerna för fastklämning och agglutination och förbättrar därmed renheten hos de isolerade mitokondrierna.
- Provvolym: Välj flera småskaliga förberedelser i stället för en enda stor. Detta tillvägagångssätt resulterar vanligtvis i bättre avkastning, eftersom uppskalning inte proportionellt ökar mängden utvinningsbara mitokondrier. Multi-well plattan sonikator UIP400MTP underlättar snabb och tillförlitlig lys av cellen för mitokondrier isolering samt protein extraktion från mitokondrier.
Dessa riktlinjer kommer att göra isoleringsprocessen med ultraljudslys och centrifugering mer effektiv, vilket ger mitokondriella preparat av hög kvalitet som är lämpliga för nedströmsapplikationer.
Hielscher ultraljudsapparater – Kvalitet tillverkad i Tyskland
Hielscher ultraljudsapparater är välkända för sina högsta kvalitets- och designstandarder. Robusthet och enkel drift möjliggör en smidig integration av våra ultraljudsapparater i industriella anläggningar. Tuffa förhållanden och krävande miljöer hanteras enkelt av Hielscher ultraljudsapparater.
Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och användarvänligheten. Naturligtvis är Hielscher ultraljudsapparater CE-kompatibla och uppfyller kraven i UL, CSA och RoHs.
96-brunnars platta sonikator UIP400MTP för ultraljudsbehandling av mikrotiter och multibrunnsplattor
Litteratur / Referenser
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Vanliga frågor om mitokondrier och mitokondriell diagnostik
Vad är mitokondrier?
Mitokondrier är membranbundna organeller som finns i cellerna hos de flesta eukaryota organismer. De är kända som cellens kraftverk eftersom de producerar energi i form av adenosintrifosfat (ATP) genom processen med cellulär andning. Dessutom har mitokondrier sitt eget DNA och spelar nyckelroller i andra cellulära processer, inklusive regleringen av cellcykeln och celldöd.
Vad skiljer mtDNA från genomiskt DNA?
Mitokondriellt DNA (mtDNA) skiljer sig från genomiskt DNA (gDNA) på flera viktiga sätt. MtDNA finns i mitokondrierna, är cirkulärt och ärvs från modern, medan gDNA finns i cellkärnan, är linjärt och ärvs från båda föräldrarna. MtDNA är mycket mindre och kodar för endast 37 gener, medan gDNA innehåller cirka 20 000-25 000 gener. MtDNA finns i flera kopior per cell, har en högre mutationshastighet och kodar främst för proteiner som är involverade i mitokondriell funktion. Däremot är gDNA typiskt diploid, har en lägre mutationshastighet och kodar för ett stort antal gener som är nödvändiga för organismens utveckling och funktion. Dessutom sker mtDNA-transkription och translation inom mitokondrierna, medan gDNA-transkription sker i kärnan och translation sker i cytoplasman. Dessa skillnader återspeglar deras distinkta roller och evolutionära ursprung.
Vad är cellfritt extrakt?
Ett cellfritt extrakt är en lösning som innehåller innehållet i lyserade celler, inklusive proteiner, nukleinsyror och andra cellulära komponenter, men utan intakta cellmembran. Detta extrakt används inom biokemisk och molekylärbiologisk forskning för att studera cellulära processer in vitro, vilket gör det möjligt för forskare att analysera reaktioner och mekanismer utanför levande celler.
Vilken roll spelar PCR-tester vid mitokondriell diagnostik?
PCR-tester spelar en avgörande roll i mitokondriell diagnostik genom att möjliggöra upptäckt av mutationer, deletioner eller kopienummervariationer i mitokondriellt DNA (mtDNA). De gör det möjligt att amplifiera specifika mtDNA-regioner för att identifiera patogena varianter som är associerade med mitokondriella sjukdomar. PCR-baserade tekniker, såsom kvantitativ PCR (qPCR) och långdistans-PCR, används också för att bedöma mtDNA-integritet, heteroplasminivåer och mtDNA-utarmning, vilket ger viktiga insikter om mitokondriell funktion och sjukdom.
Lär dig hur UIP400MTP Microplate Sonicator underlättar PCR-tester och analyser!
Vad är differentiell centrifugering?
Differentiell centrifugering är en allmänt använd teknik för cellfraktionering och mitokondriell isolering. Denna metod separerar cellulära strukturer baserat på deras sedimentationskoefficient, som beror på både densitet och form. Processen innebär att man applicerar olika nivåer av centrifugalkraft på prover i buffrade saltlösningar med specifika densiteter. Strukturer med liknande sedimenteringskoefficienter kommer att sätta sig på botten av uppsamlingsröret samtidigt, vilket gör det möjligt för dem att återhämta sig.
Hur används differentiell centrifugering för mitokondriisolering?
Differentiell centrifugering gör det möjligt för forskare att effektivt separera mitokondriella fraktioner från andra cellulära komponenter. Isolering av mitokondrier innebär flera centrifugeringssteg och efterföljande återvinning av isolatet.
Initial centrifugering: Applicera en låg centrifugalkraft på sediment av stora cellulära rester och kärnor.
Efterföljande centrifugeringar: Öka centrifugalkraften stegvis till pelletfraktioner berikade med mitokondrier. Varje centrifugeringssteg avlägsnar strukturer med progressivt högre sedimenteringskoefficienter.
Fraktion återvinning: Efter varje centrifugering samlas pelleten upp och supernatanten utsätts för högre g-krafter för att isolera nästa fraktion. Detta upprepas tills den önskade renheten hos mitokondrierna uppnås.