Provberedning med hög provgenomströmning för mitokondriell diagnostik
Mitokondriell diagnostik inom forskning och klinisk verksamhet utförs med olika tekniker såsom sekvensering, PCR och biokemiska analyser. Dessa metoder används för att identifiera DNA-mutationer och mäta mitokondriell funktion. Sekvensering hjälper till att upptäcka genetiska mutationer, medan PCR kan kvantifiera specifika DNA-sekvenser. Biokemiska analyser utvärderar funktionen hos mitokondriella proteiner och enzymer.
Diagnostiken av mitokondriella sjukdomar är särskilt svår på grund av dessa sjukdomars uttalade kliniska variabilitet samt det komplexa samspelet mellan två genom som nedärvs på olika sätt: mitokondriellt DNA (mtDNA) och kärngenomet.
DNA-extraktion och fragmentering med ultraljudsbehandling
DNA-extraktion från muskelvävnad är särskilt användbar när vävnadsspecifika förändringar i mtDNA misstänks. Dessa förändringar kan innefatta deletioner i mtDNA vid kronisk progressiv extern oftalmoplegi (CPEO), punktmutationer i mtDNA vid mitokondriella myopatier eller utarmning av mtDNA vid Alpers syndrom. Det DNA som extraheras från muskelvävnad kan sedan användas för olika genetiska tester, såsom Southern blot och långdistans-PCR för deletioner, realtids-PCR för utarmning eller sekvensering för punktmutationer.
Ultraljudsbehandling med intensiva ultraljudsvågor används för flera tillämpningar inom mitokondriell diagnostik. Den används för att lysera celler för att extrahera intracellulärt innehåll såsom mitokondrier och DNA, för att fragmentera DNA såsom mtDNA och nDNA genom skjuvning inför sekvensering samt för att homogenisera prover.
Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för plattor för provberedning med hög provgenomströmning ultraljudsbehandlar prover jämnt i flerbrunnsplattor och plattor med 96 brunnar
Så isoleras mitokondrier från celler och vävnader
Isolering av mitokondrier omfattar två viktiga steg: att bryta sönder celler för att frigöra deras innehåll och att använda differentialcentrifugering för att separera och tillvarata mitokondriefraktioner.
Ultraljudsbehandling
Hielschers ultraljudsbehandlare är kompatibla med standardbuffertar och satser för lys, vilket gör dem lämpliga för isolering av mitokondrier. Ultraljudsbehandling har två huvudsakliga syften:
- Cellys: Ultraljudsvågorna bryter sönder cellmembran och frigör intracellulärt innehåll.
- Sönderdelning av mitokondrier: Ultraljudsbehandling i ett efterföljande steg kan bryta upp mitokondrierna för att frigöra mitokondriella proteiner eller mitokondriellt DNA.
- mtDNA-fragmentering: Ultraljudsbehandling är en tillförlitlig teknik för att fragmentera mitokondriellt DNA genom skjuvning inför sekvensering.
Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor möjliggör beredning av mitokondriella prover med hög provgenomströmning. I kombination med differentialcentrifugering effektiviserar ultraljudsbehandling isoleringen av mitokondrier och säkerställer höga utbyten av intakta mitokondrier som är lämpliga för olika efterföljande tillämpningar.
Hielscher UIP400MTP ultraljudsbehandlare för flerbrunnsplattor fungerar med alla standardplattor
Ultraljudsbehandlaren UIP400MTP för flerbrunnsplattor erbjuder många fördelar för provberedning med hög provgenomströmning, exempelvis inom mitokondriell diagnostik.
UIP400MTP ultraljudsbehandlare för flerbrunnsplattor för provberedning med hög provgenomströmning inom biomarkördiagnostik.
Exempel på instruktioner för mtDNA-fragmentering med ultraljud
Förberedelse och extraktion:
- C57BL/6-möss avlivades genom cervikal dislokation.
- Levrarna togs snabbt ut och tvättades i iskall steril PBS.
Isolering av mitokondrier:
- Mitokondrier isolerades med en Dounce-vävnadshomogenisator på 2-mL och en sats för isolering av mitokondrier från vävnad.
- Inledande centrifugering vid 700× g och 3 000× g.
- Utför ytterligare två tvättsteg med buffert C.
DNA-isolering:
- Pelleten från den första centrifugeringen vid 700× g användes för att isolera kärn-DNA (nDNA).
- DNA isolerades med spinnkolonner.
- Mitokondriellt DNA (mtDNA) extraherades från isolerade mitokondrier.
- Kärn-DNA (nDNA) extraherades från råa kärnextrakt, båda från muslevervävnad.
DNA-fragmentering:
- DNA fragmenterades på is med ultraljudsbehandlaren UP50H på 30-kHz/50-W med en mikrospetssonotrod på 0,5-mm vid 14 μm under 2 × 30 sekunder.
Visualisering och kvantifiering av fragmentering:
- Fragmenteringen efter ultraljudsbehandling visualiserades på en 1% agarosgel med DNA-färgämnet SYBR safe.
- Den relativa förekomsten av mtDNA och nDNA bestämdes med qPCR.
(jfr Mariero et al., 2019)
För provberedning med hög provgenomströmning underlättar ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor beredningen av stora antal prover i standardplattor med 96 brunnar, flerbrunnsplattor och mikrotiterplattor.
Läs mer om fördelarna med provberedning med hög provgenomströmning med UIP400MTP!
Tips för optimal isolering av mitokondrier med ultraljudsbehandling:
- Temperaturkontroll: Utför alla steg inom temperaturintervallet 0°C till 4°C. Detta är avgörande för att bibehålla mitokondriernas integritet och funktion.
- Effektivitet och snabbhet: Arbeta snabbt och rena mitokondrierna endast i den utsträckning som krävs för din specifika tillämpning. Alltför omfattande hantering kan leda till betydande förluster av mitokondriellt innehåll.
- Spädning av suspensioner: Håll koncentrationerna av cell- och organellsuspensioner låga under hela isoleringsprocessen. Detta bidrar till att minimera riskerna för infångning och agglutination och förbättrar därmed renheten hos de isolerade mitokondrierna.
- Provvolym: Välj flera småskaliga beredningar i stället för en enda stor. Detta tillvägagångssätt ger vanligtvis bättre utbyte, eftersom uppskalning inte ökar mängden mitokondrier som kan utvinnas proportionellt. Ultraljudsapparaten UIP400MTP för flerbrunnsplattor underlättar snabb och tillförlitlig lysering av celler för isolering av mitokondrier samt extraktion av proteiner från mitokondrier.
Dessa riktlinjer gör isoleringsprocessen med ultraljudslysering och centrifugering effektivare och ger mitokondriepreparationer av hög kvalitet som lämpar sig för efterföljande tillämpningar.
Hielscher ultraljudsapparater – kvalitet tillverkad i Tyskland
Hielschers ultraljudsapparater är välkända för sina allra högsta kvalitets- och konstruktionsstandarder. Robusthet och enkel användning möjliggör smidig integrering av våra ultraljudsapparater i industrianläggningar. Hielschers ultraljudsapparater klarar enkelt tuffa förhållanden och krävande miljöer.
Hielscher Ultrasonics är ett ISO-certifierat företag och lägger särskild vikt vid högpresterande ultraljudsapparater med den senaste tekniken och hög användarvänlighet. Hielschers ultraljudsapparater är naturligtvis CE-kompatibla och uppfyller kraven enligt UL, CSA och RoHs.
Ultraljudsapparaten UIP400MTP för plattor med 96 brunnar för ultraljudsbehandling av mikrotiterplattor och flerbrunnsplattor
Litteratur / referenser
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Vanliga frågor om mitokondrier och mitokondriell diagnostik
Vad är mitokondrier?
Mitokondrier är membranomslutna organeller som finns i cellerna hos de flesta eukaryota organismer. De är kända som cellens kraftverk eftersom de producerar energi i form av adenosintrifosfat (ATP) genom cellandningen. Dessutom har mitokondrier eget DNA och spelar centrala roller i andra cellulära processer, bland annat regleringen av cellcykeln och celldöd.
Vad skiljer mtDNA från genomiskt DNA?
Mitokondriellt DNA (mtDNA) skiljer sig från genomiskt DNA (gDNA) på flera centrala sätt. MtDNA finns i mitokondrierna, är cirkulärt och ärvs från modern, medan gDNA finns i cellkärnan, är linjärt och ärvs från båda föräldrarna. MtDNA är mycket mindre och kodar för endast 37 gener, medan gDNA innehåller cirka 20 000–25 000 gener. MtDNA finns i flera kopior per cell, har en högre mutationsfrekvens och kodar främst för proteiner som är involverade i mitokondriernas funktion. Däremot är gDNA vanligtvis diploidt, har en lägre mutationsfrekvens och kodar för en stor mängd gener som är nödvändiga för organismens utveckling och funktion. Dessutom sker transkription och translation av mtDNA inne i mitokondrierna, medan transkription av gDNA sker i cellkärnan och translation sker i cytoplasman. Dessa skillnader återspeglar deras skilda roller och evolutionära ursprung.
Vad är ett cellfritt extrakt?
Ett cellfritt extrakt är en lösning som innehåller innehållet i lyserade celler, inklusive proteiner, nukleinsyror och andra cellkomponenter, men saknar intakta cellmembran. Detta extrakt används inom biokemisk och molekylärbiologisk forskning för att studera cellulära processer in vitro, vilket gör det möjligt för forskare att analysera reaktioner och mekanismer utanför levande celler.
Vilken roll spelar PCR-tester inom mitokondriell diagnostik?
PCR-tester spelar en avgörande roll inom mitokondriell diagnostik genom att möjliggöra detektion av mutationer, deletioner eller kopietalsvariationer i mitokondriellt DNA (mtDNA). De möjliggör amplifiering av specifika mtDNA-regioner för att identifiera patogena varianter som är förknippade med mitokondriella sjukdomar. PCR-baserade tekniker, såsom kvantitativ PCR (qPCR) och långdistans-PCR, används också för att bedöma mtDNA-integritet, heteroplasminivåer och mtDNA-depletion, vilket ger väsentliga insikter i mitokondriell funktion och sjukdom.
Läs om hur mikroplattsonikatorn UIP400MTP underlättar PCR-tester och analyser!
Vad är differentialcentrifugering?
Differentialcentrifugering är en teknik som används i stor utsträckning för cellfraktionering och isolering av mitokondrier. Denna metod separerar cellulära strukturer utifrån deras sedimentationskoefficient, som beror på både densitet och form. Processen innebär att prover i buffrade saltlösningar med specifika densiteter utsätts för olika nivåer av centrifugalkraft. Strukturer med liknande sedimentationskoefficienter sedimenterar på botten av uppsamlingsröret samtidigt, vilket gör det möjligt att tillvarata dem.
Hur används differentialcentrifugering för att isolera mitokondrier?
Differentialcentrifugering gör det möjligt för forskare att effektivt separera mitokondriella fraktioner från andra cellkomponenter. Isolering av mitokondrier omfattar flera centrifugeringssteg och efterföljande tillvaratagande av isolatet.
Inledande centrifugering: Applicera en låg centrifugalkraft för att sedimentera stora cellrester och cellkärnor.
Efterföljande centrifugeringar: Öka centrifugalkraften stegvis för att pelletera fraktioner anrikade på mitokondrier. Varje centrifugeringssteg avlägsnar strukturer med successivt högre sedimentationskoefficienter.
Tillvaratagande av fraktioner: Efter varje centrifugering samlas pelleten upp och supernatanten utsätts för högre g-krafter för att isolera nästa fraktion. Detta upprepas tills önskad renhet hos mitokondrierna uppnås.