Priprava vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave za mitohondrijsko diagnostiko
Mitohondrijska diagnostika v raziskavah in klinični praksi se izvaja z različnimi tehnikami, kot so sekvenciranje, PCR in biokemijske analize. Te metode se uporabljajo za prepoznavanje mutacij DNA in merjenje delovanja mitohondrijev. Sekvenciranje pomaga odkrivati genetske mutacije, PCR pa omogoča kvantifikacijo specifičnih zaporedij DNA. Biokemijske analize ocenjujejo delovanje mitohondrijskih beljakovin in encimov.
Diagnostika mitohondrijskih bolezni je še posebej zahtevna zaradi izrazite klinične variabilnosti teh bolezni ter zaradi zapletenega medsebojnega delovanja dveh genomov, ki se dedujeta različno: mitohondrijske DNA (mtDNA) in jedrnega genoma.
Ekstrakcija in fragmentacija DNA s sonikacijo
Ekstrakcija DNA iz mišičnega tkiva je posebej uporabna ob sumu na tkivno specifične spremembe mtDNA. Te spremembe lahko vključujejo delecije mtDNA pri kronični progresivni zunanji oftalmoplegiji (CPEO), točkovne mutacije mtDNA pri mitohondrijskih miopatijah ali zmanjšanje količine mtDNA pri Alpersovem sindromu. DNA, ekstrahirano iz mišičnega tkiva, lahko nato uporabimo za različne genetske preiskave, kot so prenos po Southernu in PCR dolgih odsekov za delecije, PCR v realnem času za zmanjšanje količine mtDNA ali sekvenciranje za točkovne mutacije.
Sonikacija z intenzivnimi ultrazvočnimi valovi se uporablja za različne namene v mitohondrijski diagnostiki. Uporablja se za lizo celic za ekstrakcijo znotrajcelične vsebine, kot so mitohondriji in DNA, za strižno fragmentacijo DNA, kot sta mtDNA in nDNA, za sekvenciranje ter za homogenizacijo vzorcev.
Sonikator za plošče UIP400MTP za pripravo vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave enakomerno sonicira vzorce v ploščah z več vdolbinicami in ploščah s 96 vdolbinicami
Kako izolirati mitohondrije iz celic in tkiv
Izolacija mitohondrijev obsega dva bistvena koraka: razgradnjo celic za sprostitev njihove vsebine in uporabo diferencialnega centrifugiranja za ločevanje in pridobivanje mitohondrijskih frakcij.
Sonikacija
Sonikatorji Hielscher so združljivi s standardnimi pufri in kompleti za lizo, zato so primerni za izolacijo mitohondrijev. Sonikacija ima dva glavna namena:
- Liza celic: Ultrazvočni valovi razgradijo celične membrane in sprostijo znotrajcelično vsebino.
- Razgradnja mitohondrijev: Sonikacija v naslednjem koraku lahko razgradi mitohondrije ter sprosti mitohondrijske beljakovine ali mitohondrijsko DNA.
- Fragmentacija mtDNA: Sonikacija je zanesljiva tehnika za strižno fragmentacijo mitohondrijske DNA za sekvenciranje.
Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP omogoča pripravo mitohondrijskih vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave. V povezavi z diferencialnim centrifugiranjem sonikacija poveča učinkovitost izolacije mitohondrijev in zagotavlja visok izkoristek nepoškodovanih mitohondrijev, primernih za različne nadaljnje uporabe.
Sonikator za plošče z več vdolbinicami Hielscher UIP400MTP deluje s katero koli standardno ploščo
Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP ponuja številne prednosti pri pripravi vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave, npr. v mitohondrijski diagnostiki.
Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP za pripravo vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave pri diagnostiki z biološkimi označevalci.
Primer navodil za ultrazvočno fragmentacijo mtDNA
Priprava in ekstrakcija:
- Miši C57BL/6 so usmrtili s cervikalno dislokacijo.
- Jetra so hitro odvzeli in oprali v ledeno hladnem sterilnem PBS.
Izolacija mitohondrijev:
- Mitohondrije so izolirali z 2-mL homogenizatorjem tkiva Dounce in kompletom Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Začetno centrifugiranje pri 700× g in 3.000× g.
- Izvedite dva dodatna koraka izpiranja s pufrom C.
Izolacija DNA:
- Usedlino iz prvega centrifugiranja pri 700× g so uporabili za izolacijo jedrne DNA (nDNA).
- DNA so izolirali s centrifugirnimi kolonami.
- Mitohondrijsko DNA (mtDNA) so ekstrahirali iz izoliranih mitohondrijev.
- Jedrno DNA (nDNA) so ekstrahirali iz surovih jedrnih ekstraktov; obe vrsti DNA sta izvirali iz jetrnega tkiva miši.
Fragmentacija DNA:
- DNA so fragmentirali na ledu z ultrazvočnim sonikatorjem UP50H s frekvenco 30 kHz in močjo 50 W ter sonotrodo z 0,5-mm mikrokonico pri 14 μm v trajanju 2 × 30 sekund.
Vizualizacija in kvantifikacija fragmentacije:
- Fragmentacijo po sonikaciji so vizualizirali na 1% agaroznem gelu z barvilom za DNA SYBR safe.
- Relativno zastopanost mtDNA in nDNA so določili s qPCR.
(prim. Mariero et al., 2019)
Za pripravo vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP olajša pripravo velikega števila vzorcev v standardnih ploščah s 96 vdolbinicami, ploščah z več vdolbinicami in mikrotitrskih ploščah.
Preberite več o prednostih priprave vzorcev z visoko zmogljivostjo obdelave z uporabo UIP400MTP!
Nasveti za optimalno izolacijo mitohondrijev s sonikacijo:
- Nadzor temperature: Vse korake izvajajte v temperaturnem območju od 0°C do 4°C. To je ključno za ohranjanje celovitosti in delovanja mitohondrijev.
- Učinkovitost in hitrost: Delajte hitro in mitohondrije očistite le toliko, kolikor zahteva vaša specifična uporaba. Prekomerna obdelava lahko povzroči znatne izgube mitohondrijske vsebine.
- Redčenje suspenzij: Med celotnim postopkom izolacije vzdržujte nizke koncentracije suspenzij celic in organelov. To pomaga zmanjšati tveganje za ujetje in aglutinacijo ter tako izboljša čistost izoliranih mitohondrijev.
- Prostornina vzorca: Odločite se za več priprav v majhnem obsegu namesto ene v velikem obsegu. Ta pristop običajno omogoča boljše izkoristke, saj povečanje obsega ne poveča sorazmerno količine mitohondrijev, ki jih je mogoče pridobiti. Sonikator za plošče z več vdolbinicami UIP400MTP olajša hitro in zanesljivo lizo celic za izolacijo mitohondrijev ter ekstrakcijo beljakovin iz mitohondrijev.
Te smernice bodo povečale učinkovitost postopka izolacije z ultrazvočno lizo in centrifugiranjem ter omogočile pridobivanje visokokakovostnih mitohondrijskih pripravkov, primernih za nadaljnje uporabe.
Sonikatorji Hielscher – kakovost, izdelana v Nemčiji
Ultrazvočne naprave Hielscher so znane po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključitev naših ultrazvočnih naprav v industrijske obrate. Ultrazvočne naprave Hielscher zlahka obvladujejo težke razmere in zahtevna okolja.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO, ki daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim napravam z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so ultrazvočne naprave Hielscher skladne z zahtevami CE ter izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Sonikator za plošče s 96 vdolbinicami UIP400MTP za sonikacijo mikrotitrskih plošč in plošč z več vdolbinicami
Literatura / Viri
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Pogosta vprašanja o mitohondrijih in mitohondrijski diagnostiki
Kaj so mitohondriji?
Mitohondriji so z membrano obdani organeli, ki jih najdemo v celicah večine evkariontskih organizmov. Znani so kot celične elektrarne, saj v procesu celičnega dihanja proizvajajo energijo v obliki adenozin trifosfata (ATP). Poleg tega imajo mitohondriji lastno DNA in imajo ključne vloge v drugih celičnih procesih, vključno z uravnavanjem celičnega cikla in celične smrti.
V čem se mtDNA razlikuje od genomske DNA?
Mitohondrijska DNA (mtDNA) se od genomske DNA (gDNA) razlikuje v več ključnih pogledih. MtDNA se nahaja v mitohondrijih, je krožna in se deduje po materi, medtem ko se gDNA nahaja v celičnem jedru, je linearna in se deduje od obeh staršev. MtDNA je veliko manjša in kodira le 37 genov, medtem ko gDNA vsebuje približno 20.000–25.000 genov. MtDNA je v celici prisotna v več kopijah, ima višjo stopnjo mutacij in kodira predvsem beljakovine, vključene v delovanje mitohondrijev. Nasprotno je gDNA običajno diploidna, ima nižjo stopnjo mutacij in kodira obsežen nabor genov, potrebnih za razvoj in delovanje organizma. Poleg tega transkripcija in translacija mtDNA potekata v mitohondrijih, medtem ko transkripcija gDNA poteka v jedru, translacija pa v citoplazmi. Te razlike odražajo njuni različni vlogi in evolucijski izvor.
Kaj je brezcelični ekstrakt?
Brezcelični ekstrakt je raztopina, ki vsebuje vsebino liziranih celic, vključno z beljakovinami, nukleinskimi kislinami in drugimi celičnimi sestavinami, vendar brez nepoškodovanih celičnih membran. Ta ekstrakt se uporablja v biokemijskih in molekularnobioloških raziskavah za preučevanje celičnih procesov in vitro, kar raziskovalcem omogoča analizo reakcij in mehanizmov zunaj živih celic.
Kakšno vlogo imajo testi PCR v mitohondrijski diagnostiki?
Testi PCR imajo ključno vlogo v mitohondrijski diagnostiki, saj omogočajo odkrivanje mutacij, delecij ali variacij v številu kopij mitohondrijske DNA (mtDNA). Omogočajo pomnoževanje specifičnih odsekov mtDNA za prepoznavanje patogenih različic, povezanih z mitohondrijskimi boleznimi. Tehnike, ki temeljijo na PCR, kot sta kvantitativni PCR (qPCR) in PCR dolgih odsekov, se uporabljajo tudi za ocenjevanje celovitosti mtDNA, ravni heteroplazmije in zmanjšanja količine mtDNA ter zagotavljajo bistven vpogled v delovanje mitohondrijev in bolezni.
Spoznajte, kako sonikator za mikroplošče UIP400MTP olajša teste in analize PCR!
Kaj je diferencialno centrifugiranje?
Diferencialno centrifugiranje je pogosto uporabljena tehnika za frakcioniranje celic in izolacijo mitohondrijev. Ta metoda ločuje celične strukture na podlagi njihovega sedimentacijskega koeficienta, ki je odvisen tako od gostote kot od oblike. Postopek vključuje delovanje različnih centrifugalnih sil na vzorce v pufranih raztopinah soli s specifičnimi gostotami. Strukture s podobnimi sedimentacijskimi koeficienti se hkrati usedejo na dno zbiralne epruvete, kar omogoča njihovo pridobivanje.
Kako se diferencialno centrifugiranje uporablja za izolacijo mitohondrijev?
Diferencialno centrifugiranje raziskovalcem omogoča učinkovito ločevanje mitohondrijskih frakcij od drugih celičnih sestavin. Izolacija mitohondrijev vključuje več korakov centrifugiranja in nato pridobitev izolata.
Začetno centrifugiranje: Uporabite nizko centrifugalno silo za usedanje velikih celičnih ostankov in jeder.
Nadaljnja centrifugiranja: Postopoma povečujte centrifugalno silo za pridobivanje usedlin frakcij, obogatenih z mitohondriji. Vsak korak centrifugiranja odstrani strukture s postopoma višjimi sedimentacijskimi koeficienti.
Pridobivanje frakcij: Po vsakem centrifugiranju zberemo usedlino, supernatant pa izpostavimo višjim silam g za izolacijo naslednje frakcije. To ponavljamo, dokler ne dosežemo želene čistosti mitohondrijev.