Visoko zmogljiva priprava vzorcev za mitohondrijsko diagnostiko
Mitohondrijska diagnostika v raziskavah in klinikah se izvaja z različnimi tehnikami, kot so sekvenciranje, PCR in biokemični testi. Te metode se uporabljajo za identifikacijo mutacij DNA in merjenje funkcije mitohondrijev. Zaporedje pomaga odkriti genetske mutacije, medtem ko lahko PCR kvantificira specifična zaporedja DNK. Biokemični testi ocenjujejo funkcionalnost mitohondrijskih beljakovin in encimov.
Diagnostika mitohondrijskih bolezni je še posebej težavna zaradi izrazite klinične variabilnosti teh bolezni, pa tudi zaradi kompleksne interakcije med dvema različno podedovanima genomoma: mitohondrijsko DNA (mtDNA) in jedrskim genomom.
Ekstrakcija in fragmentacija DNK z uporabo ultrazvočne obdelave
Ekstrakcija DNK iz mišičnega tkiva je še posebej uporabna, kadar sumite na tkivno specifične spremembe v mtDNA. Te spremembe lahko vključujejo izbris mtDNA pri kronični progresivni zunanji oftalmoplegiji (CPEO), točkovne mutacije mtDNA v mitohondrijskih miopatijah ali izčrpanost mtDNA pri Alpersovem sindromu. DNK, pridobljena iz mišičnega tkiva, se lahko nato uporabi za različne genetske teste, kot so Southern blot in PCR na dolge razdalje za brisanje, PCR v realnem času za izčrpanost ali zaporedje za točkovne mutacije.
Sonication, z uporabo intenzivnih ultrazvočnih valov, se uporablja za več aplikacij v mitohondrijski diagnostiki. Uporablja se za lizo celic za ekstrakcijo znotrajcelične vsebine, kot so mitohondriji in DNA, za striženje DNK, kot sta mtDNA in nDNA za zaporedje, in za homogenizacijo vzorcev.
UIP400MTP Plate Sonicator za visoko zmogljivo pripravo vzorcev enakomerno ultrazvočno razbija vzorce v ploščah z več in 96 vdolbicami
Kako izolirati mitohondrije iz celic in tkiv
Mitohondrijska izolacija je sestavljena iz dveh bistvenih korakov: motenj celic, da sprostijo svojo vsebino, in uporaba diferencialnega centrifugiranja za ločevanje in obnovitev mitohondrijskih frakcij.
ultrazvočno razbijanje
Hielscher sonicatorji so združljivi s standardnimi liznimi pufri in kompleti, zaradi česar so primerni za izolacijo mitohondrijev. Sonication služi dvema glavnima namenoma:
- Liza celic: Ultrazvočni valovi motijo celične membrane in sproščajo znotrajcelične vsebine.
- Mitohondrijska motnja: Sonication v naslednjem koraku lahko odpre mitohondrije in sprosti mitohondrijske beljakovine ali mitohondrijsko DNK.
- Fragmentacija mtDNA: Sonication je zanesljiva tehnika za striženje mitohondrijske DNK za zaporedje.
Sonikator z več vdolbicami UIP400MTP omogoča visoko zmogljivo pripravo vzorcev mitohondrijskih vzorcev. V povezavi z diferencialnim centrifugiranjem ultrazvočna razbijanja poveča učinkovitost mitohondrijske izolacije in zagotavlja visoke donose nepoškodovanih mitohondrijev, primernih za različne nadaljnje aplikacije.
Hielscher UIP400MTP sonikator plošč z več jamami deluje s katero koli standardno ploščo
Zvočni zvočni UIP400MTP z več jamicami ponuja številne prednosti za visoko zmogljivo pripravo vzorcev, npr. pri mitohondrijski diagnostiki.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator za visoko zmogljivo pripravo vzorcev v diagnostiki biomarkerjev.
Zgledna navodila za ultrazvočno fragmentacijo mtDNA
Priprava in ekstrakcija:
- Miši C57BL / 6 so bile ubite zaradi dislokacije materničnega vratu.
- Jetra so bila hitro izvlečena in oprana v ledeno hladnem sterilnem PBS.
Izolacija mitohondrijev:
- Mitohondrije so izolirali z 2-ml mlinčkom za tkivo Dounce in kompletom za izolacijo mitohondrijev za tkivo.
- Začetno centrifugiranje pri 700× g in 3.000× g.
- Izvedite dva dodatna koraka pranja z puferom C.
Izolacija DNK:
- Pelet iz prvega centrifugiranja pri 700× g je bil uporabljen za izolacijo jedrske DNA (nDNA).
- DNK je bila izolirana s pomočjo spinskih kolon.
- Mitohondrijska DNA (mtDNA) je bila ekstrahirana iz izoliranih mitohondrijev.
- Jedrska DNA (nDNA) je bila ekstrahirana iz surovih jedrskih izvlečkov, oboje iz tkiva mišjih jeter.
Fragmentacija DNK:
- DNK je bila fragmentirana na ledu z uporabo 30-kHz / 50-W ultrazvočnega sonikatorja UP50H z 0,5-milimetrskim mikro-konico sonotrode pri 14 μm za 2 × 30 sekund.
Vizualizacija in kvantifikacija fragmentacije:
- Fragmentacija po ultrasonifikaciji je bila vizualizirana na 1% agaroznem gelu z varnim barvilom DNK SYBR.
- Relativno številčnost mtDNA in nDNA je bila določena s qPCR.
(prim. Mariero et al., 2019)
Za visoko zmogljivo pripravo vzorcev sonikator z več vdolbicami UIP400MTP olajša pripravo velikega števila vzorcev v standardnih ploščah z 96, več vdolbicami in mikrotitro.
Preberite več o prednostih visoko zmogljive priprave vzorcev z uporabo UIP400MTP!
Nasveti za optimalno izolacijo mitohondrijev z uporabo ultrazvočnega razbijanja:
- Nadzor temperature: Vse korake izvedite pri temperaturnem območju od 0 °C do 4 °C. To je ključnega pomena za ohranjanje celovitosti in funkcionalnosti mitohondrijev.
- Učinkovitost in hitrost: Delajte hitro in očistite mitohondrije le v obsegu, ki je potreben za vašo specifično uporabo. Prekomerna manipulacija lahko povzroči znatne izgube mitohondrijske vsebine.
- Redčenje suspenzij: Ohranite nizke koncentracije suspenzij celic in organelov v celotnem procesu izolacije. To pomaga zmanjšati tveganje ujetja in aglutinacije, s čimer se izboljša čistost izoliranih mitohondrijev.
- Vzorčni volumen: Odločite se za več pripravkov v majhnem obsegu namesto enega velikega. Ta pristop običajno povzroči boljše donose, saj povečanje sorazmerno ne poveča količine obnovljivih mitohondrijev. Sonikator z več vdolbicami UIP400MTP omogoča hitro in zanesljivo lizo celic za izolacijo mitohondrijev in ekstrakcijo beljakovin iz mitohondrijev.
Te smernice bodo naredile postopek izolacije z uporabo ultrazvočne lize in centrifugiranja učinkovitejši, kar bo prineslo visokokakovostne mitohondrijske pripravke, primerne za nadaljnjo uporabo.
Hielscher Sonicators – Kakovost izdelana v Nemčiji
Hielscher ultrazvočni aparati so znani po svojih najvišjih standardih kakovosti in oblikovanja. Robustnost in enostavno upravljanje omogočata nemoteno integracijo naših ultrazvočnih aparatov v industrijske objekte. Težke pogoje in zahtevna okolja zlahka obvladajo Hielscher ultrasonicatorji.
Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visoko zmogljivim ultrazvočnim aparatom z najsodobnejšo tehnologijo in prijaznostjo do uporabnika. Seveda so Hielscher ultrazvočni aparati skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.
Ultrazvočni UIP400MTP z 96-jamično ploščo za ultrazvočno razbijanje mikrotitrskih in večjamičkih plošč
Literatura / Reference
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Pogosto zastavljena vprašanja o mitohondrijih in mitohondrijskih diagnostičnih
Kaj so mitohondriji?
Mitohondriji so membransko vezani organeli, ki jih najdemo v celicah večine evkariontskih organizmov. Znani so kot elektrarne celice, ker proizvajajo energijo v obliki adenozin trifosfata (ATP) s procesom celičnega dihanja. Poleg tega imajo mitohondriji svojo DNK in igrajo ključno vlogo v drugih celičnih procesih, vključno z regulacijo celičnega cikla in celično smrtjo.
Kaj razlikuje mtDNA od genomske DNK?
Mitohondrijska DNA (mtDNA) se razlikuje od genomske DNA (gDNA) na več ključnih načinov. MtDNA se nahaja v mitohondrijih, je krožna in je podedovana po materi, medtem ko se gDNA nahaja v celičnem jedru, je linearna in je podedovana od obeh staršev. MtDNA je veliko manjša, kodira le 37 genov, medtem ko gDNA vsebuje približno 20.000-25.000 genov. MtDNA je prisotna v več kopijah na celico, ima višjo stopnjo mutacij in predvsem kodira beljakovine, ki sodelujejo pri delovanju mitohondrijev. V nasprotju s tem je gDNA običajno diploidna, ima nižjo stopnjo mutacij in kodira široko paleto genov, potrebnih za razvoj in delovanje organizma. Poleg tega se transkripcija in translacija mtDNA pojavita v mitohondrijih, medtem ko se transkripcija gDNA pojavi v jedru, translacija pa v citoplazmi. Te razlike odražajo njihove različne vloge in evolucijski izvor.
Kaj je izvleček brez celic?
Ekstrakt brez celic je raztopina, ki vsebuje vsebino liziranih celic, vključno z beljakovinami, nukleinskimi kislinami in drugimi celičnimi sestavinami, vendar brez nepoškodovanih celičnih membran. Ta izvleček se uporablja v raziskavah biokemične in molekularne biologije za preučevanje celičnih procesov in vitro, kar raziskovalcem omogoča analizo reakcij in mehanizmov zunaj živih celic.
Kakšno vlogo igrajo PCR testi v mitohondrijski diagnostiki?
PCR testi igrajo ključno vlogo pri mitohondrijski diagnostiki, saj omogočajo odkrivanje mutacij, delecij ali sprememb števila kopij v mitohondrijski DNA (mtDNA). Omogočajo okrepitev specifičnih regij mtDNA za prepoznavanje patogenih variant, povezanih z mitohondrijskimi motnjami. Tehnike, ki temeljijo na PCR, kot sta kvantitativna PCR (qPCR) in PCR na dolge razdalje, se uporabljajo tudi za oceno celovitosti mtDNA, ravni heteroplazme in izčrpanosti mtDNA, kar zagotavlja bistven vpogled v funkcijo in bolezen mitohondrijev.
Naučite se, kako UIP400MTP Microplate Sonicator olajša PCR teste in teste!
Kaj je diferencialno centrifugiranje?
Diferencialno centrifugiranje je široko uporabljena tehnika za celično frakcioniranje in izolacijo mitohondrijev. Ta metoda ločuje celične strukture na podlagi njihovega sedimentacijskega koeficienta, ki je odvisen od gostote in oblike. Postopek vključuje uporabo različnih stopenj centrifugalne sile na vzorce v pufriranih raztopinah soli s specifično gostoto. Strukture s podobnimi sedimentacijskimi koeficienti se bodo istočasno usedle na dno zbiralne cevi, kar bo omogočilo njihovo obnovo.
Kako se diferencialno centrifugiranje uporablja za izolacijo mitohondrijev?
Diferencialno centrifugiranje omogoča raziskovalcem, da učinkovito ločijo mitohondrijske frakcije od drugih celičnih komponent. Izolacija mitohondrijev vključuje več korakov centrifugiranja in naknadno obnovitev izolata.
Začetno centrifugiranje: Uporabite nizko centrifugalno silo za usedline velikih celičnih odpadkov in jeder.
Nadaljnje centrifugiranje: Postopoma povečajte centrifugalno silo na frakcije peletov, obogatene z mitohondriji. Vsak korak centrifugiranja odstrani strukture s postopoma višjimi koeficienti sedimentacije.
Izterjava frakcij: Po vsakem centrifugiranju se pelet zbere, supernatant pa se izpostavi višjim g-silam, da se izolira naslednja frakcija. To se ponavlja, dokler se ne doseže želena čistost mitohondrijev.