Ultrazvočna polimerizacija hidrogelov: protokol in povečanje merila

Polimerizacija, inducirana z ultrazvokom, omogoča pristop brez radikalov in iniciatorjev za sintezo hidrogelov iz vodotopnih vinilnih monomerov in makromonomerov. Ta metodologija izkorišča sonokemijsko nastajanje radikalov s kavitacijo in je idealno primerna za biomedicinske aplikacije, pri katerih se je treba izogniti ostankom iniciatorjev.

Hidrogeli so tridimenzionalne hidrofilne polimerne mreže, ki lahko zadržijo znatne količine vode in pri tem ohranijo strukturno celovitost – lastnost, ki izhaja iz zamreženih polimernih verig. Zaradi svojih fizikalno-kemijskih lastnosti – obnašanja pri nabrekanju, mehanske trdnosti in biokompatibilnosti – so zelo privlačni za biomedicinske aplikacije, vključno z dostavo zdravil, tkivnim inženirstvom in celjenjem ran.

Prednost ultrazvočne polimerizacije hidrogelov

Sinteza hidrogelov tradicionalno temelji na toplotnem, fotokemijskem ali kemijskem zamreženju; vendar ultrazvočna sinteza hidrogelov pridobiva vse večjo veljavo, saj metoda sonikacije ponuja preprost, prilagodljiv in okolju prijaznejši pristop brez reagentov. Ultrazvočna sinteza hidrogelov uporablja akustično kavitacijo za spodbujanje polimerizacije ter fizikalnega ali kemijskega zamreženja brez potrebe po zunanjih iniciatorjih. Ultrazvočna obdelava lahko tudi olajša dispergiranje nanodelcev in situ ali sproži radikalske reakcije v vodnih medijih, zato je vsestransko orodje za izdelavo večfunkcijskih ali nanokompozitnih hidrogelov v blagih pogojih.

Zgornji videoposnetek prikazuje ultrazvočno sintezo hidrogela s sonikatorjem UP50H in gelatorjem z nizko molekulsko maso. Rezultat je samozaceljiv supramolekularni hidrogel. (Študija in videoposnetek: Rutgeerts et al., 2019)
 

Biokompatibilni hidrogeli s sonikacijo

Pri iskanju biokompatibilnih hidrogelov, ki jih je mogoče tvoriti čisto, varno in po potrebi, tradicionalni pristopi k polimerizaciji pogosto ne zadostujejo. Delo Cassa in sodelavcev predstavlja učinkovito rešitev tega problema: čisto metodo za sintezo hidrogelov brez iniciatorjev z uporabo nizkofrekvenčnega ultrazvoka.

Njihova študija obravnava sonokemijsko polimerizacijo različnih vodotopnih monomerov, vendar je ena formulacija izstopala kot posebej učinkovita in robustna: 5% raztopina dekstran metakrilata (Dex-MA) v mešanici glicerola in vode s 70% glicerola, polimerizirana z ultrazvokom pri zmerni intenziteti 56 W/cm². Izjemno je, da je ta sistem v samo 6,5 minute ustvaril popolnoma oblikovan hidrogel in dosegel 72% pretvorbo monomera v polimer – najvišjo med vsemi preizkušenimi formulacijami.

Akustična kavitacija: Načelo delovanja te metode temelji na pojavu, ki je tako silovit kot kratkotrajen: akustični kavitaciji. Ob delovanju visokozmogljivega ultrazvoka v tekočem mediju nastajajo mikroskopski mehurčki, ki silovito implodirajo in ustvarjajo lokalizirana vroča območja, kjer lahko temperature za kratek čas presežejo 5000 kelvinov. Ti pogoji povzročijo homolitsko cepitev molekul topila, pri čemer nenadoma nastane množica reaktivnih radikalov. V nasprotju s konvencionalno polimerizacijo, ki je odvisna od zunanjih iniciatorjev ali toplote, ultrazvok zagotavlja tako energijo kot radikale, potrebne za začetek polimerizacije – ne da bi temperatura celotnega medija presegla fiziološko relevantne vrednosti.

Kotopilo: Izbira glicerola kot kotopila ni bila naključna. Poleg tega, da povečuje viskoznost raztopine – kar je ključni dejavnik za povečanje intenzitete kavitacije – glicerol sam deluje kot sodonor radikalov. Znano je, da njegove hidroksilne skupine tvorijo razmeroma stabilne sekundarne radikale, s čimer podaljšujejo življenjsko dobo radikalov in spodbujajo rast verig. Poleg tega viskozno okolje, bogato z glicerolom, pomaga ujeti nastajajoče polimerne verige, zmanjšuje njihovo topnost in jih ščiti pred ultrazvočno razgradnjo, do katere lahko pride v bolj razredčenih vodnih sistemih.

Ultrazvočna polimerizacija: Za opredelitev poteka polimerizacije so raziskovalci uporabili infrardečo spektroskopijo in skozi čas spremljali zmanjševanje količine vinilnih skupin na Dex-MA. Značilna absorpcija pri 1635 cm⁻¹ – ki kaže na dvojne vezi C=C – se je med sonikacijo hitro zmanjševala, medtem ko je absorpcija razteznega nihanja estrske karbonilne skupine pri 1730 cm⁻¹ ostala nespremenjena in služila kot notranja referenca. Ti podatki so potrdili ne le hitro pretvorbo vinilnih skupin, temveč tudi visoko stopnjo zamreženja, kar so dokazovala nizka razmerja nabrekanja in robustne strukture gelov.

Analiza: Vrstična elektronska mikroskopija je dodatno razkrila razvoj mikrostrukture gela. V zgodnjih fazah je imela mreža velike, odprte pore, vendar so se te ob nadaljnji sonikaciji zapolnile z gostejšo sekundarno strukturo. Po 15 minutah je hidrogel izkazoval homogeno zamreženo morfologijo s tesno povezanimi porami – značilnost dobro oblikovanih biomedicinskih gelov.

Rezultat: V primerjavi s hidrogeli, proizvedenimi s toplotnimi prostimi radikalskimi iniciatorji, so bile razlike izrazite. Čeprav je bilo mogoče s toplotnim postopkom doseči podobne pretvorbe, so bile nastale mreže bolj porozne, manj enakomerne in so imele višja razmerja nabrekanja – znake ohlapnejše strukture zamreženja. Poleg tega je toplotni postopek zahteval prepihovanje z dušikom, kemijske dodatke in višje temperature, medtem ko je ultrazvočni pristop deloval pri temperaturi okolice zgolj 37°C.

Morda najzanimivejši vidik tega dela je ugotovitev, da se lahko polimerizacija nadaljuje tudi po prenehanju delovanja ultrazvoka. Gel se je v 30-minutnem obdobju po prenehanju sonikacije še naprej utrjeval in pridobival trdnost. To nakazuje, da lahko obstojne radikalske zvrsti ali vmesne strukture, nastale med sonikacijo, še naprej omogočajo rast polimernih verig brez nadaljnjega dovajanja energije – obnašanje s potencialno koristnimi posledicami za aplikacije in vivo.

Več o prednostih ultrazvočne proizvodnje hidrogelov!

Protokol: ultrazvočna sinteza hidrogela iz dekstran metakrilata (Dex-MA) s sonikatorjem

Za sintezo kovalentno zamreženega hidrogela Dex-MA se v raztopino glicerola in vode dovaja visokointenzivni nizkofrekvenčni ultrazvok. Temperatura in gostota ultrazvočne energije sta natančno nadzorovani.
Spodaj podajamo navodila za ultrazvočno sintezo hidrogelov v laboratorijskem merilu, ki jo je mogoče linearno prenesti na večje količine.

Oprema in materiali

Oprema

• Ultrazvočni procesor Hielscher UP200Ht (200 W, 26 kHz)
• Sonotroda S26d2 (premer konice: 2 mm; priporočena za majhne prostornine)
• Reakcijska posoda s plaščem (50 mL), združljiva z magnetnim mešalom
• Obtočna vodna kopel (termostatsko uravnavana pri 37°C)
• Temperaturna sonda PT100 (vključena v dobavo naprave UP200Ht)
• Magnetno mešalo
• Analitska tehtnica (±0,1 mg)
• Vakuumska sušilna peč ali liofilizator

Kemikalije

• Dekstran metakrilat (Dex-MA), ~20% metakrilacija
• Glicerol, ≥99,5% (brezvodni)
• Deionizirana voda

Vsi reagenti morajo biti analitske čistosti. Izogibajte se okoljem, bogatim s kisikom; če je mogoče, razplinite topila.

Postopek po korakih: ultrazvočna polimerizacija hidrogelov

1. Priprava polimerizacijske mešanice
   • V 50 mL reakcijsko posodo s plaščem odtehtajte 0,75 g Dex-MA.
   • Dodajte 10,5 g glicerola in 3,75 g deionizirane vode.
   • Mešanico mešajte z magnetnim mešalom pri sobni temperaturi (~22 °C) 5–10 minut, da se Dex-MA popolnoma raztopi. Nastati mora rahlo viskozna, homogena raztopina.
   • Vodno kopel predhodno segrejte na 37 °C in jo povežite s posodo s plaščem, da vzdržujete stalno temperaturo.
2. Nastavitev sonikatorja
   • Sonotrodo S26d2 namestite na UP200Ht in zagotovite tesen spoj.
   • Konico sonotrode potopite v reakcijsko mešanico. Pazite, da se ne dotika sten ali dna posode.
   • Temperaturno sondo namestite v raztopino blizu sonotrode, vendar brez neposrednega stika z njo. Tako lahko uporabljate vgrajeno uravnavanje temperature sonikatorja.
   • Amplitudo nastavite na 100%.
3. Ultrazvočna polimerizacija
   • Začnite mešati pri 100–200 rpm, da ohranjate nežno homogenizacijo.
   • Začnite sonikacijo pri ustrezni nastavitvi amplitude, da zagotovite ~56 W/cm² za 6,5 minute.
   • Ves čas vzdržujte temperaturo raztopine pri 37°C. Če se mešanica začne segrevati, povečajte pretok hladilne tekočine ali dodajte led v vodno kopel.
   • Geliranje se običajno začne v 5–6 minutah. Viskoznost se bo močno povečala.
   • Če pride do geliranja pred 6,5 min, ustavite sonikacijo, da preprečite prekomerno zamreženje ali razgradnjo.
4. Naknadna obdelava in čiščenje
   • Gel ob intenzivnem mešanju takoj prenesite v 200 mL deionizirane vode, da izlužite nezreagirani monomer in glicerol.
   • Mešajte 30 minut, nato odlijte supernatant ali filtrirajte.
   • Izpiranje ponovite še 3-krat s toplo vodo (~60 °C), da izboljšate difuzijo.
   • Gel sušite v vakuumu pri 60°C 8 ur ali ga liofilizirajte, da dobite porozne strukture.

 
Rezultat: biokompatibilni hidrogel
Dobiti morate prozoren, robusten hidrogel z visoko pretvorbo (~70–75%), odličnim zamreženjem in minimalno količino preostalega monomera. Hidrogel bo odporen proti raztapljanju v vodi in bo po sušenju izkazoval enakomerno strukturo.

 
Opombe za optimalno vodenje procesa

Povečanje merila: linearno in preprosto s sonikacijo

Na področju, ki vse bolj zahteva natančnost, čistost in možnost povečanja merila, ta ultrazvočna metoda ponuja privlačno alternativo. Omogoča prostorski nadzor, prilagajanje v realnem času in kontinuirano obdelavo s sodobnimi ultrazvočnimi pretočnimi sistemi.
Sonikatorji podjetja Hielscher Ultrasonics zagotavljajo natančne amplitude in omogočajo linearno povečanje merila od laboratorijskega do proizvodnega – zato so idealni za prenos takšnih hidrogelnih sistemov v dejanske terapevtske in diagnostične aplikacije.

Načrtovanje, proizvodnja in svetovanje – kakovost iz Nemčije

Ultrazvočni procesorji Hielscher so znani po najvišjih standardih kakovosti in zasnove. Robustnost in preprosto upravljanje omogočata nemoteno vključitev naših ultrazvočnih procesorjev v industrijske obrate. Ultrazvočni procesorji Hielscher zlahka obvladujejo težke pogoje in zahtevna okolja.

Hielscher Ultrasonics je podjetje s certifikatom ISO in daje poseben poudarek visokozmogljivim ultrazvočnim procesorjem z najsodobnejšo tehnologijo in uporabniku prijaznim upravljanjem. Seveda so ultrazvočni procesorji Hielscher skladni s CE in izpolnjujejo zahteve UL, CSA in RoHs.

Spodnja tabela prikazuje okvirno zmogljivost obdelave naših ultrazvočnih procesorjev: