Formarea fibrilelor amiloide folosind UIP400MTP Microplate Sonicator

Fibrilele amiloide, la fel ca cristalele, se formează printr-un proces de nucleare și creștere ulterioară. Cu toate acestea, datorită barierei ridicate de energie liberă a nucleației, formarea spontană a fibrilelor amiloide apare numai după o fază de întârziere prelungită. Ultrasonicarea a apărut ca un instrument puternic pentru inducerea nucleației amiloide, accelerând astfel semnificativ formarea fibrilelor. Atunci când este combinat cu un cititor de microplăci folosind fluorescența tioflavină T (ThT), ultrasunetele permit detectarea cu randament ridicat a fibrilelor amiloide în mai multe probe simultan.

Formarea fibrilelor amiloide induse cu ultrasunete cu UIP400MTP Microplate Sonicator

Cu UIP400MTP sonicator cu plăci cu mai multe godeuri, fibrilele amiloide de aceeași calitate în cantități mari pot fi sintetizate rapid în scopuri de cercetare. Această abordare eficientă permite studierea amiloidogenității proteinelor. Această tehnică facilitează fibrilația amiloidă rapidă și reproductibilă, așa cum s-a demonstrat cu β2-microglobulină (β2-m), o proteină amiloidogenă asociată cu amiloidoza legată de dializă.

Abordare experimentală simplă: fibrilație amiloidă indusă cu ultrasunete

Pentru a induce formarea fibrilelor, o microplacă cu 96 de godeuri a fost plasată în centrul UIP400MTP sonicator cu plăci cu mai multe godeuri, care asigură o expunere uniformă la ultrasunete în toate godeurile. Condițiile experimentale au fost următoarele:

1. Fiecare godeam conținea 0,2 ml de soluție de β2-microglobulină (0,3 mg/ml, pH 2,5) suplimentată cu 5 μM ThT.
2. Placa a fost supusă unor cicluri de ultrasunete, cum ar fi ultrasunete de 1 minut urmate de 9 minute de pauză.
3. După sonicare, fluorescența ThT a fost măsurată folosind un cititor de microplăci.

(cf. So et al., 2011)

Comparație cu agitația convențională

În comparație cu metodele tradiționale de agitare, ultrasunetele au redus drastic faza de întârziere a formării fibrilelor. În condiții convenționale de agitare a microplăcilor, doar 1 din 10 godeuri a prezentat o fluorescență ThT crescută după 20 de ore. În schimb, folosind ultrasunete ciclate (15 minute de sonicare urmată de 5 minute de repaus), a fost detectată o creștere semnificativă a fluorescenței ThT imediat după primul tratament de sonicare.

Accelerarea rapidă a cineticii fibrilației

Rezultatele obținute de la So et al. (2011) au demonstrat că formarea spontană a fibrilelor de β2-microglobulină la pH 2,5 poate fi accelerată de la câteva ore la doar 10-15 minute cu ultrasunete.
Imaginile de microscopie cu forță atomică (AFM) au confirmat că fibrilele generate prin ultrasunete de 10 minute la fiecare 15 minute nu se disting morfologic de cele formate folosind ultrasunete de 1 minut la fiecare 10 minute. Acest lucru evidențiază reproductibilitatea și robustețea fibrilației amiloide induse cu ultrasunete.

Imagini AFM ale fibrilelor amiloide produse prin ultrasunete de 1 min la fiecare 10 min (i), prin sonicare de 10 min la fiecare 15 min (ii) și prin reacția de însămânțare fără ultrasunete (iii). Bara albă reprezintă 1 μm.Studiu și imagini: ©So et al., 2011

Fibrilație în condiții de pH neutru

Chiar și în condiții de pH neutru, formarea fibrilelor a fost realizată după un timp de întârziere de 1,5 ore, demonstrând că ultrasunetele scad semnificativ bariera energetică împotriva nucleării și creșterii. Acest lucru susține și mai mult ipoteza că fibrilația amiloidă este în primul rând o reacție fizică, în mare parte constrânsă de bariera energetică de nucleare, pe care ultrasonicația o reduce eficient.

Impactul asupra cercetării bolilor legate de amiloid

Formarea ușoară și fiabilă a fibrilelor amiloide folosind sonicatorul UIP400MTP microplăci are implicații semnificative pentru cercetarea bolii Alzheimer (AD) și a altor tulburări legate de amiloid, cum ar fi boala Parkinson, diabetul de tip II și amiloidozele sistemice. În AD, agregarea amiloid-β (Aβ) este un semn patologic cheie, dar studierea cineticii sale de fibrilație rămâne o provocare din cauza fazelor lungi de întârziere și a variabilității metodelor convenționale. Formarea fibrilelor determinată de ultrasunete accelerează nuclearea, asigurând o reproductibilitate ridicată și o variabilitate redusă, ceea ce este crucial pentru screeningul potențialilor inhibitori și înțelegerea mecanismelor amiloidogene. În plus, capacitatea de mare randament a UIP400MTP permite investigații la scară largă asupra plierii greșite și agregării proteinelor, facilitând descoperirea agenților terapeutici care pot modula formarea fibrilelor și pot atenua progresia neurodegenerativă.

Acest studiu stabilește ultrasonicarea folosind UIP400MTP sonicator cu plăci cu mai multe godeuri ca o metodă extrem de eficientă pentru accelerarea formării fibrilelor amiloide. Principalele avantaje ale acestei abordări includ:

• Reducerea dramatică a timpului de întârziere pentru fibrilație.
• Expunere uniformă la ultrasunete în toate godeurile, permițând formarea de fibrile reproductibile.
• Capacitate de screening de mare randament, făcându-l potrivit pentru căutările la nivel de genom ale amiloidogenității proteinelor.

Prin integrarea ultrasunetelor cu detectarea fluorescenței ThT, această metodă oferă o platformă rapidă, scalabilă și fiabilă pentru studierea fibrilației amiloide. Având în vedere eficiența și potențialul său de mare randament, această abordare poate facilita sinteza ușoară a fibrilelor amiloide pentru cercetarea biofizică și farmaceutică, oferind un instrument promițător pentru studiile legate de amiloid și screeningul medicamentelor.