Formarea fibrilelor amiloide cu sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP

Fibrilele amiloide, asemenea cristalelor, se formează printr-un proces de nucleere urmat de creștere. Totuși, din cauza barierei ridicate de energie liberă a nucleerii, formarea spontană a fibrilelor amiloide are loc numai după o fază de latență prelungită. Sonicarea s-a impus ca un instrument puternic pentru inducerea nucleerii amiloide, accelerând astfel semnificativ formarea fibrilelor. Combinată cu un cititor de microplăci care utilizează fluorescența tioflavinei T (ThT), sonicarea permite detectarea cu capacitate mare de procesare a fibrilelor amiloide în mai multe probe simultan.

Formarea fibrilelor amiloide indusă prin ultrasunete cu sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP

Cu sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP, fibrile amiloide de aceeași calitate pot fi sintetizate rapid, în cantități mari, în scopuri de cercetare. Această abordare eficientă permite studierea amiloidogenității proteinelor. Această tehnică facilitează o fibrilare amiloidă rapidă și reproductibilă, așa cum s-a demonstrat cu β2-microglobulina (β2-m), o proteină amiloidogenă asociată cu amiloidoza legată de dializă.

Abordare experimentală simplă: fibrilarea amiloidă indusă prin ultrasunete

Pentru a induce formarea fibrilelor, o microplacă cu 96 de godeuri a fost plasată în centrul sonicatorului pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP, care asigură o expunere uniformă la ultrasunete în toate godeurile. Condițiile experimentale au fost următoarele:

1. Fiecare godeu a conținut 0,2 ml de soluție de β2-microglobulină (0,3 mg/ml, pH 2,5) suplimentată cu 5 μM ThT.
2. Placa a fost supusă unor cicluri de sonicare, de exemplu sonicare timp de 1 minut urmată de 9 minute de pauză.
3. După sonicare, fluorescența ThT a fost măsurată cu ajutorul unui cititor de microplăci.

(cf. So et al., 2011)

Comparație cu agitarea convențională

Comparativ cu metodele tradiționale de agitare, sonicarea a redus drastic faza de latență a formării fibrilelor. În condiții convenționale de agitare a microplăcii, doar 1 din 10 godeuri a prezentat o fluorescență ThT crescută după 20 de ore. În schimb, prin sonicare ciclică (15 minute de sonicare urmate de 5 minute de repaus), o creștere semnificativă a fluorescenței ThT a fost detectată imediat după primul tratament de sonicare.

Accelerarea rapidă a cineticii de fibrilare

Rezultatele obținute de So et al. (2011) au demonstrat că formarea spontană a fibrilelor de β2-microglobulină la pH 2,5 poate fi accelerată prin sonicare de la câteva ore la doar 10–15 minute.
Imaginile de microscopie de forță atomică (AFM) au confirmat că fibrilele generate prin sonicare de 10 minute la fiecare 15 minute erau morfologic imposibil de distins de cele formate prin sonicare de 1 minut la fiecare 10 minute. Acest lucru evidențiază reproductibilitatea și robustețea fibrilării amiloide induse prin ultrasunete.

Imagini AFM ale fibrilelor amiloide produse prin sonicare de 1 min la fiecare 10 min (i), prin sonicare de 10 min la fiecare 15 min (ii) și prin reacția de însămânțare fără sonicare (iii). Bara de scală albă reprezintă 1 μm.
Studiu și imagini: ©So et al., 2011

Fibrilarea în condiții de pH neutru

Chiar și în condiții de pH neutru, formarea fibrilelor a fost obținută după un timp de latență de 1,5 ore, demonstrând că sonicarea reduce semnificativ bariera energetică pentru nucleere și creștere. Acest lucru susține în plus ipoteza că fibrilarea amiloidă este în principal o reacție fizică, limitată în mare măsură de bariera energetică a nucleerii, pe care sonicarea o reduce eficient.

Impactul asupra cercetării bolilor asociate amiloidului

Formarea facilă și fiabilă a fibrilelor amiloide cu ajutorul sonicatorului pentru microplăci UIP400MTP are implicații semnificative pentru cercetarea bolii Alzheimer (AD) și a altor afecțiuni asociate amiloidului, precum boala Parkinson, diabetul de tip II și amiloidozele sistemice. În AD, agregarea amiloidului-β (Aβ) este un semn patologic cheie, însă studierea cineticii sale de fibrilare rămâne dificilă din cauza fazelor de latență lungi și a variabilității metodelor convenționale. Formarea fibrilelor determinată de sonicare accelerează nucleerea, asigurând o reproductibilitate ridicată și o variabilitate redusă, aspect esențial pentru screeningul potențialilor inhibitori și pentru înțelegerea mecanismelor amiloidogene. În plus, capacitatea mare de procesare a probelor a UIP400MTP permite investigații la scară largă privind plierea greșită și agregarea proteinelor, facilitând descoperirea unor agenți terapeutici care pot modula formarea fibrilelor și pot atenua potențial progresia neurodegenerativă.

Acest studiu stabilește sonicarea cu sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP drept o metodă extrem de eficientă pentru accelerarea formării fibrilelor amiloide. Principalele avantaje ale acestei abordări includ:

• Reducerea drastică a timpului de latență pentru fibrilare.
• Expunere uniformă la ultrasunete în toate godeurile, permițând formarea reproductibilă a fibrilelor.
• Capacitate de screening cu capacitate mare de procesare, ceea ce o face potrivită pentru căutări la nivelul întregului genom privind amiloidogenitatea proteinelor.

Prin integrarea sonicării cu detecția prin fluorescență ThT, această metodă oferă o platformă rapidă, scalabilă și fiabilă pentru studierea fibrilării amiloide. Având în vedere eficiența și potențialul său de capacitate mare de procesare, această abordare poate facilita sinteza facilă a fibrilelor amiloide pentru cercetarea biofizică și farmaceutică, oferind un instrument promițător pentru studiile legate de amiloid și pentru screeningul de medicamente.