PMCA pentru detectarea cu randament ridicat a prionilor folosind UIP400MTP Sonicator

Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP oferă o soluție puternică pentru pregătirea probelor cu randament ridicat în amplificarea ciclică cu pliere greșită a proteinelor (PMCA). Prin furnizarea unei distribuții uniforme a energiei în mai multe godeuri și menținerea parametrilor de sonicare precisi, acest sistem permite procesarea simultană a numeroase probe cu o reproductibilitate excepțională. Aceste capabilități sunt esențiale pentru optimizarea PMCA pentru a detecta prioni la concentrații scăzute în probe biologice dificile, cum ar fi saliva, unde inhibitorii de testare pot ascunde rezultatele.

Bolile prionice, cum ar fi boala cronică de emaciere (CWD) la cervide și boala Creutzfeldt-Jakob (CJD) la om, sunt tulburări neurodegenerative cauzate de proteinele prionice pliate greșit (PrP^Sc). Aceste boli implică adesea niveluri scăzute de prioni infecțioși în fluidele corporale, cum ar fi saliva, sângele și urina, complicând diagnosticul și cercetarea. Transmiterea orizontală a CWD prin prioni aruncați în matrice de mediu are implicații deosebit de semnificative pentru gestionarea faunei sălbatice și sănătatea ecologică. În mod similar, în boli precum boala Creutzfeldt-Jakob, amplificarea fiabilă a proteinelor prionice pliate greșit din probele umane este crucială pentru avansarea diagnosticului și înțelegerea progresiei bolii.

Aplicarea unui protocol PMCA modificat permite ocolirea inhibitorilor obișnuiți ai testului (de exemplu, mucinele din salivă) și obținerea unei sensibilități ridicate în detectarea prionilor care altfel ar fi nedetectabili sau ambigui folosind tehnici precum conversia indusă de cutremur în timp real (RT-QuIC). Aceste progrese îmbunătățesc detectarea prionilor pentru diverse boli, făcând din PMCA un instrument indispensabil pentru cercetarea și diagnosticarea prionilor. Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri facilitează UIP400MTP sonicarea PMCA cu randament ridicat a numeroase probe în microplăci (de exemplu, plăci cu 6, 24 sau 96 de godeuri) sau flacoane într-un suport pentru tuburi.

Protocol pentru amplificarea ciclică cu pliere greșită a proteinelor (PMCA)

Următorul protocol permite procesarea eficientă a numărului mare de probe în exact aceleași condiții pentru rezultate robuste ale cercetării.

Pregătirea probei

Material de pornire:
Pregătiți eșantioanele prin:

• Resuspendarea peleților de extracție sarkosyl în substrat PMCA.
• Omogenați cerebrali sau probe de sânge cu semințe prionice.

Substrat:

• Utilizați un omogenat cerebral 10% (greutate/vol) preparat de la șoareci transgenici care supraexprimă PrP^C (de exemplu, șoareci Tg).
• Omogenizarea țesutului cerebral în:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Păstrați substratul la -80ºC până la utilizare.

Configurarea probei în microplacă sau tuburi:
Tuburi:

• Adăugați 90 μL de substrat omogenat al creierului și semințe cu 10 μL de probă (de exemplu, sânge, omogenat cerebral sau pastilă de sarkosil).
• Așezați 3 mărgele de teflon (diametru de 1,59 mm sau 2,38 mm) în fiecare tub de 0,2 ml.
• Montați tuburile într-un rack compatibil cu sonicatorul UIP400MTP.

Microplacă cu 6 godeuri:

• Se adaugă 5 ml de substrat omogenat al creierului și semințe cu 500 μl de probă per godeu.
• Adăugați 3 margele de teflon în fiecare puț.

Procedura PMCA

Plasare:
Așezați suportul pentru tuburi sau microplaca cu 6 godeuri în sonicatorul UIP400MTP conform instrucțiunilor producătorului.

Program de ciclism:
Efectuați 144 de cicluri PMCA după cum urmează:

• Incubație: 29 de minute și 30 de secunde la 37°C.
• Sonicare: 30 de secunde la 60% amplitudine.
• Monitorizați temperatura: Utilizați senzorul de temperatură conectabil pentru a monitoriza sample temperatură și programați UIP400MTP la o temperatură maximă de 48-50°C.

Rundele ulterioare:
După finalizarea primei runde de 144 de cicluri, transferați o cotă alicotă a materialului amplificat:

• Se diluează de 10 ori în substratul de omogenizare a creierului de șoarece transgenic proaspăt.
• Efectuați 96 de cicluri PMCA pentru rundele ulterioare, menținând aceiași parametri de sonicare.
• Continuați pentru numărul dorit de runde (de obicei până la 5).

Detectarea PrP^Sc

1. Digestia proteinazei K:
   – Tratați probele cu proteinază K (50 μg/ml) la 37°C timp de 1 oră.
   – Terminați digestia adăugând tampon de probă SDS și fierbând timp de 10 minute.
2. Analiza Western Blot:
   – Analizați probele digerate utilizând:
   – anticorpi anti-PrP 6H4 sau PRC1.
   – Efectuați SDS-PAGE și transferați pe membrane PVDF pentru detectare.

 

 

Procesați mai multe probe pentru rezultate mai robuste

Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP îmbunătățește semnificativ eficiența și scalabilitatea amplificării ciclice cu pliere greșită a proteinelor (PMCA), abordând natura tradițională consumatoare de timp a procedurii. Permițând procesarea simultană a până la 96 de probe într-o placă cu 96 de godeuri, sistemul eficientizează fluxurile de lucru PMCA, menținând în același timp condiții de sonicare precise și uniforme în toate godeurile. Această capacitate de randament ridicat minimizează manipularea manuală, reduce pașii care necesită multă muncă și asigură reproductibilitatea, făcându-l un instrument indispensabil pentru cercetarea prionilor. Fie că investighează boala cronică sau boala Creutzfeldt-Jakob, UIP400MTP facilitează studiile la scară largă cu o eficiență mai mare, permițând cercetătorilor să răspundă cerințelor aplicațiilor moderne de diagnostic și științifice.

---

---

Literatură? Referințe

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.