PMCA pentru detectarea prionilor cu capacitate mare de procesare folosind sonicatorul UIP400MTP

Sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP oferă o soluție puternică pentru pregătirea probelor cu capacitate mare de procesare în amplificarea ciclică prin plierea greșită a proteinelor (PMCA). Prin asigurarea unei distribuții uniforme a energiei în mai multe godeuri și menținerea unor parametri preciși de sonicare, acest sistem permite procesarea simultană a numeroase probe cu o reproductibilitate excepțională. Aceste capabilități sunt esențiale pentru optimizarea PMCA în vederea detectării prionilor la concentrații scăzute în probe biologice dificile, precum saliva, unde inhibitorii de testare pot ascunde rezultatele.

Bolile prionice, precum boala cronică de emaciere (CWD) la cervide și boala Creutzfeldt-Jakob (CJD) la om, sunt tulburări neurodegenerative cauzate de proteine prionice pliate greșit (PrP^Sc). Aceste boli implică adesea niveluri scăzute de prioni infecțioși în fluidele corporale, precum saliva, sângele și urina, ceea ce complică diagnosticarea și cercetarea. Transmiterea orizontală a CWD prin prionii eliminați în matrici de mediu are implicații deosebit de semnificative pentru gestionarea faunei sălbatice și sănătatea ecologică. În mod similar, în boli precum boala Creutzfeldt-Jakob, amplificarea fiabilă a proteinelor prionice pliate greșit din probe umane este crucială pentru progresul diagnosticării și înțelegerea evoluției bolii.

Aplicarea unui protocol PMCA modificat permite ocolirea inhibitorilor de testare obișnuiți (de ex., mucinele din salivă) și atingerea unei sensibilități ridicate în detectarea prionilor care altfel ar fi nedetectabili sau ambigui prin tehnici precum conversia în timp real indusă prin agitare (RT-QuIC). Aceste progrese îmbunătățesc detectarea prionilor pentru diverse boli, făcând din PMCA un instrument indispensabil pentru cercetarea și diagnosticarea prionilor. Sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP facilitează PMCA cu capacitate mare de procesare prin sonicarea a numeroase probe în microplăci (de ex. plăci cu 6, 24 sau 96 de godeuri) sau flacoane într-un suport de tuburi.

Protocol pentru amplificarea ciclică prin plierea greșită a proteinelor (PMCA) cu capacitate mare de procesare

Următorul protocol permite procesarea eficientă a unui număr mare de probe în exact aceleași condiții pentru rezultate de cercetare robuste.

Pregătirea probelor

Material de pornire:
Pregătiți probele prin:

• Resuspendarea peletelor de extracție cu sarkosil în substrat PMCA.
• Îmbogățirea directă a omogenatelor cerebrale sau a probelor de sânge cu semințe de prioni.

Substrat:

• Folosiți un omogenat cerebral 10% (greutate/volum) preparat din șoareci transgenici care supraexprimă PrP^C (de ex., șoareci Tg).
• Omogenizați țesutul cerebral în:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Depozitați substratul la -80ºC până la utilizare.

Configurarea probelor în microplacă sau tuburi:
Tuburi:

• Adăugați 90 μL de substrat de omogenat cerebral și însămânțați cu 10 μL de probă (de ex., sânge, omogenat cerebral sau pelet de sarkosil).
• Așezați 3 bile de teflon (diametru de 1,59 mm sau 2,38 mm) în fiecare tub de 0,2 mL.
• Montați tuburile într-un suport compatibil cu sonicatorul UIP400MTP.

Microplacă cu 6 godeuri:

• Adăugați 5 mL de substrat de omogenat cerebral și însămânțați cu 500 μL de probă per godeu.
• Adăugați 3 bile de teflon în fiecare godeu.

Procedura PMCA

Amplasare:
Așezați suportul de tuburi sau microplaca cu 6 godeuri în sonicatorul UIP400MTP conform instrucțiunilor producătorului.

Program de ciclare:
Efectuați 144 de cicluri PMCA după cum urmează:

• Incubare: 29 de minute și 30 de secunde la 37°C.
• Sonicare: 30 de secunde la 60% amplitudine.
• Monitorizați temperatura: Folosiți senzorul de temperatură conectabil pentru a monitoriza temperatura probelor și programați UIP400MTP la o temperatură max. de 48–50°C.

Runde ulterioare:
După finalizarea primei runde de 144 de cicluri, transferați o alicotă din materialul amplificat:

• Diluați de 10 ori în substrat proaspăt de omogenat cerebral de șoarece transgenic.
• Efectuați 96 de cicluri PMCA pentru rundele ulterioare, menținând aceiași parametri de sonicare.
• Continuați pentru numărul dorit de runde (de obicei până la 5).

Detectarea PrP^Sc

1. Digestie cu proteinază K:
   – Tratați probele cu proteinază K (50 μg/mL) la 37°C timp de 1 oră.
   – Opriți digestia prin adăugarea tamponului de probă SDS și fierbere timp de 10 minute.
2. Analiză Western blot:
   – Analizați probele digerate folosind:
   – anticorpi anti-PrP 6H4 sau PRC1.
   – Efectuați SDS-PAGE și transferați pe membrane PVDF pentru detectare.

 

Hielscher UIP400MTP este cel mai versatil sonicator pentru plăcile dumneavoastră cu godeuri multiple, plăcile PCR sau tuburile pentru probe. Cu o putere continuă de sonicare de 400 wați, este conceput pentru aplicații precum liza celulară, emulsionarea, extracția proteinelor, fragmentarea ADN / ARN, dezaglomerarea, extracția din probe FFPE, desprinderea celulelor și a biofilmelor sau emulsionarea. UIP400MTP nu este o baie ultrasonică. Este un sonicator de tip cupă, de mare intensitate, pentru sonicare focalizată. Acest sonicator puternic, fără contact, asigură sonicarea uniformă în toate godeurile plăcii dumneavoastră standard. Aveți control precis asupra amplitudinii, puterii și funcționării în impulsuri. Un temporizator încorporat și o sondă de temperatură asigură rezultate constante. Sonicatorul pentru plăci UIP400MTP răcește probele cu ajutorul unei băi de apă, cu răcitor extern opțional.

 

Procesați mai multe probe pentru rezultate mai robuste

Sonicatorul pentru plăci cu godeuri multiple UIP400MTP îmbunătățește semnificativ eficiența și scalabilitatea amplificării ciclice prin plierea greșită a proteinelor (PMCA), rezolvând natura tradițional consumatoare de timp a procedurii. Permițând procesarea simultană a până la 96 de probe într-o placă cu 96 de godeuri, sistemul eficientizează fluxurile de lucru PMCA, menținând totodată condiții de sonicare precise și uniforme în toate godeurile. Această capabilitate de procesare cu capacitate mare minimizează manipularea manuală, reduce etapele laborioase și asigură reproductibilitatea, făcând din el un instrument indispensabil pentru cercetarea prionilor. Fie că se investighează boala cronică de emaciere sau boala Creutzfeldt-Jakob, UIP400MTP facilitează studiile la scară largă cu o eficiență mai mare, permițând cercetătorilor să răspundă cerințelor aplicațiilor moderne de diagnosticare și științifice.

---

---

Literatură / Referințe

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.