تحضير عينة عالية الإنتاجية لتشخيص الميتوكوندريا
يتم إجراء تشخيص الميتوكوندريا في الأبحاث والعيادات باستخدام تقنيات مختلفة مثل التسلسل وتفاعل البوليميراز المتسلسل والمقايسات الكيميائية الحيوية. تستخدم هذه الطرق لتحديد طفرات الحمض النووي وقياس وظيفة الميتوكوندريا. يساعد التسلسل في اكتشاف الطفرات الجينية ، بينما يمكن ل PCR تحديد تسلسلات الحمض النووي المحددة. تقوم المقايسات الكيميائية الحيوية بتقييم وظائف بروتينات وإنزيمات الميتوكوندريا.
يعد تشخيص أمراض الميتوكوندريا صعبا بشكل خاص بسبب التباين السريري الواضح لهذه الأمراض وكذلك بسبب التفاعل المعقد بين جينومين موروثين مختلفين: الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) والجينوم النووي.
استخراج الحمض النووي وتجزئته باستخدام Sonication
يعد استخراج الحمض النووي من الأنسجة العضلية مفيدا بشكل خاص عند الاشتباه في حدوث تغييرات خاصة بالأنسجة في mtDNA. قد تشمل هذه التغييرات حذف mtDNA في شلل العين الخارجي التدريجي المزمن (CPEO) ، أو الطفرات النقطية ل mtDNA في اعتلالات عضلية الميتوكوندريا ، أو استنفاد mtDNA في متلازمة ألبرز. يمكن بعد ذلك استخدام الحمض النووي المستخرج من الأنسجة العضلية لإجراء اختبارات جينية مختلفة ، مثل اللطخة الجنوبية و PCR بعيد المدى للحذف ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي للنضوب ، أو التسلسل للطفرات النقطية .
يتم تطبيق Sonication ، باستخدام الموجات فوق الصوتية المكثفة ، لعدة تطبيقات في تشخيص الميتوكوندريا. يتم استخدامه لتحلل الخلايا لاستخراج محتويات داخل الخلايا مثل الميتوكوندريا والحمض النووي ، لقص الحمض النووي مثل mtDNA و nDNA للتسلسل ، ولتجانس العينات.
UIP400MTP لوحة سونيكاتور لإعداد العينات عالية الإنتاجية عينات صوتنة موحدة في لوحات متعددة الآبار و 96 بئر
كيفية عزل الميتوكوندريا من الخلايا والأنسجة
يتكون عزل الميتوكوندريا من خطوتين أساسيتين: تعطيل الخلايا لإطلاق محتوياتها ، واستخدام الطرد المركزي التفاضلي لفصل واستعادة أجزاء الميتوكوندريا.
صوتنة
صوتيات Hielscher متوافقة مع مخازن ومجموعات التحلل القياسية ، مما يجعلها مناسبة لعزل الميتوكوندريا. يخدم Sonication غرضين رئيسيين:
- تحلل الخلية: الموجات فوق الصوتية تعطل أغشية الخلايا ، وتطلق محتويات داخل الخلايا.
- اضطراب الميتوكوندريا: يمكن أن يؤدي Sonication في خطوة لاحقة إلى فتح الميتوكوندريا لإطلاق بروتينات الميتوكوندريا أو الحمض النووي للميتوكوندريا.
- تجزئة mtDNA: Sonication هي تقنية موثوقة لقص الحمض النووي للميتوكوندريا للتسلسل.
يسمح UIP400MTP صوتنة الألواح متعددة الآبار بإعداد عينة عالية الإنتاجية لعينات الميتوكوندريا. بالتزامن مع الطرد المركزي التفاضلي ، يعزز الصوتنة كفاءة عزل الميتوكوندريا ، مما يضمن غلات عالية من الميتوكوندريا السليمة المناسبة لمختلف تطبيقات المصب.
Hielscher UIP400MTP صوتنة لوحة متعددة الآبار يعمل مع أي لوحة قياسية
يوفر UIP400MTP صوتي متعدد الآبار فوائد عديدة لإعداد عينات عالية الإنتاجية ، على سبيل المثال في تشخيص الميتوكوندريا.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator لإعداد عينات عالية الإنتاجية في تشخيص العلامات الحيوية.
تعليمات مثالية لتجزئة mtDNA بالموجات فوق الصوتية
التحضير والاستخراج:
- قتلت الفئران C57BL / 6 بسبب خلع عنق الرحم.
- تم استخراج الكبد بسرعة وغسلها في برنامج تلفزيوني معقم بارد الجليد.
عزل الميتوكوندريا:
- تم عزل الميتوكوندريا باستخدام مطحنة أنسجة Dounce سعة 2 مل ومجموعة عزل الميتوكوندريا للأنسجة.
- الطرد المركزي الأولي عند 700× جم و 3000× جم.
- نفذ خطوتين إضافيتين للغسيل باستخدام المخزن المؤقت C.
عزل الحمض النووي:
- تم استخدام الحبيبات من الطرد المركزي الأول عند 700× جم لعزل الحمض النووي النووي (nDNA).
- تم عزل الحمض النووي باستخدام أعمدة الدوران.
- تم استخراج الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) من الميتوكوندريا المعزولة.
- تم استخراج الحمض النووي (nDNA) من المستخلصات النووية الخام ، وكلاهما من أنسجة كبد الفأر.
تجزئة الحمض النووي:
- تم تجزئة الحمض النووي على الجليد باستخدام سونيكاتور بالموجات فوق الصوتية UP50H 30 كيلو هرتز / 50 واط مع سونوترود 0.5 مم صغير الطرف عند 14 ميكرومتر لمدة 2 × 30 ثانية.
تجزئة التصور والكمية:
- تم تصور التجزئة بعد الموجات فوق الصوتية على هلام أغاروز 1 ٪ مع صبغة الحمض النووي الآمنة SYBR.
- تم تحديد الوفرة النسبية ل mtDNA و nDNA بواسطة qPCR.
(راجع مارييرو وآخرون ، 2019)
لإعداد العينات عالية الإنتاجية ، يسهل UIP400MTP صوتي متعدد الآبار تحضير أعداد العينات الكبيرة في لوحات قياسية ذات 96 بئرا ومتعددة الآبار وميكروتيتر.
اقرأ المزيد عن مزايا تحضير العينات عالية الإنتاجية باستخدام UIP400MTP!
نصائح لعزل الميتوكوندريا الأمثل باستخدام الصوت:
- التحكم في درجة الحرارة: قم بإجراء جميع الخطوات في نطاق درجة حرارة من 0 درجة مئوية إلى 4 درجات مئوية. هذا أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة ووظائف الميتوكوندريا.
- الكفاءة والسرعة: اعمل بسرعة وقم بتنقية الميتوكوندريا فقط بالقدر المطلوب لتطبيقك المحدد. التلاعب المفرط يمكن أن يؤدي إلى خسائر كبيرة في محتوى الميتوكوندريا.
- تخفيف المعلقات: الحفاظ على تركيزات منخفضة من معلقات الخلايا والعضيات طوال عملية العزل. هذا يساعد على تقليل مخاطر الاصطياد والتلازن ، وبالتالي تحسين نقاء الميتوكوندريا المعزولة.
- حجم العينة: اختر العديد من الاستعدادات الصغيرة بدلا من واحدة كبيرة. ينتج عن هذا النهج عادة غلات أفضل ، لأن التوسع لا يزيد بشكل متناسب من كمية الميتوكوندريا القابلة للاسترداد. يسهل UIP400MTP صوتي متعدد الآبار التحلل السريع والموثوق للخلية لعزل الميتوكوندريا وكذلك استخراج البروتين من الميتوكوندريا.
ستجعل هذه الإرشادات عملية العزل باستخدام التحلل بالموجات فوق الصوتية والطرد المركزي أكثر كفاءة ، مما ينتج عنه مستحضرات ميتوكوندريا عالية الجودة مناسبة للتطبيقات النهائية.
هيلشر سونياتورز – جودة صنع في ألمانيا
Hielscher الموجات فوق الصوتية معروفة جيدا لأعلى معايير الجودة والتصميم. المتانة والتشغيل السهل تسمح بالتكامل السلس للموجات فوق الصوتية لدينا في المنشآت الصناعية. يتم التعامل بسهولة مع الظروف القاسية والبيئات الصعبة بواسطة الموجات فوق الصوتية Hielscher.
Hielscher Ultrasonics هي شركة حاصلة على شهادة الأيزو وتركز بشكل خاص على الموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. بطبيعة الحال، الموجات فوق الصوتية Hielscher هي CE المتوافقة وتلبية متطلبات UL، وكالة الفضاء الكندية وبنفايات.
96 لوحة حسنا صوتي UIP400MTP لصوتنة لوحات microtiter ومتعددة الآبار
الأدب / المراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
أسئلة يتكرر طرحها عن تشخيص الميتوكوندريا والميتوكوندريا
ما هي الميتوكوندريا؟
الميتوكوندريا عضيات محاطة بغشاء توجد في خلايا معظم الكائنات الحقيقية النوى. تعرف باسم مراكز قوة الخلية لأنها تنتج الطاقة في صورة أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال عملية التنفس الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الميتوكوندريا لها الحمض النووي الخاص بها وتلعب أدوارا رئيسية في العمليات الخلوية الأخرى ، بما في ذلك تنظيم دورة الخلية وموت الخلايا.
ما الذي يميز mtDNA عن الحمض النووي الجينومي؟
يختلف الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) عن الحمض النووي الجينومي (gDNA) بعدة طرق رئيسية. يقع MtDNA في الميتوكوندريا ، وهو دائري ، وموروث من الأم ، بينما يقع gDNA في نواة الخلية ، وهو خطي ، وموروث من كلا الوالدين. MtDNA أصغر بكثير ، حيث يشفر 37 جينا فقط ، بينما يحتوي gDNA على حوالي 20,000-25,000 جين. MtDNA موجود في نسخ متعددة لكل خلية ، ولديه معدل طفرة أعلى ، ويرمز بشكل أساسي للبروتينات المشاركة في وظيفة الميتوكوندريا. في المقابل، عادة ما يكون الحمض النووي gDNA ثنائي الصيغة الصبغية، وله معدل طفرات أقل، ويشفر مجموعة كبيرة من الجينات اللازمة لنمو الكائن الحي ووظيفته. بالإضافة إلى ذلك ، يحدث نسخ mtDNA وترجمته داخل الميتوكوندريا ، بينما يحدث نسخ gDNA في النواة ، وتحدث الترجمة في السيتوبلازم. تعكس هذه الاختلافات أدوارها المتميزة وأصولها التطورية.
ما هو المستخلص الخالي من الخلايا؟
المستخلص الخالي من الخلايا هو محلول يحتوي على محتويات الخلايا المحللة ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية والمكونات الخلوية الأخرى ، ولكن بدون أغشية خلوية سليمة. يستخدم هذا المستخلص في أبحاث الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لدراسة العمليات الخلوية في المختبر ، مما يمكن الباحثين من تحليل التفاعلات والآليات خارج الخلايا الحية.
ما هو دور اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل في تشخيص الميتوكوندريا؟
تلعب اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل دورا مهما في تشخيص الميتوكوندريا من خلال تمكين الكشف عن الطفرات أو الحذف أو اختلافات عدد النسخ في الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA). إنها تسمح بتضخيم مناطق mtDNA محددة لتحديد المتغيرات المسببة للأمراض المرتبطة باضطرابات الميتوكوندريا. تستخدم التقنيات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل بعيد المدى ، أيضا لتقييم سلامة mtDNA ، ومستويات التغاير ، واستنفاد mtDNA ، مما يوفر رؤى أساسية حول وظيفة الميتوكوندريا والمرض.
تعرف على كيفية تسهيل UIP400MTP Microplate Sonicator اختبارات ومقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)!
ما هو الطرد المركزي التفاضلي؟
الطرد المركزي التفاضلي هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لتجزئة الخلايا وعزل الميتوكوندريا. تفصل هذه الطريقة الهياكل الخلوية بناء على معامل الترسيب ، والذي يعتمد على كل من الكثافة والشكل. تتضمن العملية تطبيق مستويات متفاوتة من قوة الطرد المركزي على العينات في محاليل الملح المخزنة بكثافات محددة. سوف تستقر الهياكل ذات معاملات الترسيب المماثلة في قاع أنبوب التجميع في نفس الوقت ، مما يسمح باستعادتها.
كيف يتم استخدام الطرد المركزي التفاضلي لعزل الميتوكوندريا؟
يسمح الطرد المركزي التفاضلي للباحثين بفصل أجزاء الميتوكوندريا بشكل فعال عن المكونات الخلوية الأخرى. يتضمن عزل الميتوكوندريا عدة خطوات للطرد المركزي والانتعاش اللاحق للعزلة.
الطرد المركزي الأولي: تطبيق قوة طرد مركزي منخفضة على رواسب الحطام الخلوي الكبير والنوى.
أجهزة الطرد المركزي اللاحقة: زيادة قوة الطرد المركزي تدريجيا إلى كسور الحبيبات المخصبة بالميتوكوندريا. كل خطوة من خطوات الطرد المركزي تزيل الهياكل ذات معاملات الترسيب الأعلى تدريجيا.
استرداد الكسر: بعد كل طرد مركزي ، يتم جمع الحبيبات ، ويخضع الطافي لقوى g أعلى لعزل الجزء التالي. يتكرر هذا حتى يتم تحقيق النقاء المطلوب للميتوكوندريا.