تحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع لتشخيص أمراض الميتوكوندريا
يُجرى تشخيص أمراض الميتوكوندريا في الأبحاث والعيادات باستخدام تقنيات متنوعة، مثل تحديد التسلسل وPCR والاختبارات الكيميائية الحيوية. وتُستخدم هذه الطرق لتحديد طفرات DNA وقياس وظيفة الميتوكوندريا. ويساعد تحديد التسلسل على كشف الطفرات الجينية، بينما يمكن باستخدام PCR قياس كمية تسلسلات محددة من DNA. وتُقيِّم الاختبارات الكيميائية الحيوية الأداء الوظيفي لبروتينات الميتوكوندريا وإنزيماتها.
يُعد تشخيص أمراض الميتوكوندريا صعبًا على نحو خاص بسبب التباين السريري الواضح لهذه الأمراض، وكذلك بسبب التفاعل المعقد بين جينومين يختلفان في نمط توارثهما: DNA الميتوكوندريا (mtDNA) والجينوم النووي.
استخلاص DNA وتجزئته باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية
يكون استخلاص DNA من النسيج العضلي مفيدًا على نحو خاص عند الاشتباه في حدوث تغيرات في mtDNA خاصة بهذا النسيج. وقد تشمل هذه التغيرات حذوفات في mtDNA في حالات شلل عضلات العين الخارجي المترقي المزمن (CPEO)، أو طفرات نقطية في mtDNA في اعتلالات العضلات الميتوكوندرية، أو استنزاف mtDNA في متلازمة ألبرز. ويمكن بعد ذلك استخدام DNA المستخلص من النسيج العضلي في اختبارات جينية متنوعة، مثل لطخة ساوثرن وPCR طويل المدى للكشف عن الحذوفات، أو PCR في الزمن الحقيقي للكشف عن الاستنزاف، أو تحديد التسلسل للكشف عن الطفرات النقطية.
تُستخدم المعالجة بالموجات فوق الصوتية، التي تعتمد على موجات فوق صوتية شديدة، في عدة تطبيقات لتشخيص أمراض الميتوكوندريا. وتُستخدم لتحليل الخلايا لاستخلاص محتوياتها الداخلية، مثل الميتوكوندريا وDNA، ولتجزئة DNA بالقص، مثل mtDNA وnDNA، تمهيدًا لتحديد التسلسل، ولتجانس العينات.
جهاز معالجة الألواح بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP لتحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع يعالج العينات بالموجات فوق الصوتية بصورة متجانسة في الألواح متعددة الآبار والألواح ذات 96 بئرًا
كيفية عزل الميتوكوندريا من الخلايا والأنسجة
يتضمن عزل الميتوكوندريا خطوتين أساسيتين: تفكيك الخلايا لتحرير محتوياتها، واستخدام الطرد المركزي التفاضلي لفصل أجزاء الميتوكوندريا واستردادها.
المعالجة بالموجات فوق الصوتية
تتوافق أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher مع المحاليل المنظمة وأطقم التحليل الخلوي القياسية، مما يجعلها مناسبة لعزل الميتوكوندريا. وتؤدي المعالجة بالموجات فوق الصوتية غرضين رئيسيين:
- التحليل الخلوي: تُفكك الموجات فوق الصوتية أغشية الخلايا، مما يحرر محتوياتها الداخلية.
- تفكيك الميتوكوندريا: يمكن للمعالجة بالموجات فوق الصوتية في خطوة لاحقة أن تفتح الميتوكوندريا بتفكيكها لتحرير بروتينات الميتوكوندريا أو DNA الميتوكوندريا.
- تجزئة mtDNA: تُعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية تقنية موثوقة لتجزئة DNA الميتوكوندريا بالقص تمهيدًا لتحديد التسلسل.
يتيح جهاز معالجة الألواح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP تحضير عينات الميتوكوندريا بمعدل معالجة مرتفع. وبالاقتران مع الطرد المركزي التفاضلي، تعزز المعالجة بالموجات فوق الصوتية كفاءة عزل الميتوكوندريا، مما يضمن مردودًا مرتفعًا من الميتوكوندريا السليمة المناسبة لتطبيقات لاحقة متنوعة.
جهاز معالجة الألواح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية Hielscher UIP400MTP يعمل مع أي لوح قياسي
يوفر جهاز معالجة الألواح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP فوائد عديدة لتحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع، مثلًا في تشخيص أمراض الميتوكوندريا.
جهاز معالجة الألواح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP لتحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع في التشخيص باستخدام المؤشرات الحيوية.
تعليمات نموذجية لتجزئة mtDNA بالموجات فوق الصوتية
التحضير والاستخلاص:
- قُتلت فئران C57BL/6 بخلع الفقرات العنقية.
- استُخرجت الأكباد سريعًا وغُسلت بمحلول PBS معقم وبارد كالثلج.
عزل الميتوكوندريا:
- عُزلت الميتوكوندريا باستخدام مطحنة أنسجة Dounce بسعة 2-mL وطقم عزل الميتوكوندريا من الأنسجة.
- الطرد المركزي الأولي عند 700× g و3,000× g.
- أجرِ خطوتي غسل إضافيتين باستخدام المحلول المنظم C.
عزل DNA:
- استُخدم الراسب الناتج عن أول عملية طرد مركزي عند 700× g لعزل DNA النووي (nDNA).
- عُزل DNA باستخدام أعمدة الطرد المركزي.
- استُخلص DNA الميتوكوندريا (mtDNA) من الميتوكوندريا المعزولة.
- استُخلص DNA النووي (nDNA) من مستخلصات نووية خام، وكان كلاهما من نسيج كبد الفأر.
تجزئة DNA:
- جُزِّئ DNA على الثلج باستخدام جهاز معالجة بالموجات فوق الصوتية UP50H بمواصفات 30-kHz/50-W، مزود بسونوترود ذي طرف دقيق بقياس 0.5-mm، عند 14 μm لمدة 2 × 30 ثانية.
إظهار التجزئة وقياسها كميًا:
- أُظهرت التجزئة بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية على هلام أغاروز بتركيز 1% باستخدام صبغة DNA من نوع SYBR safe.
- حُددت الوفرة النسبية لكل من mtDNA وnDNA باستخدام qPCR.
(راجع Mariero et al., 2019)
لتحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع، يُسهِّل جهاز معالجة الألواح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP تحضير أعداد كبيرة من العينات في الألواح القياسية ذات 96 بئرًا والألواح متعددة الآبار وألواح المعايرة الدقيقة.
اقرأ المزيد عن مزايا تحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع باستخدام UIP400MTP!
نصائح لعزل الميتوكوندريا على النحو الأمثل باستخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية:
- التحكم في درجة الحرارة: أجرِ جميع الخطوات ضمن نطاق درجات حرارة من 0°C إلى 4°C. وهذا ضروري للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا وأدائها الوظيفي.
- الكفاءة والسرعة: اعمل بسرعة، ونقِّ الميتوكوندريا بالقدر الذي يتطلبه تطبيقك المحدد فقط. فقد تؤدي المناولة المفرطة إلى فقدان كميات كبيرة من محتوى الميتوكوندريا.
- تخفيف المعلقات: حافظ على تراكيز منخفضة لمعلقات الخلايا والعضيات طوال عملية العزل. ويساعد ذلك على تقليل مخاطر الاحتجاز والتراص، مما يحسن نقاء الميتوكوندريا المعزولة.
- حجم العينة: اختر تحضيرات متعددة صغيرة الحجم بدلًا من تحضير واحد كبير الحجم. ويؤدي هذا النهج عادةً إلى مردود أفضل، لأن زيادة حجم التحضير لا تزيد كمية الميتوكوندريا القابلة للاسترداد زيادةً متناسبة. ويُسهِّل جهاز معالجة الألواح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP التحليل الخلوي السريع والموثوق لعزل الميتوكوندريا، وكذلك استخلاص البروتينات من الميتوكوندريا.
ستجعل هذه الإرشادات عملية العزل باستخدام التحليل بالموجات فوق الصوتية والطرد المركزي أكثر كفاءة، مما ينتج مستحضرات ميتوكوندريا عالية الجودة ومناسبة للتطبيقات اللاحقة.
أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher – جودة صُنعت في ألمانيا
تشتهر أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بأعلى معايير الجودة والتصميم. وتتيح متانتها وسهولة تشغيلها دمج أجهزتنا للمعالجة بالموجات فوق الصوتية بسلاسة في المنشآت الصناعية. وتتعامل أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher بسهولة مع الظروف القاسية والبيئات كثيرة المتطلبات.
Hielscher Ultrasonics شركة حاصلة على شهادة ISO، وتولي اهتمامًا خاصًا بأجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية عالية الأداء التي تتميز بأحدث التقنيات وسهولة الاستخدام. وبالطبع، تتوافق أجهزة المعالجة بالموجات فوق الصوتية من Hielscher مع CE وتلبي متطلبات UL وCSA وRoHs.
جهاز معالجة الألواح ذات 96 بئرًا بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP لمعالجة ألواح المعايرة الدقيقة والألواح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية
المصادر / المراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
أسئلة شائعة عن الميتوكوندريا وتشخيص أمراضها
ما الميتوكوندريا؟
الميتوكوندريا عضيات محاطة بأغشية توجد في خلايا معظم الكائنات حقيقية النوى. وتُعرف بأنها محطات الطاقة في الخلية لأنها تنتج الطاقة في صورة أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال عملية التنفس الخلوي. وإضافةً إلى ذلك، تمتلك الميتوكوندريا DNA خاصًا بها، وتؤدي أدوارًا رئيسية في عمليات خلوية أخرى، بما في ذلك تنظيم دورة الخلية وموت الخلايا.
ما الذي يميز mtDNA عن DNA الجينومي؟
يختلف DNA الميتوكوندريا (mtDNA) عن DNA الجينومي (gDNA) في عدة جوانب رئيسية. يوجد mtDNA في الميتوكوندريا، ويكون دائريًا، ويُورث من الأم، بينما يوجد gDNA في نواة الخلية، ويكون خطيًا، ويُورث من كلا الوالدين. ويكون mtDNA أصغر بكثير، إذ يُشفِّر 37 جينًا فقط، بينما يحتوي gDNA على نحو 20,000–25,000 جين. ويوجد mtDNA في نسخ متعددة في كل خلية، وله معدل طفرات أعلى، ويُشفِّر أساسًا بروتينات تشارك في وظيفة الميتوكوندريا. في المقابل، يكون gDNA عادةً ثنائي الصيغة الصبغية، وله معدل طفرات أقل، ويُشفِّر مجموعة واسعة من الجينات اللازمة لنمو الكائن الحي وأدائه الوظيفي. وإضافةً إلى ذلك، يحدث نسخ mtDNA وترجمته داخل الميتوكوندريا، بينما يحدث نسخ gDNA في النواة، وتحدث ترجمته في السيتوبلازم. وتعكس هذه الاختلافات أدوارهما المتمايزة وأصولهما التطورية.
ما المستخلص الخالي من الخلايا؟
المستخلص الخالي من الخلايا هو محلول يحتوي على محتويات الخلايا التي خضعت للتحليل، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية والمكونات الخلوية الأخرى، ولكن دون أغشية خلوية سليمة. ويُستخدم هذا المستخلص في أبحاث الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لدراسة العمليات الخلوية في المختبر، مما يتيح للباحثين تحليل التفاعلات والآليات خارج الخلايا الحية.
ما الدور الذي تؤديه اختبارات PCR في تشخيص أمراض الميتوكوندريا؟
تؤدي اختبارات PCR دورًا حاسمًا في تشخيص أمراض الميتوكوندريا، إذ تتيح كشف الطفرات أو الحذوفات أو تغيرات عدد النسخ في DNA الميتوكوندريا (mtDNA). وهي تسمح بتضخيم مناطق محددة من mtDNA لتحديد المتغيرات المسببة للأمراض والمرتبطة باضطرابات الميتوكوندريا. وتُستخدم أيضًا التقنيات القائمة على PCR، مثل PCR الكمي (qPCR) وPCR طويل المدى، لتقييم سلامة mtDNA ومستويات التغاير الميتوكوندري واستنزاف mtDNA، مما يوفر معلومات أساسية عن وظيفة الميتوكوندريا وأمراضها.
تعرّف على كيفية تسهيل جهاز معالجة الألواح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP لاختبارات PCR ومقايساته!
ما الطرد المركزي التفاضلي؟
الطرد المركزي التفاضلي تقنية واسعة الاستخدام لتجزئة الخلايا وعزل الميتوكوندريا. وتفصل هذه الطريقة البنى الخلوية بناءً على معامل الترسيب الخاص بها، الذي يعتمد على كل من الكثافة والشكل. وتتضمن العملية تطبيق مستويات متفاوتة من قوة الطرد المركزي على عينات في محاليل ملحية منظمة ذات كثافات محددة. وتترسب البنى ذات معاملات الترسيب المتشابهة في قاع أنبوب التجميع في الوقت نفسه، مما يتيح استردادها.
كيف يُستخدم الطرد المركزي التفاضلي لعزل الميتوكوندريا؟
يتيح الطرد المركزي التفاضلي للباحثين فصل أجزاء الميتوكوندريا بفعالية عن المكونات الخلوية الأخرى. ويتضمن عزل الميتوكوندريا عدة خطوات للطرد المركزي، يليها استرداد المادة المعزولة.
الطرد المركزي الأولي: طبِّق قوة طرد مركزي منخفضة لترسيب الحطام الخلوي الكبير والنوى.
عمليات الطرد المركزي اللاحقة: زِد قوة الطرد المركزي تدريجيًا لترسيب الأجزاء الغنية بالميتوكوندريا. وتزيل كل خطوة من خطوات الطرد المركزي بنى ذات معاملات ترسيب أعلى تدريجيًا.
استرداد الأجزاء: بعد كل عملية طرد مركزي، يُجمع الراسب، ويُعرَّض السائل الطافي لقوى g أعلى لعزل الجزء التالي. ويُكرر ذلك حتى الوصول إلى درجة النقاء المطلوبة للميتوكوندريا.