تكوين لُييفات الأميلويد باستخدام جهاز معالجة الصفائح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP

تتكوّن لُييفات الأميلويد، شأنها شأن البلورات، من خلال عملية تنوٍّ يعقبها نمو. ولكن، بسبب ارتفاع حاجز الطاقة الحرة للتنوّي، لا يحدث التكوّن التلقائي للُييفات الأميلويد إلا بعد طور كمون طويل. وقد برزت المعالجة بالموجات فوق الصوتية بوصفها أداة قوية لتحفيز تنوّي الأميلويد، مما يسرّع تكوين اللُييفات بدرجة كبيرة. وعند دمج المعالجة بالموجات فوق الصوتية مع قارئ صفائح دقيقة يعتمد على فلورية الثيوفلافين T ‏(ThT)، فإنها تتيح الكشف عن لُييفات الأميلويد في عينات متعددة في الوقت نفسه بمعدل مرتفع لمعالجة العينات.

تكوين لُييفات الأميلويد المحفَّز بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز معالجة الصفائح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP

باستخدام جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP، يمكن تحضير كميات كبيرة من لُييفات الأميلويد ذات الجودة نفسها بسرعة لأغراض البحث. ويتيح هذا النهج الفعّال دراسة قابلية البروتينات لتكوين الأميلويد. وتسهّل هذه التقنية تكوين لُييفات الأميلويد بسرعة وبقابلية لتكرار النتائج، كما أُثبت باستخدام β2-ميكروغلوبولين (β2-m)، وهو بروتين قابل لتكوين الأميلويد ويرتبط بالداء النشواني المرتبط بغسيل الكلى.

نهج تجريبي بسيط: تكوين لُييفات الأميلويد المحفَّز بالموجات فوق الصوتية

لتحفيز تكوين اللُييفات، وُضعت صفيحة دقيقة ذات 96 بئرًا في مركز جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP، الذي يضمن تعرّضًا متجانسًا للموجات فوق الصوتية في جميع الآبار. وكانت الظروف التجريبية كما يلي:

1. احتوت كل بئر على 0.2 ml من محلول β2-ميكروغلوبولين (0.3 mg/ml، ‏pH 2.5)، أُضيف إليه ThT بتركيز 5 μM.
2. خضعت الصفيحة لدورات من المعالجة بالموجات فوق الصوتية، مثل المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 دقيقة تليها فترة توقف لمدة 9 دقائق.
3. بعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، قِيست فلورية ThT باستخدام قارئ صفائح دقيقة.

(راجع So et al., 2011)

المقارنة مع التحريك التقليدي

مقارنةً بطرق التحريك التقليدية، قلّصت المعالجة بالموجات فوق الصوتية طور الكمون لتكوين اللُييفات بدرجة كبيرة. ففي ظروف رجّ الصفائح الدقيقة التقليدية، أظهرت 1 فقط من أصل 10 آبار زيادةً في فلورية ThT بعد 20 ساعة. وفي المقابل، عند استخدام المعالجة بالموجات فوق الصوتية على دورات (15 دقيقة من المعالجة بالموجات فوق الصوتية تليها 5 دقائق من السكون)، رُصدت زيادة كبيرة في فلورية ThT مباشرةً بعد أول معالجة بالموجات فوق الصوتية.

التسريع السريع لحركية تكوين اللُييفات

أظهرت النتائج التي توصّل إليها So et al. (2011) أن المعالجة بالموجات فوق الصوتية يمكن أن تسرّع التكوّن التلقائي للُييفات β2-ميكروغلوبولين عند pH 2.5، بحيث ينخفض الزمن من عدة ساعات إلى 10–15 دقيقة فقط.
وأكدت صور المجهر ذي القوة الذرية (AFM) أن اللُييفات المتولّدة بمعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق كل 15 دقيقة لم يكن من الممكن تمييزها شكليًا عن اللُييفات المتكوّنة بمعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 دقيقة كل 10 دقائق. وهذا يبرز قابلية تكرار نتائج تكوين لُييفات الأميلويد المحفَّز بالموجات فوق الصوتية ومتانة هذه العملية.

صور AFM للُييفات الأميلويد الناتجة عن المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 1-min كل 10 min ‏(i)، وعن المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 10-min كل 15 min ‏(ii)، وعن تفاعل البذر دون معالجة بالموجات فوق الصوتية (iii). يمثّل شريط المقياس الأبيض 1 μm.
الدراسة والصور: ©So et al., 2011

تكوين اللُييفات في ظروف pH متعادل

حتى في ظروف pH متعادل، تحقق تكوين اللُييفات بعد فترة كمون بلغت 1.5 ساعة، مما يدل على أن المعالجة بالموجات فوق الصوتية تخفض بدرجة كبيرة حاجز الطاقة للتنوّي والنمو. وهذا يدعم أيضًا الفرضية القائلة بأن تكوين لُييفات الأميلويد هو في الأساس تفاعل فيزيائي، يقيّده إلى حد كبير حاجز طاقة التنوّي، الذي تخفضه المعالجة بالموجات فوق الصوتية بفعالية.

الأثر في أبحاث الأمراض المرتبطة بالأميلويد

إن تكوين لُييفات الأميلويد بسهولة وموثوقية باستخدام جهاز معالجة الصفائح الدقيقة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP له آثار مهمة في أبحاث مرض ألزهايمر (AD) وغيره من الاضطرابات المرتبطة بالأميلويد، مثل مرض باركنسون وداء السكري من النوع II وأمراض الداء النشواني الجهازي. ففي مرض ألزهايمر، يُعدّ تجمّع أميلويد-β ‏(Aβ) سمة مرضية رئيسية، إلا أن دراسة حركية تكوين لُييفاته تظل صعبة بسبب أطوار الكمون الطويلة والتباين في الطرق التقليدية. ويسرّع تكوين اللُييفات المدفوع بالموجات فوق الصوتية عملية التنوّي، مما يضمن قابلية عالية لتكرار النتائج ويقلّل التباين، وهو أمر بالغ الأهمية لفحص المثبّطات المحتملة وفهم آليات تكوين الأميلويد. علاوةً على ذلك، تتيح قدرة UIP400MTP على معالجة العينات بمعدل مرتفع إجراء دراسات واسعة النطاق حول سوء طيّ البروتينات وتجمّعها، مما يسهّل اكتشاف عوامل علاجية يمكنها تعديل تكوين اللُييفات وربما الحدّ من تقدّم التنكّس العصبي.

تُثبت هذه الدراسة أن المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز معالجة الصفائح متعددة الآبار بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP طريقة عالية الكفاءة لتسريع تكوين لُييفات الأميلويد. وتشمل المزايا الرئيسية لهذا النهج ما يلي:

• تقليص كبير لفترة الكمون لتكوين اللُييفات.
• تعرّض متجانس للموجات فوق الصوتية في جميع الآبار، مما يتيح تكوين اللُييفات مع قابلية لتكرار النتائج.
• القدرة على إجراء الفحص بمعدل مرتفع لمعالجة العينات، مما يجعله مناسبًا لعمليات البحث على نطاق الجينوم عن قابلية البروتينات لتكوين الأميلويد.

من خلال دمج المعالجة بالموجات فوق الصوتية مع الكشف بفلورية ThT، توفر هذه الطريقة منصة سريعة وقابلة للتوسّع وموثوقة لدراسة تكوين لُييفات الأميلويد. ونظرًا إلى كفاءتها وإمكاناتها في معالجة العينات بمعدل مرتفع، قد يسهّل هذا النهج تحضير لُييفات الأميلويد بسهولة لأبحاث الفيزياء الحيوية والأبحاث الصيدلانية، ويوفر أداة واعدة للدراسات المرتبطة بالأميلويد وفحص الأدوية.