PMCA للكشف عن البريونات بمعدل معالجة مرتفع باستخدام جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP

يوفر جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للألواح متعددة الآبار UIP400MTP حلاً قوياً لتحضير العينات بمعدل معالجة مرتفع في التضخيم الدوري لسوء طي البروتين (PMCA). ومن خلال توزيع الطاقة توزيعاً متجانساً عبر آبار متعددة والحفاظ على معلمات دقيقة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية، يتيح هذا النظام معالجة عينات عديدة في الوقت نفسه مع قابلية استثنائية لتكرار النتائج. وتُعد هذه القدرات أساسية لتحسين PMCA للكشف عن البريونات بتركيزات منخفضة في العينات البيولوجية التي يصعب تحليلها، مثل اللعاب، حيث يمكن أن تحجب مثبطات الاختبار النتائج.

أمراض البريونات، مثل مرض الهزال المزمن (CWD) لدى الأيليات ومرض كروتزفيلد–ياكوب (CJD) لدى البشر، هي اضطرابات تنكسية عصبية تسببها بروتينات بريونية سيئة الطي (PrP^Sc). وغالباً ما تتسم هذه الأمراض بوجود مستويات منخفضة من البريونات المعدية في سوائل الجسم، مثل اللعاب والدم والبول، مما يعقّد التشخيص والبحث. وللانتقال الأفقي لمرض CWD عبر البريونات المطروحة في الأوساط البيئية آثار بالغة الأهمية على إدارة الحياة البرية وصحة النظم البيئية. وبالمثل، في أمراض مثل مرض كروتزفيلد–ياكوب، يُعد التضخيم الموثوق للبروتينات البريونية سيئة الطي من العينات البشرية ضرورياً لتطوير التشخيص وفهم تطور المرض.

يتيح تطبيق بروتوكول PMCA معدّل تجاوز مثبطات الاختبار الشائعة (مثل الميوسينات في اللعاب) وتحقيق حساسية عالية في الكشف عن البريونات التي يتعذر الكشف عنها بخلاف ذلك أو تكون نتائج الكشف عنها ملتبسة باستخدام تقنيات مثل التحويل المحرَّض بالرجّ في الزمن الحقيقي (RT-QuIC). وتعزز هذه التطورات الكشف عن البريونات في أمراض مختلفة، مما يجعل PMCA أداة لا غنى عنها لأبحاث البريونات وتشخيصها. ويسهّل جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للألواح متعددة الآبار UIP400MTP إجراء PMCA بمعدل معالجة مرتفع من خلال معالجة عينات عديدة بالموجات فوق الصوتية في ألواح دقيقة (مثل الألواح ذات 6 أو 24 أو 96 بئراً) أو قوارير موضوعة في حامل أنابيب.

بروتوكول التضخيم الدوري لسوء طي البروتين (PMCA) بمعدل معالجة مرتفع

يتيح البروتوكول التالي معالجة عدد كبير من العينات بكفاءة في ظروف متطابقة تماماً للحصول على نتائج بحثية متينة.

تحضير العينات

المادة الأولية:
حضّر العينات من خلال:

• إعادة تعليق الرواسب الناتجة عن الاستخلاص بالساركوسيل في ركيزة PMCA.
• إضافة بذور بريونية مباشرةً إلى مجانسات الدماغ أو عينات الدم.

الركيزة:

• استخدم مجانس دماغ بتركيز 10% (wt/vol) محضّراً من فئران معدّلة وراثياً تفرط في التعبير عن PrP^C (مثل فئران Tg).
• جانس نسيج الدماغ في:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• خزّن الركيزة عند -80ºC حتى الاستخدام.

إعداد العينات في لوح دقيق أو أنابيب:
الأنابيب:

• أضف 90 μL من ركيزة مجانس الدماغ ولقّحها بـ 10 μL من العينة (مثل الدم أو مجانس الدماغ أو راسب الساركوسيل).
• ضع 3 خرزات من Teflon (بقطر 1.59-mm أو 2.38-mm) في كل أنبوب بسعة 0.2 mL.
• ثبّت الأنابيب في حامل متوافق مع جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP.

لوح دقيق ذو 6 آبار:

• أضف 5 mL من ركيزة مجانس الدماغ ولقّحها بـ 500 μL من العينة لكل بئر.
• أضف 3 خرزات من Teflon إلى كل بئر.

إجراء PMCA

الوضع في الجهاز:
ضع حامل الأنابيب أو اللوح الدقيق ذا 6 آبار داخل جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP وفقاً لتعليمات الشركة المصنّعة.

برنامج الدورات:
نفّذ 144 دورة PMCA على النحو التالي:

• الحضانة: 29 دقيقة و30 ثانية عند 37°C.
• المعالجة بالموجات فوق الصوتية: 30 ثانية بسعة اهتزاز تبلغ 60%.
• راقب درجة الحرارة: استخدم مستشعر درجة الحرارة القابل للتوصيل لمراقبة درجة حرارة العينات، واضبط برمجة UIP400MTP على درجة حرارة قصوى تبلغ 48–50°C.

الجولات اللاحقة:
بعد إكمال الجولة الأولى المكوّنة من 144 دورة، انقل جزءاً مقيساً من المادة المضخّمة:

• خفّفه بمقدار 10 أضعاف في ركيزة طازجة من مجانس دماغ فئران معدّلة وراثياً.
• نفّذ 96 دورة PMCA في الجولات اللاحقة، مع الحفاظ على معلمات المعالجة بالموجات فوق الصوتية نفسها.
• واصل حتى بلوغ العدد المطلوب من الجولات (عادةً ما يصل إلى 5).

الكشف عن PrP^Sc

1. الهضم بإنزيم Proteinase K:
   – عالج العينات بإنزيم Proteinase K بتركيز (50 μg/mL) عند 37°C لمدة 1 ساعة.
   – أوقف الهضم بإضافة المحلول المنظّم لعينات SDS والغلي لمدة 10 دقائق.
2. تحليل اللطخة الغربية:
   – حلّل العينات المهضومة باستخدام:
   – الأجسام المضادة لـ PrP من نوع 6H4 أو PRC1.
   – أجرِ الرحلان الكهربائي SDS-PAGE وانقل البروتينات إلى أغشية PVDF للكشف عنها.

 

يُعد Hielscher UIP400MTP جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية الأكثر مرونة لصفائحك متعددة الآبار أو صفائح PCR أو أنابيب العينات. وبقدرة خرج مستمرة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية تبلغ 400 واط، صُمّم لتطبيقات مثل تحلل الخلايا والاستحلاب واستخلاص البروتينات وتجزئة DNA / RNA وتفكيك التكتلات والاستخلاص من FFPE وفصل الخلايا والأغشية الحيوية عن الأسطح أو الاستحلاب. UIP400MTP ليس حمامًا فوق صوتي، بل هو مسبار كأسي عالي الشدة للمعالجة المركّزة بالموجات فوق الصوتية. يوفر هذا الجهاز القوي غير التلامسي معالجة متجانسة بالموجات فوق الصوتية في جميع آبار صفيحتك القياسية. يتيح لك تحكمًا دقيقًا في السعة والقدرة والتشغيل النبضي. ويضمن المؤقت المدمج ومسبار درجة الحرارة نتائج متسقة. يبرّد جهاز معالجة الصفائح بالموجات فوق الصوتية UIP400MTP العينات باستخدام حمام مائي (مع مبرد خارجي اختياري).

 

عالج المزيد من العينات للحصول على نتائج أكثر متانة

يعزز جهاز المعالجة بالموجات فوق الصوتية للألواح متعددة الآبار UIP400MTP كفاءة التضخيم الدوري لسوء طي البروتين (PMCA) وقابليته للتوسع بدرجة كبيرة، مع معالجة مشكلة استغراق هذا الإجراء وقتاً طويلاً تقليدياً. ومن خلال إتاحة معالجة ما يصل إلى 96 عينة في الوقت نفسه في لوح ذي 96 بئراً، يبسّط النظام سير عمل PMCA مع الحفاظ على ظروف دقيقة ومتجانسة للمعالجة بالموجات فوق الصوتية في جميع الآبار. وتقلل هذه القدرة على معالجة العينات بمعدل مرتفع من المناولة اليدوية ومن الخطوات التي تتطلب جهداً بشرياً كبيراً، وتضمن قابلية تكرار النتائج، مما يجعله أداة لا غنى عنها لأبحاث البريونات. وسواء كان البحث يتعلق بمرض الهزال المزمن أو مرض كروتزفيلد–ياكوب، فإن UIP400MTP يسهّل إجراء دراسات واسعة النطاق بكفاءة أكبر، مما يمكّن الباحثين من تلبية متطلبات التطبيقات التشخيصية والعلمية الحديثة.

---

---

المؤلفات / المراجع

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.