PMCA للكشف عن الإنتاجية العالية للبريونات باستخدام UIP400MTP Sonicator

يوفر جهاز الصوت متعدد الآبار UIP400MTP حلا قويا لتحضير عينة عالية الإنتاجية في تضخيم دوري خاطئ للبروتين (PMCA). من خلال تقديم توزيع موحد للطاقة عبر آبار متعددة والحفاظ على معلمات صوتنة دقيقة ، يتيح هذا النظام المعالجة المتزامنة للعديد من العينات مع قابلية استنساخ استثنائية. هذه القدرات ضرورية لتحسين PMCA للكشف عن البريونات بتركيزات منخفضة في العينات البيولوجية الصعبة ، مثل اللعاب ، حيث يمكن لمثبطات الفحص أن تحجب النتائج.

أمراض البريون ، مثل مرض الهزال المزمن (CWD) في عنق الرحم ومرض كروتزفيلد جاكوب (CJD) عند البشر ، هي اضطرابات تنكسية عصبية ناتجة عن بروتينات البريون غير المطوية (PrP^[ك]). غالبا ما تنطوي هذه الأمراض على مستويات منخفضة من البريونات المعدية في سوائل الجسم ، مثل اللعاب والدم والبول ، مما يعقد التشخيص والبحث. إن الانتقال الأفقي ل CWD من خلال البريونات التي يتم إلقاؤها في المصفوفات البيئية له آثار كبيرة بشكل خاص على إدارة الحياة البرية والصحة الإيكولوجية. وبالمثل ، في أمراض مثل مرض كروتزفيلد جاكوب ، يعد التضخيم الموثوق لبروتينات البريون غير المطوية من العينات البشرية أمرا بالغ الأهمية لتطوير التشخيص وفهم تطور المرض.

يسمح تطبيق بروتوكول PMCA المعدل بتجاوز مثبطات الفحص الشائعة (على سبيل المثال ، الميوسين في اللعاب) وتحقيق حساسية عالية في اكتشاف البريونات التي قد تكون غير قابلة للاكتشاف أو غامضة باستخدام تقنيات مثل التحويل الناجم عن الارتعاش في الوقت الفعلي (RT-QuIC). تعزز هذه التطورات اكتشاف البريون للأمراض المختلفة ، مما يجعل PMCA أداة لا غنى عنها لأبحاث البريون وتشخيصه. تسهل UIP400MTP الصوتنة ذات الآبار المتعددة PMCA عالية الإنتاجية التي تقوم بصوتنة العديد من العينات في الصفائح الدقيقة (على سبيل المثال 6 أو 24 أو 96 بئر) أو قوارير في رف أنبوبي.

بروتوكول التضخيم الدوري الخاطئ للبروتين عالي الإنتاجية (PMCA)

يسمح البروتوكول التالي بالمعالجة الفعالة لعدد العينة المرتفع في ظل نفس الظروف بالضبط للحصول على نتائج بحث قوية.

إعداد العينة

مواد البداية:
تحضير العينات من خلال:

• تعليق كريات استخراج ساركوسيل في الركيزة PMCA.
• يتجانس الدماغ مباشرة أو عينات الدم ببذور البريون.

الركيزه:

• استخدم 10٪ (الوزن / الحجم) متجانس الدماغ المحضر من الفئران المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن PrP^C (على سبيل المثال ، فئران Tg).
• تجانس أنسجة المخ في:
  – 1× برنامج تلفزيوني.
  – 150 ملي كلوريد الصوديوم.
  – 1٪ تريتون X-100.
• قم بتخزين الركيزة في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

إعداد العينة في صفيحة أو أنابيب:
انابيب:

• أضف 90 ميكرولتر من الركيزة المتجانسة للدماغ والبذور مع 10 ميكرولتر من العينة (على سبيل المثال ، الدم أو متجانس الدماغ أو حبيبات ساركوسيل).
• ضع 3 حبات تفلون (قطر 1.59 مم أو 2.38 مم) في كل أنبوب 0.2 مل.
• قم بتركيب الأنابيب في رف متوافق مع جهاز الصوتنة UIP400MTP.

6-بئر ميكروبليت:

• أضف 5 مل من الركيزة المتجانسة للدماغ والبذور مع 500 ميكرولتر من العينة لكل بئر.
• أضف 3 حبات تفلون إلى كل بئر.

إجراء PMCA

التنسيب:
ضع رف الأنبوب أو 6 آبار في جهاز الصوتنة UIP400MTP وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

برنامج ركوب الدراجات:
قم بإجراء 144 دورة PMCA على النحو التالي:

• الحضانة: 29 دقيقة و 30 ثانية عند 37 درجة مئوية.
• صوتنة: 30 ثانية بسعة 60٪.
• مراقبة درجة الحرارة: استخدم مستشعر درجة الحرارة القابل للتوصيل لمراقبة درجة حرارة العينة وبرمجة UIP400MTP على درجة حرارة قصوى تتراوح من 48 إلى 50 درجة مئوية.

الجولات اللاحقة:
بعد الانتهاء من الجولة الأولى المكونة من 144 دورة ، قم بنقل حصة من المادة المضخمة:

• تمييع 10 أضعاف إلى ركيزة متجانسة جديدة لدماغ الفأر المعدلة وراثيا.
• قم بإجراء 96 دورة PMCA للجولات اللاحقة ، مع الحفاظ على نفس معلمات الصوتنة.
• تابع للحصول على العدد المطلوب من الجولات (عادة ما يصل إلى 5).

الكشف عن PrP^[ك]

1. هضم البروتيناز K:
   – عالج العينات بالبروتيناز K (50 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
   – قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة المخزن المؤقت لعينة SDS والغليان لمدة 10 دقائق.
2. تحليل اللطخة الغربية:
   – تحليل العينات المهضومة باستخدام:
   – 6H4 أو PRC1 الأجسام المضادة ل PrP.
   – قم بإجراء SDS-PAGE ونقله إلى أغشية PVDF للكشف.

 

 

معالجة المزيد من العينات للحصول على نتائج أكثر قوة

يعمل جهاز الصوت متعدد الآبار UIP400MTP على تحسين كفاءة وقابلية التوسع للتضخيم الدوري للبروتين (PMCA) ، مما يعالج الطبيعة التقليدية التي تستغرق وقتا طويلا لهذا الإجراء. من خلال السماح بالمعالجة المتزامنة لما يصل إلى 96 عينة في لوحة 96 بئر ، يعمل النظام على تبسيط سير عمل PMCA مع الحفاظ على ظروف صوتنة دقيقة وموحدة عبر جميع الآبار. تقلل هذه القدرة عالية الإنتاجية من المناولة اليدوية ، وتقلل من الخطوات كثيفة العمالة ، وتضمن قابلية التكرار ، مما يجعلها أداة لا غنى عنها لأبحاث البريون. سواء كان التحقيق في مرض الهزال المزمن أو مرض كروتزفيلد جاكوب ، فإن UIP400MTP يسهل الدراسات واسعة النطاق بكفاءة أكبر ، مما يمكن الباحثين من تلبية متطلبات التطبيقات التشخيصية والعلمية الحديثة.

---

---

الأدب / المراجع

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.