Pregătirea probei cu randament ridicat pentru diagnosticarea mitocondrială
Diagnosticarea mitocondrială în cercetare și clinici este efectuată folosind diverse tehnici, cum ar fi secvențierea, PCR și testele biochimice. Aceste metode sunt utilizate pentru a identifica mutațiile ADN-ului și pentru a măsura funcția mitocondrială. Secvențierea ajută la detectarea mutațiilor genetice, în timp ce PCR poate cuantifica secvențe ADN specifice. Testele biochimice evaluează funcționalitatea proteinelor și enzimelor mitocondriale.
Diagnosticul bolilor mitocondriale este deosebit de dificil datorită variabilității clinice pronunțate a acestor boli, precum și datorită interacțiunii complexe dintre două genomuri moștenite diferit: ADN-ul mitocondrial (mtDNA) și genomul nuclear.
Extracția ADN-ului și fragmentarea folosind sonicare
Extragerea ADN-ului din țesutul muscular este deosebit de utilă atunci când sunt suspectate modificări specifice țesutului în ADN-ul mitocondrial. Aceste modificări pot include deleții ale ADNmt-ului în oftalmoplegia externă progresivă cronică (CPEO), mutații punctuale ale ADNmt-ului în miopatiile mitocondriale sau epuizarea ADNmt-ului în sindromul Alpers. ADN-ul extras din țesutul muscular poate fi apoi utilizat pentru diverse teste genetice, cum ar fi Southern Blot și PCR cu rază lungă de acțiune pentru ștergeri, PCR în timp real pentru epuizare sau secvențiere pentru mutații punctuale.
Sonicare, folosind unde ultrasonice intense, se aplică pentru mai multe aplicații în diagnosticul mitocondrial. Este folosit pentru a liza celulele pentru a extrage conținutul intracelular, cum ar fi mitocondriile și ADN-ul, pentru a forfeca ADN-ul, cum ar fi ADN-ul mitocondrial și ADNn, pentru secvențiere și pentru a omogeniza probele.
UIP400MTP Plate Sonicator pentru pregătirea probei cu randament ridicat uniformizează probele în plăci cu mai multe puțuri și 96 de puțuri
Cum se izolează mitocondriile de celule și țesuturi
Izolarea mitocondrială cuprinde două etape esențiale: perturbarea celulelor pentru a-și elibera conținutul și utilizarea centrifugării diferențiale pentru separarea și recuperarea fracțiilor mitocondriale.
Sonicare
Hielscher sonicators sunt compatibile cu tampoane de liză standard și kituri, făcându-le potrivite pentru izolarea mitocondriilor. Sonicare servește două scopuri principale:
- Liza celulară: Undele ultrasonice perturbă membranele celulare, eliberând conținut intracelular.
- Perturbarea mitocondrială: Sonicare într-un pas ulterior poate rupe mitocondriile pentru a elibera proteine mitocondriale sau ADN-ul mitocondrial.
- Fragmentarea ADNmt Sonicare este o tehnică fiabilă pentru forfecarea ADN-ului mitocondrial pentru secvențiere.
Sonicatorul cu plăci cu mai multe puțuri UIP400MTP permite pregătirea probei de mare randament a probelor mitocondriale. În combinație cu centrifugarea diferențială, sonicare îmbunătățește eficiența izolației mitocondriale, asigurând randamente ridicate de mitocondrii intacte potrivite pentru diverse aplicații în aval.
Hielscher UIP400MTP sonicator placă multiwell funcționează cu orice placă standard
Sonicatorul cu mai multe plăci UIP400MTP oferă numeroase beneficii pentru pregătirea probei cu randament ridicat, de exemplu în diagnosticul mitocondrial.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator pentru pregătirea probei de mare randament în diagnosticarea biomarkerilor.
Instrucțiuni exemplare pentru fragmentarea cu ultrasunete mtDNA
Pregătirea și extracția:
- Șoarecii C57BL/6 au fost uciși prin luxație cervicală.
- Ficatul a fost extras rapid și spălat în PBS steril rece ca gheața.
Izolarea mitocondriilor:
- Mitocondriile au fost izolate folosind un polizor de țesut Dounce de 2 ml și un kit de izolare a mitocondriilor pentru țesuturi.
- Centrifugare inițială la 700× g și 3.000× g.
- Efectuați doi pași suplimentari de spălare cu tamponul C.
Izolarea ADN-ului:
- Peleta de la prima centrifugare la 700× g a fost utilizată pentru izolarea ADN-ului nuclear (ADNn).
- ADN-ul a fost izolat folosind coloane de spin.
- ADN-ul mitocondrial (mtDNA) a fost extras din mitocondriile izolate.
- ADN-ul nuclear (ADNn) a fost extras din extracte nucleare brute, ambele din țesutul hepatic de șoarece.
Fragmentarea ADN-ului:
- ADN-ul a fost fragmentat pe gheață folosind un sonicator cu ultrasunete 30-kHz/50-W UP50H cu un 0.5-mm micro-tip sonotrode la 14 μm pentru 2 × 30 secunde.
Vizualizarea și cuantificarea fragmentării:
- Fragmentarea după ultrasonificare a fost vizualizată pe un gel de agaroză 1% cu colorant ADN sigur SYBR.
- Abundența relativă a ADNmt și ADNn a fost determinată prin qPCR.
(cf. Mariero și colab., 2019)
Pentru pregătirea probei cu randament ridicat, sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP facilitează pregătirea unui număr mare de probe în plăci standard cu 96 de puțuri, multi-godeuri și microtitrare.
Citiți mai multe despre avantajele pregătirii probelor cu randament ridicat folosind UIP400MTP!
Sfaturi pentru izolarea optimă a mitocondriilor folosind sonicare:
- Controlul temperaturii: Efectuați toți pașii într-un interval de temperatură cuprins între 0 °C și 4 °C. Acest lucru este esențial pentru menținerea integrității și funcționalității mitocondriilor.
- Eficiență și viteză: Lucrați rapid și purificați mitocondriile numai în măsura necesară pentru aplicația dvs. specifică. Manipularea excesivă poate duce la pierderi semnificative de conținut mitocondrial.
- Diluarea suspensiilor: Se mențin concentrații scăzute de suspensii de celule și organite pe tot parcursul procesului de izolare. Acest lucru ajută la minimizarea riscurilor de capturare și aglutinare, îmbunătățind astfel puritatea mitocondriilor izolate.
- Volumul eșantionului: Optați pentru mai multe preparate la scară mică, mai degrabă decât una singură, mare. Această abordare are ca rezultat, de obicei, randamente mai bune, deoarece extinderea nu crește proporțional cantitatea de mitocondrii recuperabile. Sonicatorul cu plăci cu mai multe godeuri UIP400MTP facilitează liza rapidă și fiabilă a celulei pentru izolarea mitocondriilor, precum și extracția proteinelor din mitocondrii.
Aceste linii directoare vor face procesul de izolare folosind liza cu ultrasunete și centrifugare mai eficient, producând preparate mitocondriale de înaltă calitate potrivite pentru aplicații în aval.
Hielscher Sonicatoare – Calitate Made in Germany
Hielscher ultrasonicators sunt bine-cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și funcționarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicators noastre în instalații industriale. Condiții dure și medii solicitante sunt ușor de manipulat de ultrasonicators Hielscher.
Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicators de înaltă performanță cu tehnologie de ultimă oră și ușurință în utilizare. Desigur, ultrasonicators Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.
96-bine placă Sonicator UIP400MTP pentru sonicare de microtitrare și plăci multiwell
Literatură / Referințe
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Întrebări frecvente despre mitocondrii și diagnosticul mitocondrial
Ce sunt mitocondriile?
Mitocondriile sunt organite legate de membrană găsite în celulele majorității organismelor eucariote. Acestea sunt cunoscute sub numele de centrale ale celulei, deoarece produc energie sub formă de adenozin trifosfat (ATP) prin procesul de respirație celulară. În plus, mitocondriile au propriul ADN și joacă roluri cheie în alte procese celulare, inclusiv reglarea ciclului celular și moartea celulelor.
Ce diferențiază ADN-ul mitocondrial de ADN-ul genomic?
ADN-ul mitocondrial (mtDNA) diferă de ADN-ul genomic (gDNA) în mai multe moduri cheie. ADNmt-ul este localizat în mitocondrii, este circular și este moștenit matern, în timp ce ADNmt este localizat în nucleul celular, este liniar și este moștenit de la ambii părinți. ADN-ul mitocondrial este mult mai mic, codificând doar 37 de gene, în timp ce ADNmt conține aproximativ 20.000-25.000 de gene. ADNmt-ul este prezent în mai multe copii pe celulă, are o rată mai mare de mutație și codifică în primul rând proteinele implicate în funcția mitocondrială. În schimb, ADNg-ul este de obicei diploid, are o rată de mutație mai mică și codifică o gamă largă de gene necesare dezvoltării și funcției organismului. În plus, transcrierea și translația ADNmt au loc în mitocondrii, în timp ce transcrierea ADNmt are loc în nucleu, iar translația are loc în citoplasmă. Aceste diferențe reflectă rolurile lor distincte și originile lor evolutive.
Ce este extractul fără celule?
Un extract fără celule este o soluție care conține conținutul celulelor lizate, inclusiv proteine, acizi nucleici și alte componente celulare, dar fără membrane celulare intacte. Acest extract este utilizat în cercetarea biochimică și biologie moleculară pentru a studia procesele celulare in vitro, permițând cercetătorilor să analizeze reacțiile și mecanismele din afara celulelor vii.
Ce rol joacă testele PCR în diagnosticul mitocondrial?
Testele PCR joacă un rol critic în diagnosticul mitocondrial, permițând detectarea mutațiilor, delețiilor sau variațiilor numărului de copii în ADN-ul mitocondrial (ADNmt). Acestea permit amplificarea regiunilor specifice ale ADNmt pentru a identifica variantele patogene asociate cu tulburările mitocondriale. Tehnicile bazate pe PCR, cum ar fi PCR cantitativă (qPCR) și PCR pe distanțe lungi, sunt, de asemenea, utilizate pentru a evalua integritatea ADNmt, nivelurile de heteroplasmie și epuizarea ADNmt, oferind informații esențiale despre funcția și boala mitocondrială.
Aflați cum UIP400MTP Microplate Sonicator facilitează testele și testele PCR!
Ce este centrifugarea diferențială?
Centrifugarea diferențială este o tehnică utilizată pe scară largă pentru fracționarea celulară și izolarea mitocondrială. Această metodă separă structurile celulare pe baza coeficientului lor de sedimentare, care depinde atât de densitate, cât și de formă. Procesul implică aplicarea unor niveluri diferite de forță centrifugă probelor în soluții de sare tamponate cu densități specifice. Structurile cu coeficienți de sedimentare similari se vor depune în partea inferioară a tubului de colectare în același timp, permițând recuperarea acestora.
Cum se utilizează centrifugarea diferențială pentru izolarea mitocondriilor?
Centrifugarea diferențială permite cercetătorilor să separe eficient fracțiunile mitocondriale de alte componente celulare. Izolarea mitocondriilor implică mai multe etape de centrifugare și recuperarea ulterioară a izolatului.
Centrifugare inițială: Aplicați o forță centrifugă scăzută sedimentelor mari de resturi celulare și nuclee.
Centrifugări ulterioare: Se mărește treptat forța centrifugă până la fracțiunile de pelete îmbogățite cu mitocondrii. Fiecare etapă de centrifugare îndepărtează structurile cu coeficienți de sedimentare progresiv mai mari.
Recuperarea fracției: După fiecare centrifugare, granula este colectată, iar supernatantul este supus unor forțe g mai mari pentru a izola următoarea fracție. Acest lucru se repetă până când se obține puritatea dorită a mitocondriilor.