Prepararea probelor cu capacitate mare de procesare pentru diagnosticul mitocondrial
Diagnosticul mitocondrial în cercetare și în clinică se realizează prin diverse tehnici, precum secvențierea, PCR și testele biochimice. Aceste metode sunt utilizate pentru identificarea mutațiilor ADN și pentru măsurarea funcției mitocondriale. Secvențierea ajută la detectarea mutațiilor genetice, în timp ce PCR poate cuantifica secvențe ADN specifice. Testele biochimice evaluează funcționalitatea proteinelor și enzimelor mitocondriale.
Diagnosticul bolilor mitocondriale este deosebit de dificil din cauza variabilității clinice pronunțate a acestor boli, precum și din cauza interacțiunii complexe dintre două genomuri moștenite în mod diferit: ADN-ul mitocondrial (mtDNA) și genomul nuclear.
Extracția și fragmentarea ADN-ului prin sonicare
Extracția ADN-ului din țesutul muscular este deosebit de utilă atunci când se suspectează modificări ale mtDNA specifice țesutului. Aceste modificări pot include deleții ale mtDNA în oftalmoplegia externă progresivă cronică (CPEO), mutații punctiforme ale mtDNA în miopatiile mitocondriale sau depleția mtDNA în sindromul Alpers. ADN-ul extras din țesutul muscular poate fi apoi utilizat pentru diverse teste genetice, precum Southern blot și PCR long-range pentru deleții, PCR în timp real pentru depleție sau secvențierea pentru mutații punctiforme.
Sonicarea, care utilizează unde ultrasonice intense, este aplicată în mai multe aplicații din diagnosticul mitocondrial. Este utilizată pentru liza celulelor în vederea extragerii conținutului intracelular, precum mitocondriile și ADN-ul, pentru forfecarea ADN-ului, precum mtDNA și nDNA, în vederea secvențierii, și pentru omogenizarea probelor.
Sonicatorul pentru plăci UIP400MTP pentru prepararea probelor cu capacitate mare de procesare sonicează uniform probele în plăci multi-godeu și în plăci cu 96 de godeuri
Cum se izolează mitocondriile din celule și țesuturi
Izolarea mitocondriilor cuprinde două etape esențiale: dezintegrarea celulelor pentru eliberarea conținutului acestora și utilizarea centrifugării diferențiale pentru separarea și recuperarea fracțiilor mitocondriale.
Sonicarea
Sonicatoarele Hielscher sunt compatibile cu tampoanele și kiturile de liză standard, ceea ce le face potrivite pentru izolarea mitocondriilor. Sonicarea servește două scopuri principale:
- Liza celulară: Undele ultrasonice dezintegrează membranele celulare, eliberând conținutul intracelular.
- Dezintegrarea mitocondriilor: Sonicarea într-o etapă ulterioară poate deschide mitocondriile pentru a elibera proteinele mitocondriale sau ADN-ul mitocondrial.
- Fragmentarea mtDNA: Sonicarea este o tehnică fiabilă pentru forfecarea ADN-ului mitocondrial în vederea secvențierii.
Sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP permite prepararea cu capacitate mare de procesare a probelor mitocondriale. În combinație cu centrifugarea diferențială, sonicarea crește eficiența izolării mitocondriilor, asigurând randamente ridicate de mitocondrii intacte, potrivite pentru diverse aplicații ulterioare.
Sonicatorul pentru plăci multi-godeu Hielscher UIP400MTP funcționează cu orice placă standard
Sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP oferă numeroase avantaje pentru prepararea probelor cu capacitate mare de procesare, de exemplu în diagnosticul mitocondrial.
Sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP pentru prepararea probelor cu capacitate mare de procesare în diagnosticul pe bază de biomarkeri.
Instrucțiuni exemplificative pentru fragmentarea ultrasonică a mtDNA
Pregătire și extracție:
- Șoarecii C57BL/6 au fost sacrificați prin dislocare cervicală.
- Ficații au fost extrași rapid și spălați în PBS steril răcit pe gheață.
Izolarea mitocondriilor:
- Mitocondriile au fost izolate utilizând un omogenizator tisular Dounce de 2-mL și un Mitochondria Isolation Kit for Tissue.
- Centrifugare inițială la 700× g și 3.000× g.
- Efectuați două etape suplimentare de spălare cu tamponul C.
Izolarea ADN-ului:
- Sedimentul (peleta) de la prima centrifugare la 700× g a fost utilizat pentru izolarea ADN-ului nuclear (nDNA).
- ADN-ul a fost izolat utilizând coloane de centrifugare.
- ADN-ul mitocondrial (mtDNA) a fost extras din mitocondriile izolate.
- ADN-ul nuclear (nDNA) a fost extras din extracte nucleare brute, ambele provenind din țesut hepatic de șoarece.
Fragmentarea ADN-ului:
- ADN-ul a fost fragmentat pe gheață utilizând sonicatorul cu ultrasunete UP50H de 30-kHz/50-W, cu o sonotrodă cu micro-vârf de 0,5-mm, la 14 μm, timp de 2 × 30 de secunde.
Vizualizarea și cuantificarea fragmentării:
- Fragmentarea după ultrasonicare a fost vizualizată pe un gel de agaroză 1% cu colorantul ADN SYBR safe.
- Abundența relativă a mtDNA și nDNA a fost determinată prin qPCR.
(cf. Mariero et al., 2019)
Pentru prepararea probelor cu capacitate mare de procesare, sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP facilitează prepararea unui număr mare de probe în plăci standard cu 96 de godeuri, plăci multi-godeu și plăci de microtitrare.
Aflați mai multe despre avantajele preparării probelor cu capacitate mare de procesare cu UIP400MTP!
Sfaturi pentru izolarea optimă a mitocondriilor prin sonicare:
- Controlul temperaturii: Efectuați toate etapele într-un interval de temperatură de 0°C până la 4°C. Acest lucru este esențial pentru menținerea integrității și funcționalității mitocondriilor.
- Eficiență și rapiditate: Lucrați rapid și purificați mitocondriile doar în măsura necesară pentru aplicația dumneavoastră specifică. Manipularea excesivă poate duce la pierderi semnificative de conținut mitocondrial.
- Diluarea suspensiilor: Mențineți concentrații scăzute ale suspensiilor de celule și organite pe parcursul întregului proces de izolare. Acest lucru ajută la reducerea la minimum a riscurilor de captare și aglutinare, îmbunătățind astfel puritatea mitocondriilor izolate.
- Volumul probei: Optați pentru mai multe preparări la scară mică în locul uneia singure la scară mare. Această abordare duce de regulă la randamente mai bune, deoarece mărirea scării nu crește proporțional cantitatea de mitocondrii recuperabile. Sonicatorul pentru plăci multi-godeu UIP400MTP facilitează liza rapidă și fiabilă a celulelor pentru izolarea mitocondriilor, precum și extracția proteinelor din mitocondrii.
Aceste recomandări vor face procesul de izolare prin liză ultrasonică și centrifugare mai eficient, oferind preparate mitocondriale de înaltă calitate, potrivite pentru aplicații ulterioare.
Sonicatoare Hielscher – calitate Made in Germany
Ultrasonicatoarele Hielscher sunt bine cunoscute pentru cele mai înalte standarde de calitate și design. Robustețea și operarea ușoară permit integrarea fără probleme a ultrasonicatoarelor noastre în instalațiile industriale. Condițiile dificile și mediile solicitante sunt gestionate cu ușurință de ultrasonicatoarele Hielscher.
Hielscher Ultrasonics este o companie certificată ISO și pune un accent deosebit pe ultrasonicatoare de înaltă performanță, cu tehnologie de ultimă generație și ușurință în utilizare. Desigur, ultrasonicatoarele Hielscher sunt conforme CE și îndeplinesc cerințele UL, CSA și RoHs.
Sonicatorul pentru plăci cu 96 de godeuri UIP400MTP pentru sonicarea plăcilor de microtitrare și a plăcilor multi-godeu
Literatură / Referințe
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Întrebări frecvente despre mitocondrii și diagnosticul mitocondrial
Ce sunt mitocondriile?
Mitocondriile sunt organite delimitate de membrane, prezente în celulele majorității organismelor eucariote. Ele sunt cunoscute drept centralele energetice ale celulei, deoarece produc energie sub formă de adenozin trifosfat (ATP) prin procesul de respirație celulară. În plus, mitocondriile au propriul ADN și joacă roluri-cheie în alte procese celulare, inclusiv în reglarea ciclului celular și a morții celulare.
Ce diferențiază mtDNA de ADN-ul genomic?
ADN-ul mitocondrial (mtDNA) diferă de ADN-ul genomic (gDNA) în câteva privințe esențiale. MtDNA se află în mitocondrii, este circular și se moștenește pe linie maternă, în timp ce gDNA se află în nucleul celulei, este liniar și se moștenește de la ambii părinți. MtDNA este mult mai mic, codificând doar 37 de gene, în timp ce gDNA conține aproximativ 20.000–25.000 de gene. MtDNA este prezent în copii multiple per celulă, are o rată de mutație mai mare și codifică în principal proteine implicate în funcția mitocondrială. În schimb, gDNA este de regulă diploid, are o rată de mutație mai mică și codifică o gamă vastă de gene necesare dezvoltării și funcționării organismului. În plus, transcripția și translația mtDNA au loc în mitocondrii, în timp ce transcripția gDNA are loc în nucleu, iar translația are loc în citoplasmă. Aceste diferențe reflectă rolurile și originile evolutive distincte ale acestora.
Ce este extractul acelular?
Un extract acelular este o soluție care conține conținutul celulelor lizate, inclusiv proteine, acizi nucleici și alte componente celulare, dar fără membrane celulare intacte. Acest extract este utilizat în cercetarea biochimică și de biologie moleculară pentru studierea proceselor celulare in vitro, permițând cercetătorilor să analizeze reacții și mecanisme în afara celulelor vii.
Ce rol joacă testele PCR în diagnosticul mitocondrial?
Testele PCR joacă un rol esențial în diagnosticul mitocondrial, permițând detectarea mutațiilor, delețiilor sau variațiilor numărului de copii ale ADN-ului mitocondrial (mtDNA). Ele permit amplificarea unor regiuni specifice ale mtDNA pentru identificarea variantelor patogene asociate tulburărilor mitocondriale. Tehnicile bazate pe PCR, precum PCR cantitativ (qPCR) și PCR long-range, sunt utilizate și pentru evaluarea integrității mtDNA, a nivelurilor de heteroplasmie și a depleției mtDNA, oferind informații esențiale despre funcția și bolile mitocondriale.
Aflați cum sonicatorul pentru microplăci UIP400MTP facilitează testele PCR și analizele!
Ce este centrifugarea diferențială?
Centrifugarea diferențială este o tehnică larg utilizată pentru fracționarea celulară și izolarea mitocondriilor. Această metodă separă structurile celulare pe baza coeficientului lor de sedimentare, care depinde atât de densitate, cât și de formă. Procesul implică aplicarea unor niveluri variabile de forță centrifugă asupra probelor aflate în soluții saline tamponate cu densități specifice. Structurile cu coeficienți de sedimentare similari se vor depune pe fundul tubului colector în același timp, permițând recuperarea lor.
Cum se utilizează centrifugarea diferențială pentru izolarea mitocondriilor?
Centrifugarea diferențială permite cercetătorilor să separe eficient fracțiile mitocondriale de celelalte componente celulare. Izolarea mitocondriilor implică mai multe etape de centrifugare și recuperarea ulterioară a izolatului.
Centrifugarea inițială: Aplicați o forță centrifugă redusă pentru a sedimenta resturile celulare mari și nucleii.
Centrifugările ulterioare: Creșteți treptat forța centrifugă pentru a sedimenta fracțiile îmbogățite în mitocondrii. Fiecare etapă de centrifugare îndepărtează structuri cu coeficienți de sedimentare progresiv mai mari.
Recuperarea fracțiilor: După fiecare centrifugare, sedimentul este colectat, iar supernatantul este supus unor forțe g mai mari pentru izolarea fracției următoare. Acest lucru se repetă până la atingerea purității dorite a mitocondriilor.