Ma'alo'obtal u ultrasonido Hielscher

Ultrasónico lisis e. Coli

  • Bacteria e. coli leti' le bacteria asab comúnmente utilizada ti' Microbiología yéetel biotecnología.
  • Disruptores u endocrinos le célula ultrasonidos proporcionan ya'ala'al máaxo'ob máano'ob fiables ka reproducibles utia'al u lisis e. coli.
  • Intensa láayli' precisamente controlables cavitación esquileo le muuk' ka ocasionar le completa interrupción yéetel extracción ka'anal rendimiento (je'ebix proteínas, ADN).

Interrupción le célula tuméen le cavitación

Bacteria Escherichia coli le lisis confiablemente usando Homogeneizadores ultrasonidos u wa'ak'al.Homogeneizadores ultrasónicos bin yano'ob sonda operan yéetel yan 20.000 ciclos tumen segundo (20kHz) yéetel causa cavitación te' ts'a'abal wa supsensions. Ti' microscópicas u cavitación acústica ti' vacío - bey presiones yéetel altas temperaturas u desgarrar le células. Kex le temperaturas táan u béeytal u chukpachtik ya'ab miles grados centígrados, volúmenes cavitación Chichantako'ob jach ma' calientan considerablemente le tuukula'. Le ultrasonido genera le cavitación acústica yéetel le muuk' corte perforan wa rompen u membrana le célula e. coli – dependiendo de u ajuste le dispositivo homogenizador ultrasónico.

Ventajas lisis ultrasónico

  • Kaambalil yo'osal preciso u lisis (intensidad, amplitud, temperatura).
  • óptima adaptación u muestras específicas
  • Kaambalil yo'osal u temperatura
  • utia'al muestras jach mejen u jach Nuuktak (μL ti' litros).
  • Ts'a'akal mecánico u Chen séen
  • escalado lineal tak laboratorio ti' le producción
Le dispositivo ultrasónico VialTweeter ku cha'antik wa u le muestra simultánea u tak 10 viales yáanal meyajo'ob condiciones tuukula' yilik. (Click utia'al agrandar!).

VialTweeter utia'al u lisis ultrasónico

Solicitud a'alajil t'aan




Yanak ti' tu yilaje' k Política yojeta'al mixba'al.


Ka' jo'op' u le lisis química yéetel enzymtic táan u béeytal u problemático – lisis químico táan u béeytal u alterar ka'ansaj proteínas ka ye'esa'al talamilo'ob purificación ka lisis enzimática k'a'abet k'iin incubación Óoxten yéetel ma' jach reproducible – disrupción ultrasónica jach jump'éel método interrupción ti' sofisticada, rápida ti' le célula.
Le lisis ultrasónica ku basa únicamente ti' mecánicas muuk'. Ma' u añaden sustancias químicas, le sonicación pa' le pak'o' t'aan tuméen muuk' cortantes. Le lisis química u alterar le ba'ax le proteínas yéetel introducir toop purificación. le interrupción enzimática k'a'abet chowaktako'ob k'iino'oba' incubación ka ma' jach reproducible.

Recomendaciones generales

UP400St ultrasonicador yéetel reactor flujoSonicación le tu láaka asab Seguro utia'al lisis yaan xan ya'abach jach mejen, k'as poloktak yéetel nukuch suspensiones celulares – u pico-litros tak 100 litros leti' p'isib (utilizando jump'éel celda flujo ultrasónico). Le células ku sometidas in lisis tumen cavitación yéetel esquileo líquido. ADN xan le k'oosik ichil le sonicación, bey u ma' k'a'abéet ts'áabal ADNasa ti' le suspensión células.
Kaambalil yo'osal u temperatura:
U ye'esik u prerefrigeración ka manteniendo le muestra ichil le sonicación ti' hielo, degradación térmica u muestra le muestra je'el Je'e bix u páajtale' u uchik.
Idealmente, le muestras k'a'abéet mantener ku heladas ichil le lisis, ba'ale' utia'al óol tuláakal le máasewáalo'obo' ti' le muestras suficiente wa le temperatura ma' u eleva por encima de u temperatura u le yéetel wa u fuente wa'ak'al. Tune' tu recomienda, utia'al u mantener le suspensión yóok'ol hielo yéetel utia'al sonicar yéetel ya'ab pulsos ultrasónicos Kóomtak 5-10 seg yéetel pausas 10-30 seg. Ichil le pausas, le u yooxol u disipar u utia'al restablecer jump'éel temperatura baja. Utia'al u muestras u células asab nukuch, ya'ab reactores celdas flujo yéetel chaquetas enfriamiento u disponibles.

U tsoolil bix utia'al wa u E. Coli lisados yilik

Análisis le expresión yéetel purificación proteínas recombinantes

Le pelotilla e. coli ku sonicó yéetel juntúul t.u.m ultrasonidos UP100H (Hielscher). Utia'al u beyo', precipitado u células u resuspendió ti' tampón u lisis frío (50 mM Tris-HCl u pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) yéetel enfriado tu hielo ichil 10 minutos. Ts'o'okole', bin sonicada suspensión t'aan yéetel 10 ráfagas cortas 10 Guatemala mina'an u yotocho'ob seguido tumen intervalo 30 Guatemala mina'an u yotocho'ob utia'al u refrigeración. Ba'axten último jaantik u células yáalab bin tseelik tumen ultracentrifugación 4° C ichil 15 min u 14000 rpm. Utia'al u ya'aliko'ob u expresión le rPR, le sobrenadante bin áalkab ti' gel poliacrilamida ti' le 12 ti chúumuk yéetel analizadas tumen SDS-PAGE yéetel Western blot. Purificación le rPR bin meentik usando mix2 +Resina - NTA (Invitrogen, USA) bin le náakake' u yaak'il ti' le fabricante. Ku utilizó le método purificación ku yúuchul ti' le p'isibij, Pureza le proteína purificada bin evaluada yo'osal electroforesis ti' gel u poliacrilamida le 12 ti chúumuk yéetel posterior tinción azul Coomassie. Concentración le proteína purificada bin u medida tuméen kit ensayo proteína Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et el. 2016).

Disruptor t'aan ultrasónico UP100H (100W) tumen lisis, alteración le célula yéetel ADN corte.

Homogeneizador ultrasónico UP100H (100W).

Tuméen le célula, reticulación yéetel wa u extractos células e. coli yilik

Utia'al u coli SeqA yéetel E. u viruta RNA polimerasa MG1655 wa MG1655 ΔseqA bin asab ya'abtal, u 37° C ti' jump'éel OD600 u tu yo'olal 0.15 ti' 50 ml LB (+ 0.2 ti chúumuk glucosa) bey ma' 27 μl formaldehído (37 ti chúumuk) por medio de ml ku agregaron (concentración final 1 ti chúumuk). Entrecruzamiento u beetajo' ti' agitación chaanbelil (100 rpm) u temperatura ambiente ti' 20 min, seguido u Temple yéetel 10 ml glicina 2,5 M (concentración final u 0,5 M). Utia'al u experimentos choque térmico, e. coli MG1655 bin crecida tu k'as 65 ml LB 30° C ti' jump'éel OD600 u yan 0.3. Posteriormente 30 ml miatsil bin transferido ti' jump'éel matraz áantaj calentada u 43° C yéetel u yala'ab 30° kuxtal Reticulación ka amortiguamiento úuchik u describió ka'achij, excepto ti' le células ku mantuvieron u 30 wa 43 ° C ichil 5 minutos bey ma' asab chaanbelil agitación u temperatura ambiente. Le células bino'ob recogidas tumen centrifugación ka lavadas ka'atéen yéetel ke'el TBS (pH7.5). Ts'o'okole' ka resuspension ti' 1 ml tampón lisis (10 mM Tris (pH 8.0), 20 ti chúumuk sacarosa, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, lisozima u 10 mg leti' ml) yéetel le incubación 37° C ti' 30 min ku seguido tumen le adición 4 ml buffer IP, le células bino'ob sonicadas yo'osal hielo yéetel 12 Óoxten 30 seg yéetel 30 seg pausas ti' jump'éel UP400St procesador ultrasonidos (Hielscher Ultrasonics GmbH) yéetel 100 ti chúumuk potencia. Ka' ts'o'ok u centrifugación ichil 10 minutos u 9000 g 800 aliquotes μl le sobrenadante bino'ob almacenadas u-20 ° kuxtal (Waldminghaus 2010).

Sobreproducción ka purificación enzimas.

Tumen sobreproducción decahistidine (His10) - yéetel le etiqueta proteínas, e. coli BL21 (DE3) ku transformó yéetel construcciones pET19b. Junp'éel áak'abe' planas bin u cosechado tumen centrifugación, yéetel le 1 ti chúumuk utilizó utia'al u inocular jump'éel miatsil expresión. Le células ku pET19mgtB bino'ob cultivadas u 22° C tak jump'éel densidad óptica ti' 600 nm (OD600) u 0,7. Le yéetel bin trasladado 17° C yéetel inducido tumen IPTG 100 μM. Ka' 16 h, le yéetel j-cosechado tumen centrifugación 7.500 × g 4 ° kuxtal Le células ku resuspendió tu solución salina 50 mM yéetel tampón fosfato (PBS) yéetel 0,3 M NaCl u pH 7.4 yéetel perturbadas tumen ultrasonidos yéetel juntúul sonda xnuk S2 ti' le UP200St ultrasonicador (Hielscher, Teltow, Alemania) ti' jump'éel ciclo 0.5 yéetel juntúul amplitud 75 ti chúumuk.
Le sobreproducción decahistidine tagged GtfC bin u inducida u 37° C ti' jump'éel OD600 u 0,6 yéetel 100 μM IPTG. Le células bino'ob túun incubadas ichil 4 h jooch yéetel lisis bix u indicó ka'achij utia'al MgtB.
Extractos celulares u crudo u centrifugaron u 15.000 × g yéetel 4° C u sedimentos le jaantik yáalab celulares. Le extractos clarificados bino'ob cargados ti' le columnas HisTrap FF crudo 1 ml usando juntúul t.u.m ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Le enzimas ku purificaron bin protocolo le fabricante utia'al u elución gradiente proteínas u etiquetado. Soluciones proteínas eluídas ku dializaron ka'atéen xu'ullsa'al 1.000 volúmenes 50 mM PBS, pH 7,4, yéetel 0,3 M u NaCl u 4° kuxtal Le purificación ku analizó 12 ti chúumuk SDS-PAGE. Le concentración proteína determinó tumen le método Bradford meyajtiko'ob Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania). (Rabausch et el., 2013).

Extracción proteínas le Bacteria e. coli
Juntúul proteína cebo le k'ana'an ju'uno'ob (tu este caso, MTV1 u Arabidopsis thaliana) fundida jump'éel etiqueta GST yéetel expresada ti' células BL21 Escherichia coli (e. coli).
1 yuk'ej jump'éel pelotilla GST-MTV1 yéetel GST (correspondiente u yéetel bacteriano 50 ml) yéetel resuspender ti' tampón extracción te' ke'el hielo 2,5 mL.
2 meyaj juntúul ultrasonicador UP100H (equipado yéetel micropunta MS3-sonda utia'al volúmenes mejen (2-5 mL)) utia'al jaatik le células bacterianas tak lisis, u jach indicada tumen le opacidad reducida yéetel aumento le viscosidad. Le je'ela' yaan u bisik u ka'ansaj ti' le hielo yéetel u recomienda someter ultrasonidos ti' intervalos (je'ebix 10 seg sonicando seguido tumen 10 seg ti' le hielo yéetel bey sucesivamente). Bik k'a'ana'an yaantal u ma' someter ultrasonidos jach ka'anal intensidad. Wa u detecta le formación espuma wa u formación jump'éel precipitado sak, le intensidad k'a'ana'an xu'ulsiko'ob u.
3 transferir u solución le bacterias sometidas lisis tubos u microcentrífuga u 1.5 mL yéetel centrifugar 4 ° C, 16.000 x g tumen 20 min.

Proteínas modificadas u alicina ti' e. coli

Le VialTweeter jach jump'éel yanen ultrasonicador utia'al homogeneización mejen muestrasDeterminación contenido sulfidrilo tumen 5 ti', 5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) ensayo
Jump'éel miatsil áak'ab u sáamal MG1655 e. coli u utilizó utia'al inocular chúumuk mínimo fregonas (1: 100). Miaatsil bin cultivada aeróbicamente tak jump'éel A600 0.4. Miaatsil u tu jatsaj ti' óoxp'éel culturas 15 ml utia'al u Ts'a'akal le estrés. Jump'éel miatsil ma' tratada k'a'ana'an bey kaambalil yo'osal negativo. alicina 0,79 mM (128 μg ml).-1) wa 1 mM diamida bin u agregado juntúul le restantes ka'atúul culturas jujuntúulal. Culturas incubaron tumen 15 minutos 5 ml u Amal yéetel ku cosecharon tumen centrifugación (8.525 × g, 4° C, 10 minutos). Le células bino'ob u lavadas ka'atéen yéetel 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2Ip.4, 2 mM KH2Po4pH 7,4, almacenada anaeróbicamente bey ma' biilankiltej) yéetel centrifugado (13.000 x g, 4 ° C, 10 minutos). Le células ku resuspendió tu buffer lisis (PBS yéetel Guanidinio 6 mM HCl ti', pH 7,4) bey ma' u interrupción u 4 ° C tumen ultrasonidos ()VialTweeter (ultrasonicador ti', Hielscher GmbH, Alemania) (3 × 1 min). Jaantik u células yáalab bin u peleteado tumen centrifugación (13.000 x g ti', 4 ° C, 15 min). Le sobrenadante bin transferido jump'éel ch'óoy QS-macro 3,5 ml (10 mm) yéetel juntúul barra u agitación magnética yéetel mezclado yéetel 1 ml tampón lisis. Extinción le muestras j-monitoreado u 412 nm yéetel juntúul espectrofotómetro Jasco V-650 equipado yéetel le bix kaambalil yo'osal u temperatura le célula PSC-718 (Jasco) tu temperatura ambiente. U agregaron 100μl solución 3 mM Ditiobis (2-nitrobenzoico ácido). Extinción bin u monitoreada tak k'uchul le saturación. Cálculo le concentración tiol beetajo' yo'osal u ε le coeficiente extinción412 = M 13.700-1 Cm-1 TiO-2-nitrobenzoico ácido (TNB). Le concentraciones tioles celulares calculan ju'unilo'ob jump'éel volumen células e. coli 6,7 × 10-15 litros yéetel juntúul densidad t'aan u le u600 = 0.5 (equivalente u 1 × 108 ml células-1 miatsil). (Müller et el. 2016).

Ti' le determinación glutatión Vivo

E coli MG1655 bin u crecida te' chúumuk mínimo fregonas ti' jump'éel volumen total u 200 ml tak jump'éel600 u 0,5 u ts'o'ok u chukik. Miaatsil u tu jatsaj ti' 50 ml culturas utia'al u Ts'a'akal le estrés. Ka' 15 min incubación yéetel alicina 0,79 mM, 1 mM diamida wa dimetilsulfóxido (kanik), le células ku cosecharon u 4.000 g ti' 4 ° C ichil 10 minutos le células ku p'o'ob ka'atéen yéetel tampón KPE bey ma' resuspensión pellets ti' 700μl buffer KPE. Utia'al deproteination, 300l ácido sulfosalicílico 10 ti chúumuk (p/v) ku agregaron bey ma' u interrupción le células tumen ultrasonidos (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicador). Sobrenadantes bino'ob u recogidos ka' u centrifugación (30 min, 13, 000 g, 4 ° C). Concentraciones ácido sulfosalicílico disminuyeron 1 ti chúumuk yo'osal le adición 3 volúmenes tampón KPE. U tu mentajo'ob mediciones u glutatión total yéetel GSSG bix u describió ka'achij. Le concentraciones glutatión t'aan calculan ju'unilo'ob jump'éel volumen células e. coli 6.7×10-15 litros yéetel juntúul densidad t'aan u le u600 0(equivalente u 1.5×108 ml células-1 miatsil). Ku calcularon le concentraciones u GSH tumen le substracción 2 [GSSG] u glutatión total. (Müller et el. 2016).

Disruptor ultrasónico u lisis t'aan yéetel extracción xooko'obo' biológico (Click utia'al agrandar!).

Ultrasonicador bin yano'ob sonda UP400St

Expresión mAspAT humana ti' e. coli

Disruptor t'aan ultrasónico UP400St (400W) utia'al u extracción le yo'olal intracelular (proteínas, organelos, DNA, RNA etcetera.).Le chen colonia E. coli BL21 (DE3) albergando le expresión vector ti' 30 mL ampicilina 100μg leti' mL yéetel chúumuk Luria-Bertani (LB) yéetel ku cultivadas 37 ° c tak le densidad óptica (OD600) ts'o'ok u chukik 0.6. Le células bino'ob cosechadas tumen centrifugación in 4.000 x g ichil 10 minutos ka resuspendió ti' 3L ts'o'onota' LB chúumuk u ku taasik ampicilina 100μg leti' mL.
Posteriormente, u expresión le proteína ku indujo yéetel 1 mM isopropílico β-ᴅ-1-tiogalactopiranósido (IPTG) utia'al h 20 u 16 ° kuxtal Le células ku cosecharon tumen centrifugación 8.000 × g tumen 15 min yéetel p'o'ob yéetel tampón (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7.4). U obtuvieron células aproximada 45g (peso húmedo) u miatsil 3 L. Ka' ts'o'ok u centrifugación le pellets células ku resuspendió tu buffer extracción helada 40 mL (utia'al u miatsil 1 L) U yéetel lisada tumen ultrasonidos ti' le helada temperatura utilizando jump'éel UP400St instrumento (tumen Dr Hielscher GmbH, Alemania). Le lisis t'aan centrifugó u 12.000 rpm ichil 15 min u soluble separa (sobrenadante) yéetel fracciones precipitado (pellet). (Jiang et el., 2015).

Le uláak' tabla ku ts'aik ti' jump'éel indicación le Buka'aj u ba'al u procesamiento u aproximado k ultrasonicators:

Volumen lote Tasa flujo Dispositivos recomendados
0.5 u 1.5mL N.a. VialTweeter
1 u 500mL 10 200 mL leti' min UP100H
10 u 2000mL 20 400 mL leti' min. UP200Ht, UP400St
0.1 ti' 20L 0.2 u 4 L leti' min UIP2000hdT
10 ti' 100L 2 10 L leti' min UIP4000
N.a. 10 100 L leti' min UIP16000
N.a. asab nojoch Cluster u UIP16000

Ti' máax ku yéetel to'on! Leti' k'áatiko'ob k!

Béet meyaj le uláak' formulario, wa k'áato' solicitar a'alajil t'aan adicional yo'osal homogeneización ultrasónica. Yaan k encantados u ofrecer juntúul t.u.m ultrasónico u satisfacer le requerimientos.









Yanak ti' tu yilaje' k Política yojeta'al mixba'al.


Literatura leti' referencias



Hechos u tojol le su'utalil K'ajóolt

E coli

Escherichia coli (e. coli) leti' jump'éel bacteria gram negativa, facultativamente anaerobia, ti' bix u barra ti', coliforme le género Escherichia Kula'an comúnmente ti' le intestino asab t'okik u le áantajilo'ob k'i'ik'el chokoj (le endotherms). Yaan jump'éel nojoch meyaj ku u cepas u e coli (wa subtipos) yéetel kúuchilo'ob ba'alo'ob. Mayoría le cepas e. coli jach inofensiva ti' le seres humanos, e.g. B yéetel k'uj-12 cepas ba'ax ku utilizan comúnmente utia'al u aplicaciones ti' laboratorios investigación. Ba'ale' Jayp'éel cepas ku perjudiciales ka páajtal u causar k'aak'aas.
E coli ku báaxal jump'éel ju'un Páaybe'en ti' le moderna ingeniería biológica yéetel Microbiología industrial tak le bacterias ch'a'abil u manipular. Laboratorio aplicaciones náats'al ku implican tu menudo u búukinta'al e. coli, je'ebix, ch'a'iko'ob ácido desoxirribonucleico recombinante (ADN) wa utia'al kan bey juntúul organismo modelo.
E coli le jump'éel huésped jach versátil utia'al u producción proteínas heterólogas, ka sistemas expresión proteínas ya'ab k'oja'ano'ob táan disponibles utia'al u producción proteínas recombinantes te' e. coli. Utilizando plásmidos u permiten le expresión nivel ka'anal u proteína, genes páajtal introducir u ti' le bacterias, ku Cha' producir tales proteínas ti' yaan xan ya'abach ti' procesos fermentación industrial.
E coli ku utilizan bey fábricas jump'éel célula u producir insulina. Uláak' aplicaciones incluyen u búukinta'al células e. coli juubulo'ob yo'osal j yéetel producir vacunas yéetel inmovilizadas, enzimas utia'al u producir biocombustibles, bey je'el bix ti' le biorremediación.
Le cepa k'uj-12 le jump'éel bix mutante e. coli u yóok'ol-expresa le enzima fosfatasa alcalina (ALP). Le mutación ku yaantal debido a jump'éel defecto ti' le gen codifica utia'al u enzima constantemente. Wa jump'éel gen u yaantal jump'éel producto mina'an mix jump'éel inhibición ku leti'e', k'ajolo'on bey actividad constitutiva. Beyo' mutante específica ku meyajtiko'ob yo'osal aislar yéetel purificar le enzima fosfatasa alcalina.

Ultrasónico ADN corte

Le muuk' corte ultrasónico táan jump'éel método comúnmente utilizado utia'al u separar ti' le célula yéetel filamentos le DNA romperá ti' ts'iit. Cavitación acústica pa' le pak' celulares ka membranas utia'al u extraer ADN le células yéetel generar fragmentos tu naats'il u 600 – 800 bp u longitud, ba'ax le beetike' uts utia'al u análisis.
Beetik clic waye' tia'al a wojeltik yóok'ol homogeneizadores ultrasónicos u fragmentación le ADN!