Lisis ultrasónica utia'al u Western Blotting

• Le western blot jach jump'éel procedimiento analítico utia'al u detección proteínas específicas ti' jump'éel muestra homogeneizado ti' wa'ak'al wa extracto t'aan.
• Utia'al ejecutar jump'éel Western blot wa utia'al P'iis le actividad enzimática, ya'ab ensayos requieren muuk' le materiales (je'ebix, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) atrapados ti' le célula.
• Le sonicación jach jump'éel método fiable yéetel ch'a'abil u manejar yo'osal le disrupción yéetel lisis t'aan controlada.

Disrupción t'aan ultrasónica

Le extracción proteínas jach yéetel células cultivadas u ti'al le yáax paso ya'ab yo'osal biológicas, bioquímicas yéetel analíticas (PAGE, Western blot, ELISA, espectrometría masas, etcétera) wa utia'al u purificación proteínas. Tia'al jump'éel ka'anal rendimiento proteico, le xooko'obo' t'aan yéetel u wa'ak'al k'a'abéet u alterados leti' lisados u bix ken eficiente. Seen wa lela' células vegetales bix u jach animales, u sonicación u ti'al le método mentik le lisado nu'ukul-t'aan bix u ch'a'abil ka rápida.

Ventajas le sonicación

• Séeba'an & Xoknáalo'obo'
• Chéen ch'a'abil operación
• Ka'anal rendimiento proteico
• Reproducible leti' Repetible
• Controlado yéetel precisión
• escalable

Protocolo u inmunoprecipitación utia'al u inmunoblot occidental

U Reactivos

Utia'al u wa u le soluciones yilik, meyaj ja' purificada bey Milli-Q.

• 1 X solución salina tamponada yéetel fosfato (PBS).
• 1 tampón lisis t'aan: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ti', 1 mM EGTA, 1 ti chúumuk Triton X-100, 2,5 mM pirofosfato sodio, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg leti' ml u leupeptina
  Páaybe'en: Agregue 1 mM PMSF inmediatamente bey ma' biilankiltej.
• 15 μl proteína A+15 μl proteína G le kuxlaken utia'al u IP, ba'ale' je'el depender ti' le anticuerpo primario yéetel u volumen le muestra. Bey xan u utilizar proteína ti' leti' G agarosa premezclada (je'ebix, proteína u utia'al u reducción u IgG u t'u'ul yéetel proteína G utia'al u reducción le IgG ch'o').
• Tampón muestra 3 X SDS: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 u 25 ° C), 6 ti chúumuk yéetel SDS, 30 ti chúumuk glicerol, 150 mM DTT, 0,03 ti chúumuk yéetel azul bromofenol

B. wa u lisados celulares yilik

• Jooch le células. Utia'al u recolectar células ti' condiciones ma' desnaturalizantes, retire le medios yéetel enjuague le celdas juntéene' yéetel PBS síis.
• Retire le PBS yéetel añada 0,5 ml tampón lisis t'aan 1 X síis u Amal placa (10 cm) yéetel incube le placas ti' hielo ichil 5 minutos.
• Raspe le células le placas yéetel transfiéralas ti' le tubos microcentrífuga. Mantener te' hielo.
• Sonicar ka'atéen ichil 10 segundos ti' tampón inmunoprecipitación síis (tampón IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl ti', 5 mM EDTA, 0,1 ti chúumuk NP-40 yéetel le mezcla inhibidores ti' le proteasa). En el caso de le sonicación, le VialTweeter wa jump'éel ultrasonido sonda, bey le UP100H o UP200Ht le le asab adecuados.
• Centrifugar le lisados u 15.000 g ichil 10 minutos u 4 ° kuxtal
• Transfiera le sobrenadante ti' jump'éel tubo túumben. (Wa k'a'abéet, le lisado ku páajtal almacenar ti–80 ° C).
• Agregue le anticuerpo primario ti' le sobrenadante. Le sobrenadante yéetel le anticuerpo primario ku incuba ichil 1 h ti' 4 ° C yáanal jump'éel ligera agitación. Ba'axten lo general, anticuerpo primario ku agrega ti' jump'éel cantidad 10 Óoxten asab concentrada u u le ba'ax ku meyaj utia'al u western blot. (Je'el comenzar yéetel 1 μg tumen 100 μL).
• Tu continuación le sobrenadante ku incuba láayli' asab yéetel le mezcla yaan xan ya'abach iguales u proteína U-agarosa (Invitrogen) yéetel proteína G agarosa ti' 1 h asab.
• P'o'ik le gránulos agarosa Óoxten yéetel tampón IP. Tu continuación extraiga le proteínas unidas yéetel le tampón kuuch SDS-PAGE chokojtal le u 95 ° C ichil 5 minutos.

Kuxtal Inmunoprecipitación

• Ch'aik 200 μl lisado t'aan ka añadir le anticuerpo primario. Incubar yéetel jump'éel O'olkij balanceo ichil áak'abe' u 4 ° kuxtal
• Añadir perlas agarosa proteína u wa G (20 μl purín ti' le 50 ti chúumuk perlas). Incubar yéetel juntúul balanceo O'olkij ichil 1-3 horas ti' 4 ° kuxtal
• Microcentrífuga ti' 30 segundos u 4 ° kuxtal P'o'ik le pellet jo'op'éel Óoxten yéetel 500 μl tampón lisis t'aan 1 X. Manténgalo tu hielo ichil le lavados.
• Sut suspender gránulo yéetel tampón muestra 3 X SDS ti' 20 μl. Vórtice, ku microcentrífuga ti' 30 segundos.
• K'íintik le muestra 95-100 ° C ichil 2-5 minutos yéetel microcentrifugar ichil 1 minuto ti' 14.000 X g.
• Cargue le muestra (15-30 μl) ti' le gel SDS-PAGE (12-15 ti chúumuk).
• Analice le muestra tumen Western blot.

Análisis u Western Blot yéetel sonicator UP50H

Ti' le xooko' Kriebisch et ti' le. (2011) ku utilizó le uláak' protocolo utilizando le sonicador bin yano'ob sonda UP50H:
Le proteína total aisló ti' le células MC3T3-E1 tratadas yéetel 1,25 (Jay).₂D₃ (10⁻⁸ M) wa vehículo. Le células lisaron yéetel jump'éel tampón ku contenía 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1 ti chúumuk dodecil sulfato sodio (SDS) (Fisher Scientific); IGEPAL CA-630 ti' le 1 ti chúumuk (Sigma-Aldrich) yéetel desoxicolato sodio ti' le 0,5 ti chúumuk (Merck). Le lisado t'aan ku sonicó ichil 2 × 10 Guatemala mina'an u yotocho'ob ti' le ciclo 1 yéetel juntúul amplitud 80 yéetel le Procesador ultrasónico UP50H (Hielscher, ma'alo'obtal u ultrasonidos, Teltow, Alemania). Ichil túun, le centrifugó ichil 10 minutos u 14.000 rpm yéetel le sobrenadante ku utilizó utia'al u transferencia occidental. Veinticinco μg proteína ku hirvieron tu tampón muestra yéetel aj nu'uktaj reductor (Invitrogen) yéetel posteriormente ku separaron yo'osal SDS-PAGE utilizando geles poliacrilamida ti' le 4-12 ti chúumuk (Invitrogen) yéetel ku transfirieron ti' jump'éel membrana nitrocelulosa (GE health care). Le membrana bloqueó ti' 1 h yéetel TBS (10 mM u Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) ku contenía 1 ti chúumuk caseína (Sigma-Aldrich) yéetel 1 ti chúumuk Tris (1 M). Ka' ts'o'ok u bloqueo, le membrana ku incubó yéetel juntúul ligera agitación ti' le áak'aba' yaan 4 ° C yéetel le anticuerpo primario (t'u'ul antihumano CBS 1 leti' 500, desarrollado ti' le laboratorio le Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, EE. UU.). Le incubación yéetel juntúul anticuerpo secundario conjugado (Dako) yéetel peroxidasa rábano páapo' (HPR) ku beetajo' ichil 1 h u temperatura ambiente. Le blots ku desarrollaron yo'osal quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer).
 

Beetik clic waye' yo'osal xook asab yóok'ol le ti' tu'ux yo'osal le lisis yéetel extracción t'aan tuméen ultrasonidos, wa u le lisado yilik yéetel le recomendaciones yo'osal u ma'alo'obkíinsiko'ob le procesos.
 
Le uláak' tabla ku ts'aik ti' jump'éel indicación le Buka'aj u ba'al u procesamiento aproximada u k ultrasonidos Buka'aj laboratorio:

Bibliografía leti' Referencias