Ma'alo'obtal u ultrasonido Hielscher

Lisis u ultrasonidos utia'al u Western Blotting

  • Le western blot jach jump'éel procedimiento analítico utia'al u detección proteínas específicas ti' jump'éel muestra u wa'ak'al homogeneizado wa extracto le célula.
  • U jump'éel Western blot wa utia'al P'iis le actividad enzimática, ya'ab ensayos requieren muuk' le materiales (je'ebix, fragmentos u proteínas, ADN, u subcelular) atrapados ti' le celda.
  • Sonicación jach jump'éel método fiable yéetel ch'a'abil u manejar utia'al u interrupción controlada nu'ukul-t'aan yéetel lisis.

Interrupción le célula ultrasónica

Extracción proteínas le jach yéetel células cultivadas jach le yáax paso utia'al ya'ab yo'osal biológicas, bioquímicas yéetel analíticas (PAGE, Western Blot, ELISA, espectrometría ti' masas, etc.) wa purificación proteínas. Tia'al jump'éel rendimiento ka'anal ku proteico, le xooko'obo' le célula yéetel u wa'ak'al k'a'abéet eficientemente interrumpidos leti' lisis. Wa le chan tejido nu'ukul-t'aan wa ba'alche' sonicación leti' le método utia'al u mentik a lisado nu'ukul-t'aan ch'a'abil yéetel séeba'an.

Ventajas le sonicación

  • Séeb & eficiente
  • Chéen ch'a'abil operación
  • producción ka'anal ku proteico
  • repetible leti' reproducibles
  • exacto controlada
  • escalable

Protocolo le inmunoprecipitación Immunoblotting occidental

U reactivos

Utia'al u wa u yilik le soluciones, meyaj ja' purificada bey Milli-Q.

  • 1 x fosfato tampón salino (PBS).
  • 1 x tampón lisis t'aan: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 ti chúumuk Tritón X-100, pirofosfato sodio 2,5 mM, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4 ti', 1 μg leti' ml Leupeptin
    Páaybe'en: Añadir 1 mM PMSF inmediatamente bey ma' biilankiltej.
  • 15 μl proteína U + G proteína 15 μl le suficiente utia'al u IP, ba'ale' je'el depender ti' u anticuerpo primario yéetel volumen le muestra. Bey xan u páajtal utilizar proteína premezclada ti' leti' G u agarosa (p'el. ej. proteína u utia'al t'u'ulo' IgG puli' tak kaambal) yéetel G proteína ch'o' IgG desplegable
  • 3 x SDS tampón: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6.8 u 25 ° C), 6 ti chúumuk w/v SDS, 30 ti chúumuk glicerol ti', 150 mM DTT, 0.03 ti chúumuk w/v ch'ooj u bromofenol
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter utia'al ultrasónica wa u yilik le muestra

Ti' máax ku yéetel to'on! Leti' k'áatiko'ob k!





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Sonicación le jump'éel paso k'a'abéet ti' wa u le muestra yilik

UP200St yéetel xnuk utia'al u sonicación le muestra

B. wa u yilik Lysates le célula

  • Jooch le células. Utia'al u jooch le células yáanal condiciones nondenaturing, tselik le medios comunicación yéetel enjuague le células juntéene' yéetel PBS síis.
  • Luk'ul Teeche' PBS yéetel añadir 0.5 ml síis 1 X tampón lisis u célula u Amal lako' (10 cm) yéetel Incube le placas ku hielo ichil 5 minutos.
  • Ts'o'ok le células le placas yéetel transferir tubos u microcentrífuga. Mantener te' hielo.
  • Someter u ultrasonidos ka'atéen ichil 10 segundos ti' almacenador intermediario le inmunoprecipitación helada (buffer IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl ti', 5 mM EDTA, 0.1 ti chúumuk NP-40 yéetel le combinación inhibidor ti' le proteasa). U sonicación, le VialTweeter wa jump'éel ultrasonicador sonda tales bey le UP100H o UP200Ht le le asab adecuados.
  • Centrifugue le lisados u 15.000 g ichil 10 minutos u 4° kuxtal
  • Transferir le sobrenadante ti' jump'éel túumben tubo. (Wa k'a'abéet, lisado u almacenar u u - 80 ° kuxtal).
  • Añadir le anticuerpo primario ti' le sobrenadante. Le sobrenadante yéetel le anticuerpo primario ku incuba ichil 1 h ti' 4° C yáanal agitación ligera. Anticuerpo primario u agrega típicamente ti' jump'éel cantidad 10 x asab concentrado ba'ax ku meyajtiko'ob utia'al u borrar occidental. (Je'el káajsik yéetel 1μg tumen 100μL).
  • Le sobrenadante ku incuba tu láak' yéetel le mezcla iguales yaan xan ya'abach proteína U-agarosa (Invitrogen) yéetel agarosa G proteínas tumen uláak' 1 h.
  • P'o'ik le pelotillas u agarosa Óoxten yéetel tampón IP. Ts'o'okole', extraiga le proteínas enlazadas yéetel le tampón kuuch SDS-PAGE tumen calentamiento 95° C ichil 5 minutos.

Kuxtal inmunoprecipitación ti'

  • 200 células μl lisado yéetel añadir anticuerpo primario. Incubar yéetel susulkij balanceo ti' le áak'aba' yaan 4° kuxtal
  • Ku ts'áabal proteína u wa G perlas ti' agarosa (20 μl ti' le mezcla 50 ti chúumuk le grano). Incubar yéetel susulkij balanceo utia'al 1 - 3 horas u 4° kuxtal
  • Microcentrífuga ti' 30 segundos u 4° kuxtal P'o' le pellet jo'op'éel Óoxten yéetel 500 μl tampón lisis célula X 1. Mantener tu hielo ichil le p'o'o'.
  • Resuspender le precipitado yéetel 20 μl 3 tampón SDS X. Vórtice, túun microcentrífuga ti' 30 segundos.
  • K'íintik u ye'esik u 95 ti'-100° C 2 - 5 minutos yéetel microcentrífuga ichil 1 minuto ti' 14.000 X g.
  • Kuuch le muestra (15-30 μl) tu gel SDS-PAGE (12-15 ti chúumuk).
  • Análisis ti' le muestra tumen borrar occidental.

Máax ku leti' solicitar a wojeltik

T'aan yéetel to'on yóok'ol u kajtalo'ob ichil u procesamiento. Recomendamos le parámetros configuración yéetel u le tuukula' asab adecuados utia'al u tsol.





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Asab tsoolil bix u sonicación

Análisis u Western Blot yéetel ultrasonicador UP50H

Siguiendo le protocolo bin utilizado ti' le xooko' Kriebisch et el., (2011):
Proteína total bin u aislada u células MC3T3-E1 tratadas yéetel 1,25 (JAY).2MULIX3 (10N.o 8 M) wa vehículo. Le células bino'ob u sometidas u lisis yéetel juntúul tampón ba'ax ku taasik u 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1 ti chúumuk sodio dodecil sulfato (SDS) (Fisher Scientific); 1 ti chúumuk IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) yéetel desoxicolato sodio 0.5 ti chúumuk (Merck). Le lisado nu'ukul-t'aan bin sonicada 2 × 10 Guatemala mina'an u yotocho'ob ti' le ciclo 1 yéetel amplitud 80 yéetel le Procesador ultrasónico UP50H (Hielscher, ma'alo'obtal u ultrasonido ti', Teltow, Alemania). Ka' lelo' le ku centrifugó ichil 10 minutos u 14.000 rpm yéetel le sobrenadante utilizó utia'al u Western blot. 25 μg proteína bin hervido ti' solución tampón muestra yéetel le aj nu'uktaj reducción (Invitrogen) yéetel posteriormente separado tumen SDS-PAGE utilizando geles poliacrilamida 4-12 ti chúumuk (Invitrogen) yéetel transferido jump'éel membrana nitrocelulosa (óolal toj GE). Le membrana bin u bloqueada ichil 1 h yéetel TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7.6; 150 mM NaCl) ku contenga 1 ti chúumuk caseína (Sigma-Aldrich) yéetel 1 ti chúumuk Tris (1 M). Ka' bloqueo, le membrana ku incubó yéetel ligera agitación ti' le áak'aba' yaan 4 ° C yéetel anticuerpo primario (t'u'ulo' anti-humano CBS 1 leti' 500, desarrollado ti' le laboratorio le Prof. R. Banerjee, Ann Arbor,, USA). Incubación yéetel juntúul peroxidasa rábano (HPR) - anticuerpo secundario conjugado (Dako) ku beetajo' ichil 1 h u temperatura ambiente. Lacras tuláakal bino'ob u desarrollados tumen quimioluminescencia realzada (Perkin Elmer).

Literatura leti' referencias



Tu yo'olal Western Blotting

Borrones le procedimientos analíticos tu'ux DNA, RNA yéetel proteínas ku transferidas ti' jump'éel portador je'el u páajtal u separar.
Le Southern blot ku meyajtiko'ob utia'al u detección ADN ti', le Northern blot ti' le ARN yéetel le Western blot utia'al u proteínas.
Le borrar occidental xan u k'aaba' proteína immunoblotting tumen juntúul anticuerpo meyajtiko'ob utia'al detectar específicamente u antígeno. Western Blotting u ti'al juntúul le asab importantes métodos análisis detectar proteínas específicas ti' le muestra. Ti' le Western blot, u inmovilizan le proteínas ti' le membranas utia'al u detección yo'osal anticuerpos monoclonales wa policlonales.
Gel u SDS-poliacrilamida proteínas nativas ti' electroforesis (SDS-PAGE) u p'atikuba'ob yo'olal le ba'ax 3-Mulix wa desnaturalizan le proteínas tumen le longitud ti' le polipéptido. Le proteínas transfieren jump'éel membrana (normalmente nitrocelulosa wa PVDF), tu'ux leti'ob ku tiñen yéetel anticuerpos específicos ti' le proteína diana. Le paso electroforesis gel u incluido ti' le análisis western blot utia'al u resolver le talamilo' le reactividad cruzada ti' anticuerpos.
Ts'o'okole', le proteínas separadas ku borradas ti' jump'éel matriz (sobre todo ti' jump'éel nitrocelulosa wa PVDF membrana), ba'ax ku tiñen yéetel anticuerpos. Le anticuerpos funcionan bey juntúul xnuk prueba yéetel u seleccionan específicamente ti' le proteína diana. Le análisis le localización yéetel le intensidad reacción específica revela detalles u expresión le proteínas le sak u muestra. Le borrar occidental je'el detectar proteína diana jach uts baja bey 1ng debido a le ka'anal resolución u electroforesis le gel yéetel le k'a'am especificidad yéetel ka'anal sensibilidad le inmunoensayo. Le método Western blot ku meyajtiko'ob ti' uláak' sikte u investigación molecular, inmunogenética, biología molecular yéetel bioquímica.
Uláak' yo'osal relacionadas, bey análisis dot blot, inmunohistoquímica yéetel immunocytochemistry tu'ux anticuerpos le utilizados utia'al u detectar proteínas te' jach ka células tumen inmunotinción ka análisis enzima-ligado ti' le inmunosorbente (ELISA).