Cizallamiento ultrasónico ti' le ADN

Ichil le cizallamiento ADN yéetel ARN, le moléculas chowak u ADN u fragmentan ti' trozos asab mejen, jump'éel paso crucial te' wa u muestras utia'al u construcción bibliotecas secuenciación láak' "semana" generación (NGS) yilik. Le cizallamiento ultrasónico ti' le ADN emplea muuk' cavitación acústica utia'al jaatik le ADN wa ARN te' fragmentos ku bino'ob tak 100 pb tak 5 kb. Le método ku cha'antik jump'éel kaambalil yo'osal preciso yóok'ol le Buka'aj le fragmentos, ku facilita le personalización ti' le longitud ADN deseada tia'al ya'ala'al máaxo'ob máano'ob óptimos secuenciación.

Cizallamiento le ADN yo'osal ultrasonidos

Hielscher Ultrasonics k'u'ubul ya'abkach soluciones ku basadas tu ultrasonidos utia'al u cizallamiento ADN, ARN yéetel cromatina. Elija ichil jump'éel ultrasonido bin yano'ob sonda (je'ebix, UP100H) utia'al u sonicación directa yo'osal jump'éel microtip, wa meyaj le VialTweeeter wa u cuphorn ultrasónico utia'al u indirecta wa u yilik ADN ya'abkach muestras simultáneamente. Hielscher k'u'ubul le dispositivo beetike' uts teniendo tu yilaje' u kajtalo'ob ichil: ts'o'ok je'el ka yanak ti' 1 wa tak 10 muestras, volúmenes microlitros litros – Le sonicadores Hielscher cumplirán u requisitos utia'al u mentik fragmentos ADN, ARN yéetel cromatina yéetel le longitud úuchuk. Le reproducibilidad, le facilidad ch'a'iko'ob yéetel le kaambalil yo'osal preciso permiten disponer ti' jump'éel biblioteca fiable utia'al u secuenciación ts'ook generación.
U jela'anil in ti' le fragmentación enzimática ti' le ADN, le cizallamiento ultrasónico aplica muuk' cizallamiento mecánicas u láaj xma' añadir mix producto químico. Yo'osal le ajuste preciso ti' le parámetros le tuukula', le cizallamiento ultrasónico u yaantal fragmentos ADN ka'anal peso molecular (plásmido yéetel ADN genómico).
Le ácidos nucleicos purificados páajtal amplificar u ka'ache' wa ka' jump'éel p'isibij fragmentación.
Le parámetros sonicación (potencia, ciclo pulso leti' ráfagas, k'iin yéetel temperatura) ku páajtal controlar bix segura ti' le configuración le software.

U tsoolil bix utia'al u cizallamiento ultrasónico ti' le ADN

utia'al u ensayo inmunoprecipitación cromatina

Brevemente, le células ku colocaron tu placas 60 mm metros (400.000 tumen placa) yéetel ku transfectaron yéetel siRNA RhoA (bix u describe); Ka' 72 h, ku incubaron yéetel formaldehído (concentración final, 1 ti chúumuk). ichil 10 min u 37 ° C utia'al u entrecruzar le proteínas yéetel le ADN. Le reacción reticulación u tu tuupaj yo'osal le adición décima tu'ux le volumen glicina 1,25 mol leti' L, ba'ax tu ts'áaj jump'éel concentración final u 125 mmol leti' L. Le células p'o'ob ka'atéen yéetel PBS síis, ku resuspendieron ti' tampón ensayo radioinmunoprecipitación [150 mmol leti' L u NaCl, 1 ti chúumuk NP40, 0,5 ti chúumuk desoxicolato, 0,1 ti chúumuk SDS, 5 mmol leti' L u EDTA ti', 50 mmol leti' L u Tris-HCl (pH 8,0)] ku contenían 1 mmol leti' L u fluoruro fenilmetilsulfonilo, 1 Ag leti' mL aprotinina yéetel 1 Ag leti' mL u pepstatina U, ka u mantuvieron ti' hielo ti' 30 min. Tu continuación le lisados celulares ku sonicaron ti' hielo yéetel jump'éel Hielscher UP200S ultrasonido (3 x 40 Guatemala mina'an u yotocho'ob, amplitud 40 ti chúumuk, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) tak ka le cromatinas reticuladas Xo'ot utia'al producir fragmentos ti' ADN ichil 200 yéetel 1.000 pb. Ku utilizó décima tu'ux le lisado entero utia'al u cuantificar le cantidad ADN presente ti' jejeláas muestras yéetel u consideró bey “ADN total u yaan”. Le sobrenadantes ku incubaron yéetel esperma salmón yéetel ADN leti' proteína u agarosa-50 ti chúumuk suspensión utia'al u xu'ulsiko'ob u yiit inespecífico. Tu continuación le inmunoprecipitación ku beetajo' ichil áak'abe' u 4 ° C yéetel 5 Ag ti' anti-NF-nB p65 (Upstate) wa ma' anticuerpos (kaambalil yo'osal negativo). Le sobrenadantes ku suplementaron yéetel NaCl 5 mol leti' L yéetel ku calentaron ichil áak'abe' u 65 ° C utia'al u revertir le K'aanan cruzados proteína-ADN. Le inmunocomplejos ku trataron posteriormente yéetel proteinasa k'uj libre DNasa yéetel RNasa, yéetel le ADN purificó yo'osal extracción fenol leti' cloroformo yéetel precipitación etanol. Le PCR ku beetajo' yéetel cebadores específicos u tu yo'osal u jump'éel secuencia ichil le petenil promotora ti' le gen iNOS ch'íijsajil (cebador p1: 5¶-GAGGCTTTCCCA - GAACCAAG-3¶; cebador p2: GCTGGCTACTGACCAG - CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et ti' le., 2008).

Xook expresión EGFP

Utia'al u xook expresión, u cultivó le cepa recombinante L. tarentolae p10:: F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Alemania) yéetel le gen EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ssu cromosómica integrada, ti' le jejeláas medios descritos ka'achij yéetel adicionalmente ku suplementó yéetel 100 mg l^-1 Nourseotricina (Jena Bioscience, Alemania). Ichil le yéetel u tu ch'a'ob muestras 1 ml, u centrifugaron (2000 × g, 20 ° C, 10 min) yéetel p'o'ob yéetel juntúul solución u NaCl ti' le 0,9 ti chúumuk. Le pellet ku resuspendió ti' tampón (20 mM HEPES ti', 5 mM EDTA ti', 2 mM TDT) yéetel ku desintegró tumen sonificación yéetel le procesador ultrasónico UP400S (u kaambalil yo'osal energía ∼ 400 Ws). Le jaantik yáalab celulares eliminaron tumen centrifugación (6000 × g, 4 ° C, 5 min) yéetel ku analizaron yo'osal electroforesis tumen electroforesis ti' gel dodecilo sulfato sodio yéetel poliacrilamida (SDS-PAGE) tu condiciones reductoras bin u método u Laemmli (1970) yéetel geles poliacralamida ti' le 12,5 ti chúumuk. Ku examinó u expresión u EGFP ti' le miatsil agitada. (Fritsche et ti' le. 2007).

inmunoprecipitación cromatina

Le ensayo inmunoprecipitación cromatina beetajo' u utilizando le ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions with some modifications. Briefly, differentiated human podocytes were cross-linked with 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Cells were washed with ice-cold PBS and the fixation reaction was stopped by adding 0.125 M glycine for 5 min at room temperature. Cells were washed again with ice-cold PBS and scraped from the dish. Cells were pelleted by centrifugation and resuspended in the lysis buffer. After centrifugation, pelleted nuclei were resuspended in the shearing buffer, incubated on ice for 30 min and the chromatin was sheared by sonication, e.g. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemania) ti' le 25 ti chúumuk potencia 5 pulsos 20 segundos jujuntúulal yóok'ol hielo ti' fragmentos yan 200-600 pb. Tu continuación u centrifugaba le cromatina cortada yéetel u recogía le sobrenadante. Utia'al le inmunoprecipitaciones, ku incubaron 60 μl cromatina yéetel 1 μg anticuerpos Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) wa NF-κB p50 (Abcam) wa yéetel IgG t'u'ul (Zymed Laboratories), bey kaambalil yo'osal negativo, ichil áak'abe' u 4 ° C yéetel rotación O'olkij. Le inmunocomplejos unidos ti' le perlas magnéticas recogieron utilizando jump'éel bix magnético, u lavaron exhaustivamente yéetel le K'aanan cruzados proteína leti' ADN ku invirtieron yéetel le ADN ku eluyó ti' le análisis PCR tu k'iinil xíimbal tumen. (Ristola et ti' le. 2009).

Wa u ADN EHEC utia'al u análisis matrices chips yilik

Disposición u lisados celulares yéetel ADNs extraídos
Le gránulos bacterianos suspendidos ti' PBS tak le concentración final deseada trataron yéetel disruptor ultrasonidos UP100H (Hielscher GmbH, Alemania) equipado yéetel juntúul micropunta MS1 (1 mm metros). Le frecuencia funcionamiento ka'ach u 30 kHz yéetel le potencia salida efectiva ka'ach u 100 W. Ichil operación, le muestras ku enfriaron ti' jump'éel wichkíil ja' helada, ku mezclaron yéetel ku u centrifugaron. Le muestras ku utilizaron utia'al u xook citometría flujo, ka' jo'op' u utia'al u posterior manipulación, le muestras ku sometieron ti' jump'éel Ts'a'akal térmico (95 ° C, 5 min). Le lisados celulares crudos ku procesaron yéetel juntúul mezcla fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1). Ku añadió jump'éel volumen beyli'obe' ti' le mezcla ti' le muestra lisado, le solución ku agitó tu vórtice vigorosamente ichil 15 Guatemala mina'an u yotocho'ob yéetel u centrifugó u 15.000 x g ichil 2 min u temperatura ambiente (RT) mentik kex 22 ° kuxtal Le fase acuosa superior u contenía le ADN genómico u separó cuidadosamente yéetel u tu Jáay ti' jump'éel túumben tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, le muestras ku sometieron u sonicación utia'al u fragmentar le ADN. Le p'isibij sonicación u beetajo' le meyajo'ob condiciones u le descritas ka'achij. Yo'osal Trauma le táanil le fragmentación yóok'ol le ADN genómico, le muestras ku analizaron yo'osal electroforesis ti' gel agarosa.
(…). Le muestras sonicadas ku ichil 2,5 min ku sometieron ti' jump'éel fase extracción paach juntúul Ts'a'akal térmico yéetel juntúul centrifugación. Le ADN liberado ku extrajo ka'atéen yéetel juntúul mezcla fenol:cloroformo: alcohol isoamílico, ka posteriormente u sometió ti' jump'éel segunda sonicación ti' 0 – 15 min. U utilizó electroforesis ti' gel agarosa utia'al u determinar u distribución le Buka'aj le ADN sometido le fragmentación ultrasónica posterior ti' le extracción (Fig. tu superior k'abil beya'). Le ADN ma'alob fragmentado ka'ach evidente tumen le meyajo'ob jump'éel frotis ADN kúuchil le bandas ka'anal peso molecular ba'ax ku eliminaron ti' le muestras sonicadas ti' 2,5 minutos wa asab. Jump'éel sonicación jach chowak redujo gradualmente u longitud le fragmentos tak yan 150-600 pb, yéetel le sonicación ichil 15 minutos degradó láayli' asab le fragmentos, je'el bix ku páajtal wil sobre todo tu superior le frotis. Je'elo', le Buka'aj chúumuk le fragmentos ADN Jáatspaj gradualmente yéetel le k'iin ultrasonicación yéetel u Ts'a'akal 5 minutos permitió kéen p'áatak le tamaños fragmentos ti' ADN asab adecuados ti' le ensayos matrices chips. Ba'axten fin u estableció le procedimiento wa u le analito ADN, u comprendía le yáax 2 minutos u Ts'a'akal ultrasónico, u extracción le ADN (2×) yéetel le posterior sonicación 5 minutos yilik. (Basselet et ti' le. 2008).

Inmunoprecipitación cromatina (ChIP).

Le células HEK293 ku cultivaron bix u describió ka'achij yéetel ku fijaron yéetel 2 mM disuccinimidil-glutarato ichil 45 min temperatura ambiente. Posteriormente, le células ku p'o'ob ka'atéen yéetel PBS. Le cromatina ku reticuló ichil 10 min u temperatura ambiente utilizando formaldehído le 1 ti chúumuk (v leti' v) yéetel u p'o'ik ka'atéen yéetel PBS síis. Le reacción reticulación je'elij yo'osal incubación yéetel glicina ti' jump'éel concentración final u 0,125 M ichil 5 min u temperatura ambiente. Ka' le incubación yéetel tripsina, le células ku rasparon ti' le placa yéetel t'aan yéetel u lavaron ka'atéen yéetel PBS. Le pellet t'aan resuspendió ti' tampón lisis (5 mM ti' tuberías, pH 8.0, 85 mM KCl yéetel 0.5 ti chúumuk (v leti' v) u Nonidet p'el-40), ku incubó tu hielo ichil 10 min yéetel u homogeneizó yéetel juntúul homogeneizador Dounce. Posteriormente, le núcleos ku peletizaron tumen centrifugación (3500 x g, 5 min, 4 ° C) yéetel u resuspendieron ti' tampón núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA yéetel 1 ti chúumuk (p'el leti' v) u SDS). Le núcleos bino'ob u interrumpidos tumen le sonicación yéetel óoxp'éel pulsos 20-s ti' jump'éel Sonicar UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) ti' jump'éel ajuste ciclo 0,5 yéetel amplitud le 30 ti chúumuk, produciendo fragmentos ADN genómico yéetel jump'éel Buka'aj aparente 200 u 1000 pb. Utia'al ChIP, 50 g ADN ku diluyeron 4 Óoxten ti' tampón inmunoprecipitación (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl ti', 1,2 mM EDTA, 1,1 ti chúumuk (v leti' v) u Triton X-100 yéetel 0,01 ti chúumuk (p'el leti' v) u SDS). (Weiske et ti' le. 2006).

Análisis uchik u péeksa'al u histonas tumen inmunoprecipitación cromatina (ChIP).

Brevemente, 6 x 10⁶ Le células p'o'ob ka'atéen yéetel PBS yéetel u reticularon ti' le placa yéetel ichil 15 min temperatura ambiente te' meyajo'ob formaldehído ti' le 0,5 ti chúumuk. Le reacción reticulación je'elij yo'osal le adición glicina 0,125 M. Tuláakal le wook yéetel bisa'ab ka'ansaj 48 ° kuxtal Tuláakal le tampones bino'ob preenfriados yéetel contenían inhibidores le proteasa (Complete Mini, Roche). Le células p'o'ob ka'atéen yéetel PBS ka ts'o'okole' ku rasparon. Le gránulos recogidos disolvieron ti' 1 ml tampón lisis (1 ti chúumuk SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) yéetel ku sonicaron ti' jump'éel wichkíil etanol frío ichil 10 ciclos ti' le 100 ti chúumuk amplitud utilizando jump'éel Sonicar UP50H (Hielscher, Teltow, Alemania). Fragmentación le cromatina ku visualizó gel agarosa ti' le 1 ti chúumuk. Le fragmentos obtenidos yano'ob ichil le rango 200 u 500 pb. Le cromatina soluble ku obtuvo centrifugando le muestras sonicadas ti' 14.000 g ichil 10 minutos u 48 ° kuxtal Le fracción soluble ku diluyó 1 leti' 10 ti' tampón dilución (1 ti chúumuk Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) ts'o'okole' ku alícuota yéetel u almacenó u 80 ° C tak u búukinta'al. (Rodríguez et ti' le. 2008).