Ma'alo'obtal u ultrasonido Hielscher

Ultrasónico ADN corte

  • Ti' ADN yéetel ARN esquila, le moléculas ADN ku p'éelili'kuunsa'alo'ob, ti' ts'iit asab mejen. DNA leti' RNA u fragmentación le juntúul le importantes wook ti' wa u muestra yilik k'a'abeto'ob crean bibliotecas utia'al le uláak' secuencia generación (NGS).
  • Corte ultrasónico u ADN meyajtiko'ob le muuk' cavitación acústica utia'al jaatik le DNA wa RNA ti' xóot' 100 – bp u 5 kb.
  • Corte ultrasónico ku cha'antik precisa fragmentación ti' le ADN yéetel le adaptación ti' le longitud deseada ti' le ADN.

 

Ultrasónico ADN corte

Hielscher Ultrasonics k'u'ubul ya'abkach soluciones ku basadas tu ultrasonido utia'al ADN, ARN yéetel cromatina corte. Elegir ichil jump'éel ultrasonicators bin yano'ob sonda (p'el. ej. UP100H) utia'al u sonicación directa yéetel juntúul micropunta wa utilizar le VialTweeeter wa le cuphorn ultrasónico ti' indirecta wa u yilik ADN ya'abkach muestras simultáneamente. Hielscher k'u'ubul le beetike' uts dispositivo teniendo tu yilaje' u kajtalo'ob ichil: Ts'o'ok a 1 wa tak 10 muestras, volúmenes microlitros volúmenes litro – Procesadores ultrasónicos Hielscher u disponibles utia'al u beetik yéetel le requerimientos utia'al u mentik fragmentos ADN, ARN yéetel cromatina ti' le longitud ma'alob. Reproducibilidad, chéen ch'a'abil meyajo'ob yéetel jump'éel kaambalil yo'osal preciso permiten jump'éel biblioteca confiable utia'al u secuenciación u láak' "semana" generación.
Ti' contraste yéetel le fragmentación enzimática ti' le ADN, corte ultrasónico aplica muuk' esquileo mecánico Chen séen xma' adición yik'áalil químicos. Le ajuste preciso ti' parámetros tuukula' ti', corte ultrasónico u yaantal fragmentos ADN ka'anal peso molecular (plásmido yéetel ADN genómico).
Ácidos nucleicos purificados táan u béeytal u amplificados ka'ache' wa ka' jump'éel paso le fragmentación.
Parámetros sonicación (potencia, ciclo pulso leti' estalla, k'iin ka temperatura) u controlar u seguridad yo'osal le configuración software.

Ventajas:

  • Kaambalil yo'osal preciso
  • ciclos u sonicación yéetel k'iin precisamente adaptable ti' le Buka'aj deseado le DNA
  • fragmentos ADN ka'anal peso molecular
  • Kaambalil yo'osal u temperatura
  • Séeb
  • ya'ala'al máaxo'ob máano'ob reproducibles
  • esterilizable tu autoclave
  • ya'abkach soluciones: Bin yano'ob sonda, VialTweeter ka Cuphorn

U tsoolil bix utia'al u corte ADN ultrasónico

Utia'al u ensayo inmunoprecipitación cromatina

Brevemente, le células bino'ob plateadas ti' lak 60mm metros (400.000 tumen lako') yéetel transfected yéetel RhoA (bey descrito) siRNA; ka' 72 h, ku incubaron yéetel formaldehído (concentración final ti' 1 ti chúumuk) tumen 10 min u 37 ° C utia'al u entrecruzar proteínas ti' le ADN. Le reacción entrecruzamiento bin u saciada tumen le adición jump'éel décimo volumen 1.25 glicina mol leti' L, u le concentración final ti' 125 mmol leti' L. Le células bino'ob u lavadas ka'atéen yéetel PBS síis, suspendidas ti' tampón ensayo radioinmunoprecipitación [150 mmol leti' L u NaCl, 1 ti chúumuk NP40 ti', desoxicolato 0.5 ti chúumuk, 0.1 ti chúumuk SDS, 5 mmol leti' L u EDTA ti', 50 mmol leti' L u Tris-HCl (pH 8,0)] ku ya'alik u fluoruro phenylmethylsulfonyl mmol leti' L 1 ti', Ag 1 leti' mL aprotinina ka 1 Ag leti' mL pepstatin u ka mantenido ti' hielo ti' 30 minutos. Ts'o'okole', bino'ob sonicados lysates le célula ti' le hielo yéetel jump'éel Hielscher UP200S sonicador ultrasonido (3 x 40 Guatemala mina'an u yotocho'ob, amplitud 40 ti chúumuk, ciclo 1;). Hielscher Ultrasonics GmbH) tak chromatins reticulados bino'ob u esquiladas tia'al fragmentos u ADN ichil tuláakal 200 yéetel 1.000 PB. Jump'éel décima tu'ux tuláakal lisado bin u utilizado utia'al u cuantificar le cantidad presente ti' jejeláas muestras ADN yéetel considerado bey “ADN yaan total”. Sobrenadantes incuban yéetel esperma salmón mezcla ti' agarosa - 50 ti chúumuk ADN leti' proteínas utia'al u xu'ulsiko'ob u yiit ma' específico. Inmunoprecipitación túun bin ku ti' le áak'aba' yaan 4° C yéetel 5 Ag p65 ti' NF-anti-nB (Upstate) wa ma' anticuerpos (kaambalil yo'osal negativo). Le sobrenadantes j-bino'ob suplementados yéetel 5 mol leti' L NaCl yéetel calefacción ichil áak'abe' 65° C utia'al u revertir le K'aanan cruzados proteína-DNA. Le immunocomplexes bino'ob asab tratados yéetel libre DNasa yéetel Rnasa proteinasa K'uj, yéetel le ADN bin purificado tumen precipitación extracción yéetel etanol fenol leti' cloroformo. Tu beetajo' PCR yéetel iniciadores específicos u tu yo'osal u jump'éel secuencia ichil le petenil le promotor u gene le iNOS humana (yáax p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; yáax p2: GCTGGGCTACTGACCCAG ti'-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et el., 2008).

Xook expresión EGFP

Utia'al u xook expresión ti', le cepa recombinante u L tarentolae p10:F9Begfp1. 4dBsat #12 (Biociencia ti' Jena, Alemania) yéetel le gen EGFP (asab proteína ya'ax fluorescente), cromosómica ssu integrado, bin cultivada ti' le jejeláas medios comunicación bix u describe ka'achij yéetel ku complementado yéetel 100 mg l-1 Nourseothricin (Biociencia ti' Jena, Alemania). Ichil le yéetel, muestras 1 ml bino'ob tomadas, centrifugada (2000 × g, 20° C, 10 minutos) yéetel p'o' yéetel solución u NaCl ti' le 0,9 ti chúumuk. Pellet u resuspendió ti' buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM TDT) yéetel ku desintegró tumen sonificación yéetel le procesador ultrasónico UP400S (u kaambalil yo'osal energía ∼ 400 Ws). Jaantik yáalab celulares bino'ob removidos tumen centrifugación (6000 × g ti', 4° C, 5 min) yéetel analizados tumen dodecil sulfato sodio-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) yáanal reducción condiciones de acuerdo con u método u Laemmli (1970) yéetel 12,5 ti chúumuk polyacralamide geles. Expresión EGFP bin examinado ti' yéetel jíita'al. (Fritsche et el., 2007).

UP100H Hielscher bin u utilizado utia'al u mentik EHEC ADN utia'al u análisis le matriz chip

Análisis electroforéticos DNA genómico u Escherichia coli EDL933 sometidos ultrasonidos 0 - u 15 minutos. L indica le ba'ala' yaan ADN. (Basselet et el., 2008).

Solicitud a'alajil t'aan




Yanak ti' tu yilaje' k Política yojeta'al mixba'al.


Inmunoprecipitación cromatina

Disruptor t'aan ultrasónico UP100H (100W) tumen lisis, alteración le célula yéetel ADN corte.Le ensayo inmunoprecipitación cromatina beetajo' yo'osal le ChIP-ITTm Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) bin le t'aano'ob le fabricante yéetel Jayp'éel modificaciones. Brevemente, podocitos yóolo'ob u diferenciados j-bino'ob reticuladas yéetel formaldehído le 1 ti chúumuk ichil 10 min u temperatura ambiente. Le células p'o'ob yéetel PBS síis yéetel le reacción fijación je'elij tumen adición glicina 0,125 M ichil 5 minutos u temperatura ambiente. Células ku p'o'ob tu ka'atéen yéetel PBS helado yéetel raspadas ti' le lako'. Le células bino'ob u peleteadas tumen centrifugación yéetel resuspendió ti' le tampón lisis. Ka' centrifugación, núcleos sedimentados ku resuspendió ti' le búfer esquila, u incubó ti' hielo ti' 30 min yéetel le cromatina bin u esquilada tumen sonicación, p'el. ej. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Alemania) ti' le 25 ti chúumuk le energía 5 pulsos 20 segundos ti' le hielo ti' fragmentos - yan 200 600 bp. Le cromatina esquilada ts'o'okole' ku centrifugó yéetel le sobrenadante ku tu Jáay. Utia'al immunoprecipitations, 60 μl cromatina ku incubó yéetel 1 μg Sp1 (biotecnología u Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) wa p50 ti' NF-κB (Abcam) anticuerpos wa yéetel t'u'ulo' IgG (Zymed Laboratories, South San Franciscoe', CA, USA), bey jump'éel Kaambalil yo'osal negativo, ti' le áak'aba' yaan 4° C yéetel rotación O'olkij. Immunocomplexes u magnéticos ti' u recopilaron utilizando jump'éel bix u magnético, lavado exhaustivamente yéetel u revirtieron le reticulaciones proteína leti' ADN yéetel ADN eluyen utia'al u análisis PCR tu k'iinil xíimbal tumen. (Ristola et el. 2009).

Wa u yilik EHEC ADN utia'al u análisis le matriz chip

Arreglo lysates ti' le célula yéetel le ADN extraído
Balines bacterianas suspendidas ti' PBS ti' le concentración final deseada bino'ob u tratados yéetel disruptor ultrasonido UP100H (Hielscher GmbH, Alemania) equipado yéetel juntúul micropunta MS1 (1mm metros). Le frecuencia u meyajo'ob 30 kHz yéetel potencia salida xoknáalo'obo' 100 w le. Ichil operación, ku enfría ti' jump'éel wichkíil ja' helada, mezclada yéetel ku centrifugada. Le muestras ku utilizaron yo'osal xook citometría flujo, ka' jo'op' u utia'al u ch'a'iko'ob posterior, le muestras ku sometieron ti' jump'éel Ts'a'akal térmico (95° C, 5 min). Le lysates ti' le célula crudo bino'ob u procesados yéetel juntúul mezcla alcohol fenol: cloroformo: isoamílico (25:24:1). Jump'éel volumen beyli'obe' le mezcla añaden ti' le muestra lisada, le solución bin le agitó vigorosamente ti' 15 Guatemala mina'an u yotocho'ob yéetel centrifugada 15.000 x g ichil 2 min u temperatura ambiente (RT) mentik kex 22 ° kuxtal Le fase acuosa superior ba'ax ku taasik le ADN genómico bin cuidadosamente separada ka recopilada ti' jump'éel túumben tubo Eppendorf estéril.
Posteriormente, le muestras bino'ob sonicadas utia'al u fragmentar le ADN. Le paso le sonicación bin realizado ti' le meyajo'ob condiciones bix u describe ka'achij. Yo'osal Trauma le táanil le fragmentación ti' le ADN genómico, le muestras bino'ob analizadas yo'osal u búukinta'al electroforesis ti' gel u agarosa.
(…). Le muestras ku sonicadas ichil 2,5 min bino'ob sometidas ti' jump'éel paso extracción ka' Ts'a'akal térmico ka centrifugación. DNA liberado bin u extraída ka'atéen yéetel juntúul mezcla alcohol fenol: cloroformo: isoamílico ka ts'o'okole' sometido u ka' sonicación utia'al 0 - 15 minutos agarosa electroforesis u utilizaron utia'al u determinar u distribución le Buka'aj ADN ka' u extracción fragmentación ultrasónica (Fig. tu superior k'abil beya'). ADN ma'alob fragmentado ka'ach evidente u meyajo'ob jump'éel borrón transferencia ADN kúuchil bandas peso molecular u ka'anal u bino'ob eliminados ti' le muestras sonicación ti' 2,5 min wa asab. Sonicación asab gradualmente u reducido fragmento longitudes u yan 150-600 bp yéetel sonicación ti' 15 min ku asab degradados le fragmentos, bey u yil ku sobre todo tumen le nu'ukulil superior ti' le frotis. Je'elo', Buka'aj chúumuk le fragmento ADN Jáatspaj gradualmente yéetel le k'iin ultrasonidos yéetel u Ts'a'akal u 5 minutos permitido kéen p'áatak u le tamaños ADN fragmentos asab adecuados ti' le ensayos array chip. Ba'axten último u estableció le procedimiento wa u DNA analito u comprende le yáax 2 minutos u Ts'a'akal tumen ultrasonido ti', extracción ADN (2 ×) yéetel posterior yilik 5 min sonicación. (Basselet et el., 2008).

Inmunoprecipitación cromatina (ChIP).

Ultrasonic processor UP100H for DNA, RNA and chromatin shearing. (Click to enlarge!)Le células HEK293 bino'ob cultivadas bix u describe ka'achij yéetel 2 mM disuccinimidyl-glutarato tumen 45 min u temperatura ambiente. Posteriormente, le células ku p'o'ob ka'atéen yéetel PBS. Cromatina entrelazada tumen 10 min u temperatura ambiente yéetel formaldehído ti' le 1 ti chúumuk (v/v) yéetel p'o'ik ka'atéen yéetel PBS síis. Reacción le cross-linking je'elij tuméen le incubación yéetel glicina ti' jump'éel concentración final u 0,125 M ichil 5 minutos u temperatura ambiente. Paach le incubación yéetel tripsina, le células jach u raspadas le placa yéetel t'aan yéetel p'o'ob ka'atéen yéetel PBS. Le precipitado u células u resuspendió ti' buffer lisis (tubos 5 mM, pH 8.0 ti', 85 mM KCl yéetel 0.5 ti chúumuk (v/v) Nonidet p'el-40), ku incubó tu hielo ichil 10 min yéetel homogeneizado yéetel juntúul homogeneizador Dounce. Posteriormente, le núcleos bino'ob peleteados tumen centrifugación (3500 x g, 5 min, 4 ° C) yéetel resuspendió ti' buffer núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8.1 ti', 10 mM EDTA yéetel 1 ti chúumuk (p/v) SDS). Le núcleos bino'ob u interrumpidos tumen sonicación yéetel óoxp'éel pulsos 20 Guatemala mina'an u yotocho'ob ti' jump'éel UP50H sonicador (Hielscher Ultraschall Technologie) ti' jump'éel entorno ciclo 0.5 yéetel amplitud 30 ti chúumuk, k'a'amal u ADN genómico fragmentos yéetel jump'éel Buka'aj asab 200-1000 bp. Utia'al ChIP, 50g DNA bin buffer diluido inmunoprecipitación 4 Óoxten (16,7 mM Tris-HCl, pH 8.1 ti', 167 mM NaCl ti', 1,2 mM EDTA, 1.1 ti chúumuk (v/v) Triton X-100 yéetel 0.01 ti chúumuk (p/v) SDS). (Weiske et el. 2006).

Análisis uchik u péeksa'al u le histonas tumen inmunoprecipitación cromatina (ChIP).

Brevemente, 6 x 106 le células bino'ob u lavadas ka'atéen yéetel PBS yéetel reticuladas ti' le placa yéetel ichil 15 min u temperatura ambiente te' meyajo'ob formaldehído ti' le 0,5 ti chúumuk. Reacción le cross-linking tumen adición glicina 0,125 M. je'elij: Tuláakal le wook yéetel j-bisa'abi' ka'ansaj ti' 48° kuxtal Tuláakal le memorias intermedias bino'ob ku enfriadas yéetel ya'alik u inhibidores le proteasa (Mini completa, Roche). Células u p'o'ob ka'atéen yéetel PBS ka tu láak' raspó. Recogidos ku disolvieron tu 1 ml tampón lisis (1 ti chúumuk SDS ti', 5 mM EDTA ti', 50 mM Tris pH 8) yéetel ku sonicó ti' jump'éel wichkíil etanol frío utia'al 10 ciclos ti' 100 ti chúumuk amplitud utilizando jump'éel UP50H sonicador (Hielscher, Teltow, Alemania). Fragmentación le cromatina ku visualizó tu gel u agarosa ti' le 1 ti chúumuk. Fragmentos obtenidos bino'ob ti' le rango 200 - 500pb. Cromatina soluble u obtuvo tumen centrifugación le muestras sonicadas 14.000 g tumen 10 min u 48° kuxtal Le fracción soluble j-buffer diluido 1 leti' 10 ti' dilución (1 ti chúumuk Tritón X-100, 2 mM EDTA ti', pH u Tris 20 mM 8 ti', 150 mM NaCl) tu láak' alícuotas ka almacenado u 80 ° C tak u búukinta'al. (Rodríguez et el., 2008).

Dispositivo u Potencia [W] Bin yano'ob Volumen [mL]
VialTweeter 200 independiente 0.5 1.5
UP50H 50 k'ab wa xan 0.01 250
UP100H 100 k'ab wa xan 0.01 500
UP200Ht 200 k'ab wa xan 0.1 1000
UP200St 200 xan 0.1 1000
UP400St 400 xan 5.0 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 celda flujo libre contaminación

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VialTweeter u Hielscher le is ́deal ti' simultánea wa u yilik ya'ab k'oja'ano'ob muestras

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Literatura leti' referencias

  • Basselet p'el., G. Wegrzyn, Enfors Guatemala mina'an u yotocho'ob-O., M. Gabig-Ciminska (2008): procesamiento chip ku ti' le arreglo análisis DNA enterohemorrágica Escherichia coli (EHEC) ti' le muestra. Fábricas u células microbianas 7:29. 2008.
  • Doublier, CH'EL. Riganti, Voena S.c., Costamagna kuxtal, E. Aldieri, Pescarmona G., D. Ghigo, uts U. (008): silenciamiento RhoA revierte resistencia ti' le doxorrubicina ti' células humanas le k'ak'as k'oja'anil cáncer u Colon. Investigación k'ak'as k'oja'anil cáncer molecular 6 (10), 2008.
  • E Fredlund, Gidlund U., M. Olsen, Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Ka'aten ti' le método ku extracción ADN Fusarium micelio yéetel trigo utia'al u cuantificación PCR tu k'iinil xíimbal tumen che'ejtaj kaambal yéetel correlación u niveles ti' micotoxinas. Sáansamal u 2008 métodos microbiológicos.
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  • RISTOLA M. S. Arpiainen, Saleem M. U., Mathieson p'el. W., I. G. Galés, S. Lehtonen, Holthöfer H. (2009): Reglamento u Neph3 gene ti' podocytes ti'-k'ajle' noj le transcripción ba'ax NF-kB yéetel Sp1. BMC Molecular biología 10:83, 2009.
  • J Rodriguez L. kaja'anech, Jorda M., Morales kuxtal, Munoz M., Vendrell, E., Peinado M. U. (2008): Seguimiento tuláakal le genoma unmethylated DNA Alu ku repeats tu células normales yéetel cancerígenas. Investigación u ácidos nucleicos Vol. 36, Nº 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): le tríada histidina proteína Hint1 desencadena Apoptosis independiente ti' u actividad enzimática. Le Sáansamal Biological chemistry. Vol. 281, ma' táan. 37, 2006. 27356 27366.


Hechos u tojol le su'utalil K'ajóolt

Acústica leti' ultrasónica ti' le cavitación crea muuk' jach intensas u promueve le procesos cristalización yéetel precipitación (Click utia'al agrandar!).

Corte ultrasónico u ADN basa ti' le cavitación acústica yéetel u muuk' cizallamiento hidrodinámico