Wa u plásmidos yo'osal ultrasonido wa u meyaj
Le ultrasonicación jach jump'éel láaka confiable utia'al u fragmentar le ADN plásmido. Le amplitud controlable yéetel precisión, le modo pulsación yéetel le kaambalil yo'osal temperatura le le yáantajo'ob asab importantes ti' jump'éel ultrasonido utia'al u fragmentación plásmidos ma' dañinos. Ku ts'o'okole', u búukinta'al ciertos agentes ku yáantik wáaj xu'ulsik u degradación le plásmidos. Hielscher Ultrasonics k'u'ubul ya'abkach soluciones utia'al u fragmentación controlada ti' plásmidos ichil viales individuales, le sonicación simultánea ti' numerosas muestras, bey placas ya'ab k'oja'ano'ob pocillos. Obtenga a wojeltik yóok'ol le fragmentación exitosa ti' plásmidos ultrasónicos!
Le UIP400MTP Cha' u ultrasonicación controlada yéetel precisión placas ya'ab k'oja'ano'ob pocillos. Jump'éel le aplicaciones le UIP400MTP jach u fragmentación le ADN plásmido tia'al fragmentos jump'éel longitud específicamente dirigida.
Cizallamiento plásmidos yo'osal ultrasonicación
Ka le muestras ADN someten ondas ultrasónicas, le vibraciones generadas tumen ultrasonidos crean cavitación acústica ti' le líquido tu ch'a'akal wa jaat moléculas ADN ka'anal peso molecular yéetel mecánicas muuk'. Le sonicación jach le método asab utilizado utia'al u experimentos cizallamiento u ADN u granel, incluidas aplicaciones, bey le inmunoprecipitación cromatina (ChIP), utia'al le tamaños fragmentos mejen le absolutamente cruciales tia'al jump'éel ka'anal resolución. (cf. Tseng et ti' le., 2012).
Le ADN plásmido (pDNA) leti' jump'éel bix específica ti' ADN, caracterizada tumen u beyo' ts'ipit k'ab ka Kula'an ti' bacterias yéetel yaan eucariotas.
Le PDNA superenrollado jach u páajtalil deseada ADN plásmido, ts'o'ok u ye'esik ti' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob ti' procesos yéetel, bey le secuenciación automatizada yéetel le transfección. Le ultrasonicación jach úuchuk utia'al u fragmentar le PDNA, incluido le pDNA superenrollado, belal.
Thompson et ti' le. (2008) demostraron ti' le sonicación plásmidos, Ba'ax u yoojel fragmenta le ADN superenrollado, leti' jump'éel bix efectiva u ma'alo'obkíinsiko'ob le longitudes xooka' le secuencia phred20 tak le ch'aaj u ma' le significativamente jejeláas le plantilla kaambalil yo'osal u Beckman Coulter wa ti' le plásmidos enzimáticamente linealizados.
- Controlable yéetel precisión
- Ya'ala'al máaxo'ob máano'ob reproduc
- Ajustable u longitudes fragmentos ADN objetivo
- Kaambalil yo'osal u temperatura
- Escalable u je'el Buka'aj muestra
Búukinta'al vectores plásmidos
Le plásmidos ku utilizan tu menudo bey nu'ukul utia'al clonar, transferir yéetel ku manipular genes. Ka le plásmidos ku utilizan experimentalmente ti' le fines, u k'aabao'ob vectores. Le fragmentos wa genes ADN ku páajtal insertar ti' jump'éel vector plásmido, creando jump'éel llamado plásmido recombinante. Le vectores plásmidos ku utilizan bey kisbuuts'o'ob utia'al conducir ADN recombinante ti' jump'éel célula huésped yéetel le jump'éel componente clave ti' le clonación molecular.
“Le vectores ma' virales táan siendo ampliamente estudiados tumen u búukinta'al potencial ti' le terapia génica utia'al u k'aax kúuchilo'ob k'aas k'oja'anilo'obo' complicadas. Le vectores ma' virales protegen le ADN plásmido xu'ullsa'al le degradación a, química yéetel enzimática ka entregan u molécula u ADN u objetivo le ts'ono'oto'. Je'ebix, le liposomas catiónicos, le quitosano yéetel uláak' nanopartículas cargadas positivamente táakpajalo'ob complejos yéetel ADN plásmido yéetel interacciones electrostáticas. Ba'ale' le complejos u ADN catiónico leti' adn plásmido liposomas catiónicos uchik formados Nuuktak relativamente (es decir 300-400 nm) yéetel ku heterogénea, ku le beetik talam u biilankiltej ti' aplicaciones farmacéuticas. Le complejos ADN leti' liposomas u plásmidos nukuch ka heterogéneos, ADN leti' aerosoles plásmidos yéetel complejos adN leti' péptidos u plásmidos u páajtal xu'ulsiko'ob partículas asab mejen ka homogéneas yo'osal ultrasonidos.” (Sarker et ti' le., 2019).
Juntúul ejemplo destacado uti'al u u vectores plásmidos jach CRISPR-Cas9. Le yaan CRISPR-Cas9 ku u ku ts'áajik ti' le células bey juntúul chéen plásmido nojoch wa ya'ab k'oja'ano'ob plásmidos asab mejen u codifican jump'éel secuencia objetivo, jump'éel náakake' u yaak'il CRISPR ka Cas9.
Preparación ultrasónica u nanopartículas u PLGA cargadas u ADN tumen nanoprecipitación
Jo et ti' le. (2020) utilizaron ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) utia'al formar jump'éel portador nanopartículas utia'al u k'u'ubul jump'éel plásmido bix u CRISPR-Cas9 ti' macrófagos primarios derivados ti' le médula ósea. Utia'al u nanoprecipitación nanopartículas PLGA, u utilizó PLGA yéetel ka'ap'éel ku finales jejeláas (ku éster yéetel amina) yéetel u le tapas finales ti' amina cargadas positivamente aumenten eficiencia encapsulación yéetel kuuch debido a le interacciones kuuch ichil leti' yéetel le columna vertebral cargada negativamente ti' le ADN. Ti' jump'éel tubo centrífugo cónico ti' polipropileno 50 ml, 100 mg Pluronic F127 ku disolvieron ichil ja' TIn ti' autoclave 20 ml yo'osal mezcla vórtice seguida u 30 min sonicación O'olkij utilizando jump'éel wichkíil ultrasónico ().wil CupHorn). Ku agregó jump'éel barra agitación magnética ti' autoclave yéetel le solución j-xa'ak'pajij u 600 RPM ti' 30 minutos ka' jo'op' ku betiko'obe' le uláak' soluciones. Ku utilizó xooko'obo' laboratorio plástico kúuchil cristalería utia'al u minimizar le adsorción inespecífica ti' le ADN. Le soluciones ku PLGA disueltas ti' DMF (44,48 mg leti' ml) yéetel TIPS pentaceno disueltas ti' THF (0,667 mg leti' ml) tu tumen separado. Le PLGA tu cha'aj u inactivo ti' húmedo ti' DMF ti' 30 minutos bey ma' u sonicado ti' 30 minutos. (utia'al u protocolo k'iini' wil Jo et ti' le., 2020).
- Extracción de ADN
- Encapsulación le ADN
- Dispersión ADN recubierto u nanopartículas
- U ADN plásmido ti' le células k'u'ubul
Le UP200St CupHorn utia'al u sonicación indirecta ti' muestras, je'ebix, yo'osal le extracción yéetel fragmentación ADN.
Protección le ADN plásmido ti' le sonicación
Le ADN, incluidos le plásmidos yéetel le plásmidos superenrollados, le jump'éel degradación ma'alob sensible. Tuláakal le métodos u fragmentación disponibles le u k'ajóolta'ano'ob tumen ciertas desventajas. Le fragmentación ultrasónica ti' le ADN jach juntúul ti' le métodos preferidos, ts'o'ok u le sonicación controlada ti' combinación yéetel ba'axo'ob tu kano'ob ti' protección Cha' u xu'ulsiko'ob le loob inducido tumen le cizallamiento yéetel u yooxol le hebras ADN.
Beyxan ti' kaambalilo'ob le ajustes baja amplitud, le modo pulsación yéetel le kaambalil yo'osal le temperatura ichil le cizallamiento ultrasónico ti' le ADN, u búukinta'al ciertos agentes tu ye'esaj jump'éel efecto protector significativo xu'ulsik u degradación le ADN. Je'ebix, ya'ab polímeros, péptidos yéetel lípidos protegen le ADN plásmido ti' le ultrasonicación.
Estabilidad le ADN plásmido yéetel le nanocomplejos ADN leti' IL plásmidos xu'ullsa'al le estrés cortante ultrasónico ku investigó utilizando le ensayo electroforesis ti' gel agarosa. Tuukulo'oba' le ADN plásmido bey le nanocomplejos ADN leti' IL plásmido sometieron ti' tensión corte ultrasónico ti' jejeláas ti'its k'iin. Le ADN plásmido bin expuesto u tensión corte ultrasónico ti' 0, 10, 20, 30 yéetel 40 minutos. Ba'ale' le nanocomplejos ADN leti' IL ti' le plásmido ku expusieron ti' jump'éel esfuerzo corte ultrasónico ti' 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 yéetel 120 minutos.
(xook yéetel wíimbala': ©Sarker et ti' le., 2019).
Sarker et ti' le. (2019) demostraron ba'ax ken le nanoestructuras ADN plásmido leti' líquido iónico (pDNA leti' IL) ku sometieron u estrés cizallamiento ultrasónico ti' 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 yéetel 120 min yéetel u complejaron yéetel le aj nu'uktaj ma'alo'ob meyaj beetik u genes catiónicos disponible comercialmente lipofectamina, le porcentaje células fluorescentes u positivas j-le 80 ti chúumuk, 98 ti chúumuk, 97 ti chúumuk, 85 ti chúumuk, 78 ti chúumuk, 65 ti chúumuk, 65 ti chúumuk yéetel 50 ti chúumuk, respectivamente (wilik u le uláak' cuadro). Le porcentaje células fluorescentes u positivas aumentó ka le nanoestructuras ku sometieron u tensión corte ultrasónico ichil 10 yéetel 20 minutos, ka ts'o'okole' Jáatspaj Chaambel.
Influencia le líquido iónico [Bmim] [PF6] ti' u k'u'ubul ADN plásmido ti' le células COS7. Le nanocomplejos ADN leti' IL plásmido (líquido iónico) ku sometieron u tensión cizallamiento ultrasónico ichil jump'éel k'aas 120 minutos yéetel ku complejaron yéetel le bey ma' k'ubik ti' le células COS7. Le datos muestran le meyaj ku taamedio () tu células HeLa GFP positivas contadas ichil 10 sikte microscópicos jejeláas yéetel le experimento ku beetajo' ya'abkach Óoxten ti' óoxp'éel jejeláas k'iino'ob. (Xook yéetel gráfico: ©Sarker et ti' le., 2019).
Le ADN plásmido ku páajtal wáaj añadiendo juntúul aj nu'uktaj bey ma' u fragmentación ultrasónica: Degradación inducida tumen sonicación le pDNA desnudo (U) yéetel le pDNA formulado yéetel 1,5 mM CaCl2 yéetel 20 ti chúumuk (v leti' v) u t'aano'-butanol (B).
Le muestras ku sonicaron yéetel juntúul sonda 20W utia'al tak 120 Jayp'éel, bey ku indica tu superior Amal carril. Le carril H ichil le marcador Hyperladder I ™️. Le bandas u plásmidos OC yéetel SC u indicadas.
(xook yéetel máak: ©Wu et ti' le., 2009).
Preparación ultrasónica u lisado
Protocolo lisis t'aan ultrasónica
Ken káaje' yéetel juntúul muestra enriquecida u células u beet ti' jump'éel método separación t'aan (je'ebix, separación t'aan inmunomagnética, tsoolil jejelas t'aan activada tumen fluorescencia (FACS), centrifugación tumen gradiente densidad ti', aislamiento t'aan u inmunodensidad).
Le muestras celulares k'a'abéet u we'esik jump'éel volumen jump'éel tampón lisis bixake' apropiado yo'osal le ba'ax ku kaxtik experimental yéetel le ultrasonido bin yano'ob sonda.
Ku prefieren le tampones hipotónicos, ts'o'ok u mejoran le lisis t'aan ultrasónica. Páaybe'en ti' le aditivos yéetel le concentración ta'ab u utilicen u bix ken úuchuk.
Seleccione u dispositivo lisis ultrasónica: utia'al u sonicación indirecta u viales, ku recomiendan le VialTweeter wa cupHorn. Utia'al u placas multipozo, le UIP400MTP jach beetike' uts le ultrasonido. Yéetel u sonicación clásica bin yano'ob sonda, jump'éel homogeneizador ultrasónico bey le UP100H wa UP200Ht yéetel juntúul micrococha le asab adecuados.
Protocolo utia'al u sonicación bin yano'ob sonda: Coloque le sonda ultrasonido ti' le volumen muestra ti' jump'éel tubo microcentrífuga yéetel sonice ti' aprox. 10 segundos. Dependiendo de le muestra ADN, u sonicación u repetir u wa Óoxten asab. Yaan tu energía ultrasónica jool requerida (Ws leti' mL) yaantal yo'osal u le viscosidad ti' le muestra yéetel le bin yano'ob ADN. Le enfriamiento yéetel táankab hielo yéetel le modo pulsación ti' le ultrasonido áantaj ti' Jech ti' le muestra ku degrade térmicamente.
Ka' ts'o'ok u lisis ultrasónica, le muestra ku centrifuga utia'al u separar le jaantik yáalab gránulos (u ya'alik células, núcleos yéetel orgánulos ma' lisados).
Wa u muestra ma' u procesa inmediatamente, ku páajtal almacenar ti' jump'éel temperatura úuchuk utia'al preservar u viabilidad.
Ultrasonidos utia'al u fragmentación le ADN
Hielscher Ultrasonics k'u'ubul ya'abkach plataformas ku basadas tu ultrasonido utia'al u fragmentación ADN, ARN yéetel cromatina. Táan a jejeláas plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones sonicación indirecta utia'al u preparación simultánea ti' muestras ti' ya'ab k'oja'ano'ob tubos wa placas ya'ab k'oja'ano'ob k tsa'ayal (je'ebix, placas u 96 k tsa'ayal, placas microtituladores), sonoreactores yéetel cuphorns ultrasónicos. Tuláakal le plataformas utia'al u corte ADN u alimentadas tumen procesadores ultrasónicos u ka'anal rendimiento yéetel ajustados ti' frecuencia, ba'ax ku controlables yéetel precisión yéetel ku ts'abal ya'ala'al máaxo'ob máano'ob reproducibles.
Procesadores ultrasónicos yo'osal je'el meyaj ku Buka'aj muestra
Yéetel le ultrasonidos multimuestra Hielscher VialTweeter (utia'al tak 10 tubos u ensayo) yéetel UIP400MTP (utia'al microplacas leti' placas multipozo) leti' uchik páajtal xu'ulsiko'ob le k'iin procesamiento muestras debido a le ultrasonicación intensa yéetel controlable yéetel precisión ka' jo'op' u obtiene le distribución yéetel le rendimiento deseados le Buka'aj le fragmento ADN. Le fragmentación ultrasónica ti' le ADN ku beetik le wook wa u le plásmido yilik k'áati' eficientes, confiables yéetel escalables. Le tsoolil bix u páajtal escalar linealmente u juntúul u numerosas muestras yo'osal le ka'anatako'ob parámetros u ultrasonido constantes.
Le ultrasonidos sonda yéetel juntúul u cinco yaal le ideales utia'al u wa u números u muestra asab mejen wa u meyajtiko'ob muestra asab mejen. Le ultrasonidos laboratorio Hielscher u disponibles yéetel jejeláas niveles ti' potencia utia'al u páajtal u elegir le disruptor ultrasónico beetike' uts utia'al u ka'anatako'ob relacionada yéetel le ADN.
Le unidad preparación ultrasónica multimuestra VialTweeter Cha' le sonicación simultánea u tak 10 viales. Yéetel le dispositivo sujeción VialPress, ku páajtal presionar tak 4 tubos adicionales tu delantera ti' jump'éel sonicación intensa.
kanik tuukula' exacto
Le ajustes u sonicación controlables yéetel precisión ku cruciales ts'o'ok u exhaustiva le sonificación je'el u páajtal u destruir le ADN, le ARN yéetel le cromatina, ba'ale' le cizallamiento ultrasónico inadecuado ku ts'aik bey resultado fragmentos ADN yéetel cromatina jach chowaktako'ob. Le ultrasonidos digitales u Hielscher u páajtal configurar uchik bin jump'éel parámetro sonicación preciso. Le configuración sonicación específica xan ku páajtal ooks bey configuración programada utia'al u repetición rápida u yéet procedimiento.
Tuláakal le sonicación ku protocola automáticamente yéetel u almacena bey archivo CSV ti' jump'éel tarjeta SD incorporada. Le je'ela' ku cha'antik jump'éel ju'uno'ob precisa ti' le ensayos realizados yéetel ku cha'antik xíixtik, uchik le ejecuciones sonicación.
Ti' le kaambalil yo'osal remoto ti' le navegador, tuláakal le ultrasonidos digitales ku páajtal operar yéetel monitorear yéetel je'el navegador estándar. Ma' k'a'abet u instalación software adicional, ts'o'ok u le conexión LAN le jump'éel configuración plug-n-play jach simple.
Asab facilidad búukinta'al ti' u ultrasónica wa u yilik le ADN
Tuláakal le ultrasonidos Hielscher u diseñados utia'al u ofrecer ultrasonidos u ka'anal rendimiento, ka' jo'op' u in wéet k'iin Mantats' le jach fáciles u biilankiltej ka fáciles u operar. Le ajustes u ma'alob estructurados ti' jump'éel menú jul, le tu u páajtal tsáabaltio'ob áantaj uchik ti' le pantalla táctil u boonil wa u kanik remoto ti' le navegador. Le software na'at yéetel ajustes programables yéetel grabación yo'osal u datos garantiza jump'éel configuración sonicación óptima tia'al ya'ala'al máaxo'ob máano'ob fiables ka reproducibles. Le interfaz menú Cho' yéetel ch'a'abil u biilankiltej p'áatal le ultrasonidos Hielscher ti' dispositivos fáciles ti' biilankiltej yéetel eficientes.
Le uláak' tabla ku ts'aik ti' jump'éel indicación le Buka'aj u ba'al u procesamiento aproximada u k ultrasonidos laboratorio yo'osal le lisis t'aan yéetel u fragmentación le ADN:
| Volumen lote | Tasa flujo | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| placas ya'ab k'oja'ano'ob pocillos | n/a | UIP400MTP |
| viales ti', vaso u precipitados pequeño | n/a | Cuphorn ultrasónico |
| tak 10 viales | n/a | VialTweeter |
| 1 u 500mL | 10 200 mL leti' min | UP100H |
| 10 u 2000mL | 20 400 mL leti' min. | UP200Ht, UP400St |
Ti' máax ku yéetel to'on! Leti' k'áatiko'ob k!
Literatura leti' Referencias
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Hechos u tojol le su'utalil K'ajóolt
Ba'ax ku le plásmidos.
Jump'éel plásmido jach chan molécula circular ADN u táan físicamente separada ti' le ADN cromosómico yéetel u replica bix independiente. Le plásmidos tu menudo ku taj yéetel genes contribuyen le supervivencia jump'éel organismo yéetel imparten ventajas específicas, je'ebix, resistencia ti' le antibióticos. Le plásmidos lu'umo'oba' asab comúnmente bey mejen moléculas u ADN circulares u naaj tsolokbal ti' le bacterias; Ba'ale' le plásmidos Yaan k'iine' u presentes ti' arqueas yéetel áantajilo'ob eucariotas. Le plásmidos ku nu'ukulo'ob importantes ti' biología molecular, genética, bioquímica yéetel ciencias u kuxtal. K'ajóolta'ano'ob bix vectores ti' ingeniería genética, le plásmidos ku utilizan utia'al replicar wa expresar ciertos genes. Le alteración dirigida ti' jump'éel vector denomina ku diseño vectorial.
Análisis GFP ti' investigación t'aan
Le proteína ya'ax fluorescente (GFP) leti' jump'éel marcador biológico versátil utia'al u monitorear procesos fisiológicos, visualizar localización proteínas yéetel ku detectar le expresión transgénica in kuxa'an. GFP je'el u páajtal u excitado tumen le internet ichil láser 488 nm yéetel u detecta u kin tuukul óptima u 510 nm.
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