Wa u plásmidos yo'osal ultrasonidos wa u meyaj
Le ultrasonicación jach jump'éel láaka fiable utia'al u fragmentar le ADN plasmídico. Le amplitud, le modo pulsación yéetel le kaambalil yo'osal le temperatura controlables yéetel precisión ku le yáantajo'ob asab importantes ti' jump'éel ultrasonido utia'al le fragmentación ma' dañina u plásmidos. Ku ts'o'okole', u búukinta'al ciertos agentes ku yáantik wáaj xu'ullsa'al le degradación plásmidos. Hielscher Ultrasonics k'u'ubul ya'abkach soluciones utia'al u fragmentación controlada ti' plásmidos ichil viales individuales, le sonicación simultánea numerosas muestras yéetel placas pocillos ya'ab k'oja'ano'ob. Obtenga a wojeltik yóok'ol le éxito fragmentación plásmidos ultrasónicos.
Le UIP400MTP Cha' u ultrasonicación controlada yéetel precisión placas pocillos ya'ab k'oja'ano'ob. Jump'éel le aplicaciones le UIP400MTP jach u fragmentación le ADN plasmídico con el fin de kéen p'áatak fragmentos jump'éel longitud específica.
Cizallamiento plásmidos yo'osal ultrasonidos
Ka le muestras ADN someten ondas ultrasónicas, le vibraciones generadas tumen ultrasonidos crean cavitación acústica ti' le líquido tu ch'a'akal wa pa' le moléculas ADN ka'anal peso molecular yéetel mecánicas muuk'. Le sonicación jach le método asab utilizado ti' le experimentos cizallamiento masivo ti' ADN, incluidas aplicaciones, bey le inmunoprecipitación cromatina (ChIP), utia'al le tamaños fragmentos mejen le absolutamente cruciales tia'al jump'éel ka'anal resolución. (cf. Tseng et ti' le., 2012).
Le ADN plasmídico (ADNp) leti' jump'éel bix específica u ADN, ku caracteriza tumen u beyo' ts'ipit k'ab yéetel Kula'an ti' bacterias yéetel yaan eucariotas.
Le ADNp superenrollado jach u páajtalil deseada ADN plasmídico, ts'o'ok u ye'esik ti' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob ti' le procesos yéetel, bey le secuenciación yéetel u le transfección automatizadas. Le ultrasonicación jach úuchuk utia'al fragmentar belal le ADNp, incluido ADNp superenrollado.
Thompson et ti' le. (2008) demostraron ti' le sonicación plásmidos, Ba'ax u yoojel fragmenta le ADN superenrollado, leti' jump'éel bix xoknáalo'obo' u ma'alo'obkíinsiko'ob le longitudes xooka' le secuencia phred20 tak le ch'aaj u ma' ken significativamente jejeláas plantilla kaambalil yo'osal u Beckman Coulter wa ti' le plásmidos linealizados enzimáticamente.
- Controlable yéetel precisión
- Ya'ala'al máaxo'ob máano'ob reproduc
- Ajustable ti' le longitudes fragmentos ADN objetivo
- Kaambalil yo'osal u temperatura
- Escalable u je'el Buka'aj muestra
Búukinta'al vectores plásmidos
Le plásmidos ku utilizan tu menudo bey nu'ukul utia'al clonar, transferir yéetel ku manipular genes. Ka le plásmidos ku utilizan experimentalmente ti' le fines, ku denominan vectores. Le fragmentos ti' ADN wa genes ku páajtal insertar ti' jump'éel vector plásmido, creando llamado plásmido recombinante. Le vectores plásmidos ku utilizan bey kisbuuts'o'ob utia'al u conducir le ADN recombinante ti' jump'éel célula huésped yéetel le jump'éel componente clave ti' le clonación molecular.
“Le vectores ma' virales táan siendo ampliamente estudiados tumen u páajtal búukinta'al ti' le terapia génica utia'al u k'aax kúuchilo'ob k'aas k'oja'anilo'obo' complicadas. Le vectores ma' virales protegen le ADN plasmídico xu'ullsa'al le degradación a, química yéetel enzimática ka entregan u molécula u ADN u objetivo le ts'ono'oto'. Je'ebix, le liposomas catiónicos, le quitosano yéetel uláak' nanopartículas cargadas positivamente táakpajalo'ob complejos yéetel le ADN plasmídico yéetel interacciones electrostáticas. Ba'ale' le complejos liposomas catiónicos leti' ADN plasmídico ba'ax ku táakpajalo'ob uchik Nuuktak relativamente (es decir 300-400 nm) yéetel ku heterogénea, ba'ax ku beetik talam u búukinta'al ti' aplicaciones farmacéuticas. Le complejos nukuch ka heterogéneos u ADN leti' liposomas, ADN plasmídico leti' aerosoles yéetel ADN plasmídico leti' péptidos páajtal xu'ulsiko'ob ku partículas asab mejen yéetel homogéneas yo'osal ultrasonidos.” (Sarker et ti' le., 2019).
Juntúul ejemplo destacado ti' u búukinta'al vectores plásmidos jach CRISPR-Cas9. Le yaan CRISPR-Cas9 ku u administra ti' le células bey juntúul chéen plásmido nojoch wa ya'ab plásmidos asab mejen u codifican jump'éel secuencia objetivo, jump'éel náakake' u yaak'il CRISPR ka Cas9.
Preparación ultrasónica u nanopartículas u PLGA cargadas u ADN yo'osal nanoprecipitación
Jo et ti' le. (2020) utilizaron ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) utia'al formar jump'éel portador nanopartículas yo'osal u ma'alo'ob meyaj ku beetik jump'éel plásmido bix u CRISPR-Cas9 ti' macrófagos primarios derivados ti' le médula ósea. Utia'al u nanoprecipitación nanopartículas PLGA, u utilizaron PLGA yéetel ka'ap'éel ku finales jejeláas (ku éster yéetel aminas) yéetel u le tapas u amina cargadas positivamente aumenten eficiencia encapsulación yéetel kuuch debido a le interacciones kuuch ichil táan u yéetel le columna vertebral cargada negativamente ti' le ADN. Ti' jump'éel tubo centrífugo cónico ti' polipropileno 50 mL, u disolvieron 100 mg Pluronic F127 ti' 20 mL ja' desionizada esterilizada ti' autoclave yo'osal mezcla ti' vórtice, seguida ti' 30 min sonicación O'olkij yo'osal jump'éel wichkíil ultrasónico ().wil CupHorn). Ku añadió jump'éel barra agitadora magnética esterilizada ti' autoclave yéetel le solución j-xa'ak'pajij u 600 RPM ti' 30 min ka' jo'op' u elaboraban le ya'ab soluciones. Ku utilizó xooko'obo' laboratorio plástico kúuchil cristal utia'al u minimizar le adsorción inespecífica ti' ADN. Le soluciones ku PLGA disueltas ti' DMF (44,48 mg leti' ml) yéetel TIPS pentaceno disuelto ti' THF (0,667 mg leti' ml) ku elaboraron tumen separado. Le PLGA tu cha'aj u inactivo ti' DMF ti' 30 minutos bey ma' u sonicado ti' 30 min. (utia'al u protocolo k'iini', wilik u Jo et ti' le., 2020).
- Extracción de ADN
- Encapsulación le ADN
- Dispersión ADN recubierto u nanopartículas
- U ADN plasmídico u k'u'ubul ti' le células
Le UP200St CupHorn utia'al u sonicación indirecta ti' muestras, je'ebix, yo'osal le extracción yéetel fragmentación ADN.
Protección le ADN plasmídico ti' le sonicación
Le ADN, incluidos le plásmidos yéetel le plásmidos superenrollados, Jach ma'alob sensible ti' le degradación. Tuláakal le métodos u fragmentación disponibles le u k'ajóolta'ano'ob tumen u desventajas. Le fragmentación ultrasónica ti' le ADN jach juntúul ti' le métodos preferidos, ts'o'ok u le sonicación controlada ti' combinación yéetel ba'axo'ob tu kano'ob ti' protección Cha' u xu'ulsiko'ob le loob le hebras ADN inducido tumen le cizallamiento yéetel le ooxoj.
Beyxan ti' kaambalilo'ob le ajustes baja amplitud, le modo pulsación yéetel le kaambalil yo'osal le temperatura ichil le cizallamiento ultrasónico ti' le ADN, u búukinta'al ciertos agentes tu ye'esaj jump'éel efecto protector significativo xu'ulsik u degradación le ADN. Je'ebix, ya'ab polímeros, péptidos yéetel lípidos protegen le ADN plasmídico ti' le ultrasonicación.
Le estabilidad ti' le ADN plasmídico yéetel le nanocomplejos ku ADN leti' IL plásmidos kíinsa'ab tu táan le esfuerzo cizallamiento ultrasónico ku investigó yo'osal jump'éel ensayo electroforesis ti' gel agarosa. Tuukulo'oba' le ADN plasmídico bey le nanocomplejos u ADN plasmídico leti' IL plásmidos ku sometieron ti' jump'éel esfuerzo cizallamiento ultrasónico ichil jejeláas ti'its temporales. Le ADN plasmídico ku expuso ti' jump'éel esfuerzo cizallamiento ultrasónico ti' 0, 10, 20, 30 yéetel 40 minutos. Ba'ale' le nanocomplejos ADN leti' IL ti' le plásmido ku expusieron ti' jump'éel esfuerzo cizallamiento ultrasónico ti' 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 yéetel 120 minutos.
(xook yéetel wíimbala': ©Sarker et ti' le., 2019).
Sarker et ti' le. (2019) demostraron ba'ax ken le nanoestructuras ADN plasmídico leti' líquido iónico (pDNA leti' IL) ku sometieron ti' jump'éel esfuerzo cizallamiento ultrasónico ti' 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 yéetel 120 min yéetel u complejaron yéetel le aj nu'uktaj u genes catiónicos u disponible comercialmente lipofectamina k'u'ubul, le porcentaje células fluorescentes u positivas j-le 80 ti chúumuk, 98 ti chúumuk, 97 ti chúumuk, 85 ti chúumuk, 78 ti chúumuk, 65 ti chúumuk, 65 ti chúumuk yéetel 50 ti chúumuk, respectivamente (wilik u gráfico uláak'). Le porcentaje células fluorescentes u positivas aumentó ka le nanoestructuras ku sometieron ti' jump'éel esfuerzo cizallamiento ultrasónico ichil 10 yéetel 20 min, ka posteriormente Jáatspaj Chaambel.
Influencia le líquido iónico [Bmim] [PF6] ti' u k'u'ubul ADN plasmídico ti' le células COS7. Le nanocomplejos ADN plasmídico leti' IL (líquido iónico) ku sometieron ti' jump'éel esfuerzo cizallamiento ultrasónico ichil jump'éel k'aas 120 minutos yéetel ku complejaron yéetel le bey ma' k'ubik le le células COS7. Le datos muestran le meyaj ku taamedio () tu células HeLa positivas utia'al u GFP contadas ichil 10 sikte microscópicos jejeláas yéetel le experimento ku beetajo' ya'abkach Óoxten ti' óoxp'éel jejeláas k'iino'ob. (Xook yéetel gráfico: ©Sarker et ti' le., 2019).
Le ADN plasmídico je'el wáaj u añadiendo juntúul aj nu'uktaj bey ma' u fragmentación ultrasónica: degradación inducida tumen sonicación ti' le ADNp desnudo (U) yéetel le ADNp formulado yéetel 1,5 mM CaCl2 yéetel 20 ti chúumuk (v leti' v) u t'aano'-butanol (B).
Le muestras ku sonicaron yéetel juntúul sonda 20 W ichil jump'éel k'aas 120 segundos, bey u indica tu superior Amal carril. Le carril H ichil le marcador le Hiperescalera I ™️. Le bandas u plásmidos OC yéetel SC u indicadas.
(xook yéetel máak: ©Wu et ti' le., 2009).
Wa u lisado ultrasónico wa u meyaj
Protocolo lisis t'aan ultrasónica
Ken káaje' yéetel juntúul muestra enriquecida u células u beet yo'osal jump'éel método separación t'aan (je'ebix, separación t'aan inmunomagnética, tsoolil jejelas t'aan activada tumen fluorescencia (FACS), centrifugación ti' gradiente densidad ti', aislamiento t'aan tumen inmunodensidad).
Le muestras células k'a'abéet u we'esik jump'éel volumen tampón lisis bixake' apropiado yo'osal le ba'ax ku kaxtik experimental yéetel le ultrasonido bin yano'ob sonda.
Ku prefieren le tampones hipotónicos, ts'o'ok u mejoran le lisis t'aan ultrasónica. Páaybe'en ti' le aditivos yéetel le concentración ta'ab u utilicen u bix ken úuchuk.
Seleccione u dispositivo lisis ultrasónica: utia'al u sonicación indirecta u viales, ku recomiendan le VialTweeter wa le CupHorn. Utia'al le placas pocillos ya'ab k'oja'ano'ob, le UIP400MTP ultrasonido beetike' uts. Yéetel u sonicación clásica u bin yano'ob sonda, jump'éel homogeneizador ultrasónico bey le UP100H wa le UP200Ht yéetel micropunta le asab adecuados.
Protocolo utia'al u sonicación bin yano'ob sonda: Introduzca le sonda ultrasonicadora ti' le volumen muestra jump'éel tubo microcentrífuga yéetel sonique ti' jump'éel 10 segundos. Dependiendo de le muestra ADN, u sonicación u repetir u wa Óoxten asab. Yaan tu energía ultrasónica jool requerida (Ws leti' mL) yaantal yo'osal u le viscosidad ti' le muestra yéetel le bin yano'ob ADN. Enfriamiento yo'osal wichkíil hielo yéetel le modo pulsación ti' le ultrasonido ku yáantiko'ob Jech ti' le muestra ku degrade térmicamente.
Ka' ts'o'ok u lisis ultrasónica, le muestra ku centrifuga utia'al u separar le jaantik yáalab gránulos (u ya'alik células ma' lisadas, núcleos yéetel orgánulos ma' lisados).
Wa u muestra ma' u procesa inmediatamente, ku páajtal almacenar ti' jump'éel temperatura úuchuk utia'al preservar u viabilidad.
Ultrasonidos utia'al u fragmentación le ADN
Hielscher Ultrasonics k'u'ubul ya'abkach plataformas ku basadas tu ultrasonidos utia'al u fragmentación ADN, ARN yéetel cromatina. Táan a jejeláas plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones sonicación indirecta utia'al u preparación simultánea ti' muestras ti' ya'ab k'oja'ano'ob tubos wa placas ya'ab pocillos (je'ebix, placas u 96 pocillos, placas microtitulación), sonorreactores yéetel cuphornes ultrasónicos. Tuláakal le plataformas utia'al u cizallamiento u ADN u impulsadas tumen procesadores ultrasónicos u ka'anal rendimiento yéetel frecuencia ajustada, ba'ax ku páajtal controlar yéetel precisión yéetel ku ts'abal ya'ala'al máaxo'ob máano'ob reproducibles.
Procesadores ultrasónicos yo'osal je'el meyaj ku Buka'aj muestra
Yéetel le ultrasonidos multimuestra Hielscher VialTweeter (utia'al tak 10 tubos u ensayo) yéetel UIP400MTP (utia'al microplacas leti' placas multipocillos), jach páajtal xu'ulsiko'ob uchik u k'iinil procesamiento muestras óolal ti' Jaajal jump'éel ultrasonicación intensa yéetel controlable yéetel precisión, yaan u yúuchtal u obtiene u distribución le Buka'aj yéetel le rendimiento deseados ti' le fragmentos ADN. Le fragmentación ultrasónica ti' le ADN ku beetik le wook wa u plásmidos yilik k'áati' eficientes, fiables yéetel escalables. Le tsoolil bix u páajtal escalar linealmente ti' jump'éel u ya'abkach muestras yo'osal le ka'anatako'ob parámetros u ultrasonido constantes.
Le ultrasonidos sonda uno ti' cinco yaal le ideales utia'al u wa u asab mejen muestras. Le ultrasonidos laboratorio Hielscher u disponibles yéetel jejeláas niveles ti' potencia utia'al u páajtal u elegir le disruptor ultrasónico beetike' uts utia'al u ka'anatako'ob relacionada yéetel le ADN.
Le unidad preparación ultrasónica ti' muestras ya'ab k'oja'ano'ob VialTweeter Cha' le sonicación simultánea u tak 10 viales. Yéetel le dispositivo pinza VialPress, ku páajtal presionar tak 4 tubos adicionales tu delantera ti' jump'éel sonicación intensa.
Kaambalil yo'osal preciso ti' le tuukula'
Le ajustes u sonicación controlables yéetel precisión ku cruciales, ts'o'ok u jump'éel sonificación exhaustiva u destruir le ADN, le ARN yéetel le cromatina, ba'ale' jump'éel cizallamiento ultrasónico inadecuado ts'aik kúuchil ti' fragmentos ADN yéetel cromatina jach chowaktako'ob. Le ultrasonidos digitales ti' Hielscher páajtal ajustar u uchik u parámetros u sonicación unajilo'ob tu'ux yaan. Le ajustes específicos ti' sonicación xan páajtal ooks u bey ajustes programados ti' jump'éel repetición rápida u yéet procedimiento.
Tuláakal le sonicaciones ku protocolizan automáticamente yéetel u almacenan bey archivo CSV ti' jump'éel tarjeta SD incorporada. Le je'ela' ku cha'antik jump'éel ju'uno'ob precisa ti' le ensayos realizados yéetel ku cha'antik xíixtik, uchik le tiradas sonicación.
Ti' le kaambalil yo'osal remoto ti' le navegador, le ultrasonidos digitales páajtal manejar u ka supervisar ti' je'el navegador estándar. Ma' jach k'a'abeto'ob le instalación software adicional, ts'o'ok u le conexión LAN le jump'éel configuración plug-n-play jach sencilla.
Wóolis facilidad búukinta'al ti' u ultrasónica wa u yilik le ADN
Tuláakal le ultrasonidos Hielscher u diseñados utia'al u ts'aik ultrasonidos u ka'anal rendimiento, siendo ti' le k'iino' je'el xano' k'iin jach fáciles biilankiltej yéetel u manejar. Le ajustes táan ma'alob estructurados ti' jump'éel menú jul, le tu u páajtal tsáabaltio'ob áantaj uchik ti' jump'éel pantalla táctil u boonil wa jump'éel mando u nachil ti' le navegador Cancún. Le software na'at yéetel ajustes programables yéetel registro automático u datos garantiza jump'éel ajustes sonicación óptimos tia'al ya'ala'al máaxo'ob máano'ob fiables ka reproducibles. Le interfaz menú, Cho' yéetel ch'a'abil u biilankiltej, p'áatal le ultrasonidos u Hielscher ti' dispositivos fáciles ti' biilankiltej yéetel eficientes.
Le uláak' tabla ku ts'aik ti' jump'éel indicación le Buka'aj u ba'al u procesamiento aproximada u k ultrasonidos laboratorio yo'osal le lisis t'aan yéetel u fragmentación le ADN:
| Volumen lote | Gasto | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| Placas pocillos ya'ab k'oja'ano'ob. | N/A | UIP400MTP |
| viales ti', vaso u precipitados pequeño | N/A | cupHorn ultrasónico |
| Tak 10 viales | N/A | VialTweeter |
| U 1 u 500 ml | U 10 ti' 200 ml leti' min | UP100H |
| U 10 ti' 2000 ml | Ti' 20 u 400 ml leti' min | UP200Ht, UP400St |
Xook k! Leti' k'áatiko'ob k!
Bibliografía leti' Referencias
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
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- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
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- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Datos u tojol le su'utalil K'ajóolt
Ba'ax ku le plásmidos.
Jump'éel plásmido jach chan molécula circular ADN u táan físicamente separada ti' le ADN cromosómico yéetel u replica bix independiente. Le plásmidos tu menudo ku taj yéetel genes contribuyen le supervivencia jump'éel organismo yéetel imparten ventajas específicas, je'ebix, resistencia ti' le antibióticos. Le plásmidos lu'umo'oba' asab comúnmente bey mejen moléculas circulares u ADN naaj tsolokbal ti' le bacterias; Ba'ale' le plásmidos Yaan k'iine' u presentes ti' arqueas yéetel áantajilo'ob eucariotas. Le plásmidos ku nu'ukulo'ob importantes ti' biología molecular, genética, bioquímica yéetel ciencias u kuxtal. K'ajóolta'ano'ob bix vectores ti' ingeniería genética, le plásmidos ku utilizan utia'al replicar wa expresar ciertos genes. Le alteración dirigida ti' jump'éel vector denomina ku diseño vectorial.
Análisis u GFP ti' le investigación t'aan
Le proteína ya'ax fluorescente (GFP) leti' jump'éel marcador biológico versátil utia'al u monitorear procesos fisiológicos, visualizar localización proteínas yéetel ku detectar le expresión transgénica in kuxa'an. Le internet ichil láser 488 nm u excitar le GFP yéetel u detecta yaanal bix u óptima u 510 nm.
Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos u ka'anal rendimiento ichil laboratorio Utia'al Buka'aj industrial.