Wa u muestras ka'anal rendimiento utia'al u diagnóstico mitocondrial yilik
Le diagnóstico mitocondrial ti' investigación yéetel clínicas Meyajta'ab utilizando kúuchilo'ob yo'osal bix u secuenciación, le PCR yéetel le ensayos bioquímicos. Le métodos ku utilizan utia'al u identificar mutaciones ti' le ADN yéetel P'iis le función mitocondrial. Le secuenciación ku yáantik detectar mutaciones genéticas, ka' jo'op' u le PCR je'el u páajtal u cuantificar secuencias específicas u ADN. Le ensayos bioquímicos evalúan funcionalidad ti' le proteínas yéetel enzimas mitocondriales.
Le diagnóstico le k'aas k'oja'anilo'obo' mitocondriales toop especialmente debido a le pronunciada variabilidad clínica ti' le k'aas k'oja'anilo'obo', bey je'el bix debido a le ma'alob interacción ichil ka'ap'éel genomas heredados u kin tuukul jela'an: le ADN mitocondrial (ADNmt) yéetel le genoma nuclear.
Extracción ka fragmentación u ADN yo'osal sonicación
Le extracción ADN u wa'ak'al muscular jach particularmente útil ka sospechan cambios específicos ti' u wa'ak'al ti' le ADNmt. Le cambios táan u béeytal u incluir deleciones u ADNmt ti' le oftalmoplejía externa progresiva crónica (CPEO), mutaciones puntuales ti' le ADNmt ti' miopatías mitocondriales wa depleción u ADNmt ti' le síndrome Alpers. Le ADN extraído ti' u wa'ak'al muscular ku páajtal utilizar utia'al u kúuchilo'ob pruebas genéticas, bey le transferencia Southern yéetel le PCR chowak alcance ti' le deleciones, le PCR tu k'iinil xíimbal tumen utia'al u agotamiento wa u secuenciación ti' le mutaciones puntuales.
Le sonicación yo'osal ondas ultrasónicas intensas, u aplica utia'al ya'abkach aplicaciones ti' le diagnóstico mitocondrial. Ku meyajtiko'ob utia'al lisar células utia'al u extraer contenidos intracelulares bey mitocondrias yéetel ADN, ch'ak ADN bey le ADNmt yéetel le ADNn utia'al u secuenciación, ka utia'al homogeneizar muestras.
UIP400MTP Sonicador placas utia'al wa u muestras ka'anal rendimiento yilik Sonica uniformemente muestras ti' placas ya'ab pocillos u 96 pocillos
Bix aislar le mitocondrias ti' le células yéetel le jach
Le aislamiento mitocondrial consta u ka'ap'éel wook tu láakal: interrumpir le células utia'al u liberar u contenido ka emplear le centrifugación diferencial ti' separar yéetel recuperar le fracciones mitocondriales.
sonicación
Le sonicadores Hielscher ku compatibles yéetel le tampones yéetel kits lisis estándar, ba'ax ku beetik adecuados utia'al u aislamiento mitocondrias. Le sonicación yaan ka'ap'éel propósitos k'ajle':
- Lisis t'aan: Le ondas ultrasónicas rompen le membranas celulares, liberando contenido intracelular.
- Disrupción mitocondrial: Le sonicación ti' jump'éel paso posterior je'el u páajtal u jaatik le mitocondrias utia'al u liberar proteínas mitocondriales wa ADN mitocondrial.
- Fragmentación ti' le ADNmt: Le sonicación jach jump'éel láaka fiable ch'ak le ADN mitocondrial utia'al u secuenciación.
Le sonicador placa multipocillo u UIP400MTP cha'antik wa u muestras mitocondriales u ka'anal rendimiento yilik. Yéetel u centrifugación diferencial, le sonicación mejora u eficiencia le aislamiento mitocondrial, síijil ka'anatako'ob rendimientos u mitocondrias intactas adecuadas utia'al u kúuchilo'ob aplicaciones yéetel.
Hielscher UIP400MTP sonicador placas multipocillos Meyaj yéetel je'el placa estándar
Le sonicador placa multipocillo u k'UIP400MTP'ubul numerosas ventajas utia'al wa u muestras ka'anal rendimiento, yilik je'ebix, ti' le diagnóstico mitocondrial.
UIP400MTP Sonicador placa multipocillo utia'al wa u muestras ka'anal rendimiento ti' le diagnóstico biomarcadores yilik.
T'aano'ob ejemplares utia'al u fragmentación ultrasónica ti' le ADNmt
Preparación ka extracción:
- Le ch'o'obo' C57BL leti' 6 kíimo'ob tumen dislocación máak.
- Le hígados ku extrajeron jáan yéetel u p'o'ob ti' PBS estéril u síis.
Aislamiento mitocondrias:
- Le mitocondrias ku aislaron utilizando jump'éel molinillo wa'ak'al Dounce 2 mL yéetel juntúul kit aislamiento mitocondrias utia'al u wa'ak'al.
- Centrifugación inicial u 700× g yéetel 3.000× g.
- Betaj ka'ap'éel wook u p'o' adicionales yéetel tampón kuxtal
Aislamiento u ADN:
- Le pellet le yáax centrifugación ti' 700× g u utilizó utia'al u aislar le ADN nuclear (ADNn).
- Le ADN ku aisló utilizando columnas espín.
- Le ADN mitocondrial (ADNmt) ku extrajo mitocondrias aisladas.
- Le ADN nuclear (ADNn) ku extrajo extractos nucleares crudos, xan wa'ak'al hepático ch'o'.
Fragmentación le ADN:
- Le ADN ku fragmentó tu hielo utilizando jump'éel sonicador ultrasónico UP50H 30 kHz leti' 50 W yéetel juntúul sonotrodo micropunta 0,5 mm ti' 14 μm ichil 2 × 30 segundos.
Fragmentación, visualización yéetel cuantificación:
- Le fragmentación paach le ultrasonificación ku visualizó jump'éel gel agarosa ti' le 1 ti chúumuk yéetel colorante ADN seguro SYBR.
- Le loolo'ob relativa ADNmt yéetel ADNn ku determinó yo'osal qPCR.
(cf. Mariero et ti' le., 2019).
Utia'al u wa u muestras ka'anal rendimiento yilik, le sonicador placas multipocillo UIP400MTP u facilita wa u yaan xan ya'abach muestras ti' placas estándar 96 pocillos, multipocillos yéetel microtitulación yilik.
Obtenga a wojeltik yóok'ol le ventajas wa u muestras ka'anal rendimiento yéetel le UIP400MTP yilik.
Consejos ti' jump'éel aislamiento óptimo ti' le mitocondrias yo'osal sonicación:
- Kaambalil yo'osal temperatura: Betaj tuláakal le wook ti' jump'éel rango temperatura 0 ° C ti' 4 ° kuxtal Le ba'ala' Páaybe'en utia'al u mantener le integridad yéetel u funcionalidad le mitocondrias.
- Eficiencia yéetel xookilo'ob: Meyajnakech jáan ka purifique le mitocondrias chéen tu p'iss bey requerida utia'al u ka'anatako'ob específica. Le manipulación excesiva je'el u páajtal u conducir pérdidas significativas ti' le contenido mitocondrial.
- Dilución suspensiones: Mantener bajas concentraciones suspensiones celulares yéetel orgánulos ichil tuláakal le tuukula' aislamiento. Le je'ela' ku yáantik minimizar le riesgos atrapamiento yéetel aglutinación, ma'alobkiinsik bey u pureza le mitocondrias aisladas.
- Volumen le muestra: Opte tumen ya'abkach preparaciones u chan escala kúuchil jump'éel tin juunal nojoch. Le enfoque suele u ts'áaj kúuchil ti' rendimientos, ts'o'ok u aumento le escala ma' aumenta proporcionalmente cantidad mitocondrias recuperables. Le sonicador placa multipocillo UIP400MTP facilita le lisis rápida yéetel fiable ti' le células utia'al u aislamiento le mitocondrias, bey le extracción proteínas le mitocondrias.
Táan a directrices yaan u le tuukula' aislamiento yo'osal lisis ultrasónica yéetel centrifugación bixake' asab eficiente, produciendo preparaciones mitocondriales u ka'anal calidad ti'alo'ob utia'al aplicaciones yéetel.
Sonicadores u Hielscher – Calidad Made in Germany
Le ultrasonidos Hielscher le u k'ajóolta'ano'ob tuméen u asab ka'anatako'ob estándares calidad yéetel diseño. Le robustez yéetel le facilidad ch'a'iko'ob permiten jump'éel integración fluida u k ultrasonidos ti' kúuchilo'ob industriales. Le condiciones adversas yéetel le entornos exigentes le uchik manejables tumen le ultrasonidos Hielscher.
Hielscher Ultrasonics le jump'éel empresa yéetel certificación ISO yéetel ts'áabal yaabilajech énfasis ti' le ultrasonidos ka'anal rendimiento kisbuts' ma'alo'obtal máax k'oja'an yéetel facilidad búukinta'al. Ba'axten supuesto le ultrasonidos Hielscher cumplen yéetel le normativa CE yéetel cumplen le requisitos UL, CSA yéetel RoHs.
Sonicador placa 96 pocillos UIP400MTP utia'al u sonicación placas microtitulación yéetel multipocillos
Bibliografía leti' Referencias
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
K'áat chi'oba' frecuentes yóok'ol le mitocondrias yéetel le diagnóstico mitocondrial
Ba'ax ku le mitocondrias.
Le mitocondrias ku orgánulos unidos ti' le membrana lu'umo'oba' ti' le células óol tuláakal le máasewáalo'obo' ku eucariotas áantajilo'ob. U ti' leti'e', k'ajolo'on bey le centrales eléctricas ti' le célula tuméen ku ts'áiko'ob energía ti' bix u trifosfato adenosina (ATP) yéetel le tuukula' respiración t'aan. Ku ts'o'okole', le mitocondrias yaan u leti'ob ADN yéetel desempeñan jump'éel ju'un clave ti' uláak' procesos celulares, incluida u regulación le ciclo t'aan yéetel u kíimile' t'aan.
Ba'ax ka jela'anil in u ADNmt le ADN genómico.
Le ADN mitocondrial (ADNmt) difiere ti' le ADN genómico (ADNg) tu ya'ab aspectos clave. Le ADNmt ku yaantal ti' le mitocondrias, le circular yéetel u hereda tuméen yóol materna, ka' jo'op' u le ADNg ku yaantal ti' le núcleo le célula, le lineal yéetel u hereda u je'el yúumo'ob. Le ADNmt jach asab chichan yéetel codifica chéen 37 genes, ka' jo'op' u le ADNg ku taasik ichil 20.000 yéetel 25.000 genes. Le ADNmt táan presente ti' ya'ab k'oja'ano'ob copias tumen célula, yaan jump'éel tasa mutación asab ka'anal yéetel codifica chuunil laat'a'an proteínas involucradas ti' le función mitocondrial. Tuméen le contrario, le ADNg suele u diploide, yaan jump'éel tasa mutación asab baja yéetel codifica amplia gama genes k'a'abeto'ob yo'osal le ma'alo'ob u función le organismo. Ku ts'o'okole', le transcripción yéetel traducción u ADNmt u yaantal ichil le mitocondrias, ka' jo'op' u transcripción le ADNg ku yaantal ti' le núcleo yéetel le traducción ku yaantal ti' le citoplasma. Táan a diferencias reflejan u distintos roles yéetel orígenes evolutivos.
Ba'ax le le extracto libre ti' células.
Juntúul extracto libre células jach jump'éel solución ba'ax ku taasik le contenido le células lisadas, incluidas proteínas, ácidos nucleicos yéetel uláak' componentes celulares, ba'ale' ma' membranas celulares u intactas. Le extracto ku meyajtiko'ob ti' le investigación bioquímica yéetel u biología molecular utia'al u xook le procesos celulares in vitro, ba'ax ku cha'antik le investigadores analizar le reacciones yéetel le mecanismos paach le células vivas.
Ba'ax ka ju'un báaxal le pruebas u PCR ti' le diagnóstico mitocondrial.
Le pruebas PCR desempeñan jump'éel ju'un fundamental ti' le diagnóstico mitocondrial ti' le permitir detección ti' mutaciones, deleciones wa variaciones ti' le meyaj ku copias ti' le ADN mitocondrial (ADNmt). Permiten le amplificación regiones específicas ti' le ADNmt utia'al u identificar variantes patógenas asociadas yéetel trastornos mitocondriales. Le kaambalilo'ob basadas ti' PCR, bey le PCR cuantitativa (qPCR) yéetel le PCR chowak alcance, bey xan u utilizan yo'osal Trauma u integridad le ADNmt, le niveles heteroplasmia yéetel u agotamiento le ADNmt, proporcionando a'alajil t'aan tuukulo'obo' yóok'ol le función mitocondrial yéetel le k'oja'anil.
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Ba'ax le le centrifugación diferencial.
Le centrifugación diferencial jach jump'éel láaka ampliamente utilizada yo'osal le ku t'aan yéetel le aislamiento mitocondrial. Le método separa le ka'ansaj celulares en función de u coeficiente sedimentación, ku yaantal yo'osal tuukulo'oba' ti' le densidad bix u u páajtalil. Le tuukula' implica ka'anatako'ob jejeláas niveles ti' muuk' centrífuga ti' muestras ti' soluciones salinas tamponadas yéetel densidades específicas. Le ka'ansaj yéetel coeficientes u sedimentación similares ku asentarán ti' u yiit le tubo recolección ti' le k'iino' je'el xano' k'iin, ku permitirá u recuperación.
Bix u meyajtiko'ob le centrifugación diferencial ti' le aislamiento mitocondrias.
Le centrifugación diferencial Cha' u le investigadores separar eficazmente le fracciones mitocondriales ti' uláak' componentes celulares. Le aislamiento le mitocondrias implica ya'ab wook centrifugación yéetel le posterior recuperación le aislado.
Centrifugación inicial: Aplique jump'éel muuk' centrífuga baja utia'al u sedimentar desechos yéetel núcleos celulares u nukuch.
Centrifugaciones yéetel: Ya'abtal u muuk' centrífuga bix u escalonada le fracciones u pellets enriquecidas yéetel mitocondrias. Amal paso centrifugación elimina ka'ansaj yéetel coeficientes u sedimentación progresivamente asab ka'anatako'ob.
Recuperación fracciones: Ka' Amal centrifugación, u Mool le gránulo yéetel le sobrenadante ku somete u muuk' g asab altas utia'al u aislar le uláak' fracción. Le je'ela' ku repite tak ka logra le pureza deseada ti' le mitocondrias.