Lisis ultrasónica u muestras Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster le ampliamente utilizada ti' laboratorios bey organismo bix. Tune', le wook preparación preanalítica bey le lisis, le disrupción t'aan, le extracción proteínas yéetel u cizallamiento u ADN le muestras Drosophila melanogaster k'a'abéet bisik u ka'ansaj con frecuencia. Le desmembradores ultrasónicos ku fiables yéetel eficientes ka páajtal utilizar u utia'al u kúuchilo'ob tareas, bey le lisis, le extracción proteínas wa u fragmentación le ADN yéetel chéen ajustar parámetros le tuukula' ultrasónico. Tune', le homogeneizadores ultrasónicos le nu'ukulo'ob flexibles yéetel amplia gama aplicaciones.

Lisis ultrasónica yéetel extracción proteínas

Le lisis, le solubilización t'aan, le homogeneización jach yéetel le extracción proteínas le tareas típicas ti' le desmembradores ultrasónicos ti' le laboratorios biológicos. Le desmembradores ultrasónicos yéetel le disruptores celulares le jach adecuados utia'al homogeneizar jach animales, yik'elo'obo' (je'ebix, Drosophila melanogaster, kuxtal elegans) wa especímenes paak'alo'ob. Le aplicaciones yéetel u le ultrasonicación ku lisis suspensiones celulares yéetel pellets, bey le extracción proteínas intracelulares.
Le lisis ultrasónica yéetel le extracción proteínas le procesos ma'alob fiables yéetel reproducibles, u páajtal u u yóok'ol le k'oja'ano'obo' tsoolil bix establecidos. Dado u intensidad le tuukula' ultrasónico u ajustar u exactamente yéetel parámetros sonicación bey le amplitud, le modo ciclo leti' pulso, le temperatura yéetel le volumen le muestra, le tsoolil bix juntéene' probados páajtal repetir u yéetel u yéet resultado jump'éel y otra ka'.

Fragmentación ultrasónica ADN yéetel ARN

Ka' ts'o'ok u lisis t'aan yéetel le extracción proteínas, jump'éel paso común requerido ti' wa u muestras yilik leti' le cizallamiento yéetel u fragmentación le ADN, le ARN yéetel le cromatina je'ebix, bey ma' inmunoprecipitación cromatina (ChIP). Fragmentación le ADN yéetel le ARN ku páajtal kaxta'al u yúuchul ti' kin tuukul confiable t'aakik le covalentes K'aanan u mantienen unido le ADN yo'osal muuk' meyajtbilo'. Yo'osal le cizallamiento ka'ap'éel, bey le sonicación, yaan u principio u rompen le hebras ADN, ts'o'okole' le ADN ku fragmenta ti' trozos asab mejen.
Le fragmentación ultrasónica ti' le ADN jach fiable yéetel xoknáalo'obo' utia'al u cizallar le ADN tak jump'éel longitud específica, je'ebix, 500 pb (pares bases). Le k'ajle' ventajas le fragmentación ultrasónica ti' le ADN incluyen le kaambalil yo'osal preciso ti' le parámetros yéetel le intensidad le tuukula' ultrasónico. Le parámetros le tuukula' ultrasónico páajtal ajustar ku ajustando yéetel precisión u intensidad le sonicación, le ciclos yéetel le k'iin. Le je'ela' ku cha'antik crear le tamaños u ADN deseados yéetel le longitud ADN objetivo u producir u ka reproducir bix fiable. Le cizallamiento ultrasónico ti' le ADN xan le beetike' uts ch'a'iko'ob fragmentos ADN ka'anal peso molecular.

U tsoolil bix utia'al u lisis ultrasónica u Drosophila melanogaster

Tu continuación u kaxtik ya'ab tsoolil bix utia'al u lisis asistida tumen ultrasonidos, le extracción proteínas yéetel u fragmentación le ADN wa cromatina muestras Drosophila.

Lisis ultrasónica utia'al u ensayo inmunoprecipitación reticulante (CLIP).

Le ensayo CLIP u beetajo' bix u informó ka'achij yéetel Jayp'éel modificaciones. Yan 20 mg u ovarios hembras bin yano'ob salvaje 0 u 1 k'iin u ts'o'oka'an bino'ob reticulados yéetel UV (3 × 2000 μJ leti' cm2), homogeneizados ti' hielo ti' 1 mL tampón RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl ti', 2,5 mM MgCl2, 0,1 ti chúumuk Triton X-100, 250 mM sacarosa, 1 mM DTT, 1× inhibidores completos ti' le proteasa libres ti' EDTA ti', 1 mM PMSF) suplementados yéetel 300 U RNAseOUT yéetel colocados ti' hielo ti' 30 min. Le homogeneizado ku sonicó ti' hielo, ti' le 80 ti chúumuk potencia, jo'op'éel Óoxten ti' ráfagas 20 s yéetel juntúul descanso 60 s ichil medias utilizando le procesador ultrasónico u Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz). and centrifuged (16000 × g for 5 min at 4°C). Soluble extract was precleared with 20 μl Protein-G dynabeads for 20 min at 4°C. After removal of samples for immunoblotting and quantitation of RNA input (1%), HP1 was immunoprecipitated with anti-HP1 9A9 antibody from 450 μl precleared extract by incubation for 4 h with 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitates were washed 4 times with RCB. To elute the immunoprecipitated RNAs, the pelleted beads were boiled in 100 μL of UltraPure DEPC-treated Water for 5 min. 900 μL Qiazol Reagent was added to the supernatant recovered for RNA preparation. The RNA purified was used as a template to synthesize cDNA using oligo dT, random hexamers and SuperScript reverse transcriptase III according to the manufacturer’s protocol.
(Cassale et ti' le. 2019).

Lisis ultrasónica utia'al u ensayo inmunoprecipitación cromatina

Le inmunoprecipitación cromatina u beetajo' bin le método descrito tumen Menet yéetel mejen modificaciones. Yan 20 mg u ovarios hembras bin yano'ob salvaje 0 u 1 k'iin u ts'o'oka'an u homogeneizaron ti' 1 mL tampón NEB (10 mM u HEPES-Na u pH 8.0, 10 mM NaCl ti', 0.1 mM EGTA-Na u pH 8, 0.5 mM EDTA-Na u pH 8, 1 mM DTT, 0.5 ti chúumuk NP-40, 0.5 mM espermidina, 0.15 mM espermina, 1× inhibidores completos ti' le proteasa libres ti' EDTA) yéetel juntúul homogeneizador leti' dispersor u inmersión 1 min (u 3000 rpm). Le homogeneizado ku transfirió ti' jump'éel vaso preenfriado yéetel aplicaron 15 looxo'ob completos yéetel juntúul mortero apretado. Tu continuación le núcleos libres u centrifugaron u 6000 x g ichil 10 min u 4 ° kuxtal Le gránulos ku contenían núcleos resuspendieron ti' 1 mL NEB yéetel u centrifugaron u 20000 × g ti' 20 min ti' gradiente sacarosa (0,65 mL sacarosa 1,6 M ti' NEB ti', 0,35 mL sacarosa 0,8 ti' NEB). Le pellet ku resuspendió 1 mL NEB yéetel formaldehído tak jump'éel concentración final ti' le 1 ti chúumuk. Le núcleos ku reticularon ichil 10 min u temperatura ambiente yéetel u enfriaron yo'osal le adición 1 leti' 10 vol glicina 1.375 M. Le núcleos ku recolectaron tumen centrifugación u 6000 × g ichil 5 min. Le núcleos p'o'ob ka'atéen ti' 1 mL NEB yéetel u resuspendieron ti' 1 mL tampón lisis (15 mM HEPES-Na u pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA ti', 1 mM EDTA pH 8, 1 ti chúumuk Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1 ti chúumuk Na desoxicolato, 0,1 ti chúumuk SDS, 0,5 ti chúumuk N-lauroylsarcosina yéetel 1× inhibidores completos ti' le proteasa libres ti' EDTA). Le núcleos ku sonicaron utilizando jump'éel procesador ultrasónico u Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz). 6 Óoxten ti' 20 segundos yéetel 1 minuto yóok'ol hielo. Le núcleos sonicados centrifugaron 13000 × g ti' 4 min ti' 4 ° kuxtal Óol tuláakal le máasewáalo'obo' ti' le cromatina sonicada yaan teen jump'éel longitud 500 ti' 1000 pares bases (pb). Utia'al u Amal inmunoprecipitación, u incubaron 15 μg cromatina te' meyajo'ob 10 μg anticuerpo monoclonal HP1 9A9 (3 h u 4 ° C ti' jump'éel Balk'es giratoria). Tu continuación u añadieron 50 μl proteína G yéetel u continuó le incubación ichil áak'abe' u 4 ° kuxtal Le sobrenadantes ku desecharon yéetel le muestras ku p'o'ob ka'atéen ti' tampón lisis (Amal p'o' 15 min 4 ° C) yéetel ka'atéen ti' tampón A (1 mM EDTA ti', 10 mM TrisHCl ti' pH 8). Le cromatina eluyó ti' le perlas ichil ka'ap'éel wook; táanil ti' 100 μl tampón Eluition 1 (10 mM ti' EDTA, 1 ti chúumuk SDS, 50 mM TrisHCl ti' pH 8) u 65 ° C ichil 15 min, seguido centrifugación yéetel recuperación le sobrenadante. Le xooko'obo' le perlas sunaj extraer ti' 100 μl ti' TEECH + 0,67 ti chúumuk SDS. Le eluido combinado (200 μl) ku incubó ichil áak'abe' u 65 ° C utia'al u revertir le K'aanan cruzados yéetel u trató yéetel 50 μg leti' ml u RNasa ichil 15 min 65 ° C yéetel 500 μg leti' ml u proteinasa k'uj ichil 3 h u 65 ° kuxtal Le muestras ku extrajeron yéetel fenol-cloroformo yéetel u precipitaron yéetel etanol. Le ADN ku resuspendió 25 ja μl ja'. Utia'al u maximizar le análisis moleculares yéetel ADN inmunoprecipitado, le genes candidatos ku amplificaron ti' pares ti' jump'éel protocolo optimizado u PCR dúplex yo'osal u búukinta'al ka'atúul conjuntos jejeláas cebadores yéetel temperaturas u fusión similares ti' jump'éel tin juunal reacción.
(Casale et ti' le. 2019).
 

Disruptores celulares ultrasónicos u ka'anal rendimiento utia'al u muestras biológicas

Hielscher Ultrasonics jach u socio yéetel ya'ab yaan ti' ku respecta ti' le ultrasonidos ka'anal rendimiento utia'al u disrupción t'aan, le lisis, le extracción proteínas, u fragmentación le ADN, le ARN yéetel le cromatina, bey je'el bix ti' uláak' wook wa u muestras preanalíticas yilik. Ti' le ofrecer amplia gama homogeneizadores ultrasónicos laboratorio yéetel unidades ti' wa u muestras yilik, Hielscher ti' le dispositivo ultrasónico beetike' uts yo'osal u ka'anatako'ob yéetel requisitos biológicos.
Ultrasonidos clásicos u bin yano'ob sonda yéetel micropunta bey le UP200St (200 W; wil wíimbala' le izquierda) wa jump'éel le kúuchilo'ob wa u muestras yilik tumen ultrasonidos VialTweeter o UP200St_TD_CupHorn yéetel VialHolder ku le modelos favoritos ti' le laboratorios investigación yéetel análisis. Le sonda ultrasónica clásica le beetike' uts, ken u meenta'al menos muestras k'a'abéet u lisadas, extraídas wa fragmentadas. Le kúuchilo'ob wa u muestras VialTweeter yéetel UP200St_TD_CupHorn yilik permiten le sonicación simultánea ti' tak 10 wa 5 viales, respectivamente.
Wa ku k'a'ana'an u procesar jump'éel meyaj ku elevado u muestras (je'ebix, placas u 96 pocillos, placas microtitulación, etcétera), le UIP400MTP Leti' le configuración sonicación beetike' uts. Le UIP400MTP meyaj bey jump'éel cucharno nojochil, ku Chuup ja' yéetel u suficiente kúuchil utia'al u xu'ulsa'al placas micropocillos. Alimentado tumen juntúul potente procesador ultrasónico u 400 vatios, le UIP400MTP k'u'ubul jump'éel sonicación jach xan yéetel intensa u placas pocillos ya'ab k'oja'ano'ob utia'al interrumpir células, lisar muestras, solubilizar gránulos, extraer proteínas wa ku ch'ak ADN.

Kaambalil yo'osal preciso yéetel software na'at

Tuláakal le soluciones sonicación ti' Hielscher ichil 200 vatios u equipadas yéetel juntúul pantalla táctil digital te' boonil yéetel juntúul software na'at. Ti' le protocolo ku datos na'at, tuláakal le parámetros le tuukula' ultrasónico ku guardan automáticamente bey archivo CSV ti' jump'éel tarjeta SD incorporada uts séeb bix u t'ab le ultrasonido. Le je'ela' ku beetik le investigación yéetel le protocolizado k'áati' jach asab convenientes. Ka' le pruebas u sonicación wa u wa u le muestra yilik, je'el yéetel xíixtik, le parámetros sonicación Amal meyajta'ale' sonicación ka comparar le.
Ti' le menú intuitivo, ku páajtal preajustar numerosos parámetros bey ma' le sonicación: je'ebix, utia'al controlar u temperatura le muestra yéetel Jech u degradación térmica, ku páajtal establecer jump'éel límite superior u temperatura le muestra. Juntúul sensor temperatura enchufable, ku tal yéetel le unidad ultrasonidos, proporciona ti' le procesador ultrasonidos a'alajil t'aan yo'osal le temperatura xíimbal tumen u sonicación. Le kéen u chukik le límite superior ti' temperatura, dispositivo ultrasónico u je'elsik tak ka u chukik le límite inferior ti' le ∆T establecido ku ka'a sonar automáticamente.
Wa k'a'abet jump'éel sonicación yéetel jump'éel yaan tu energía específica, u preajustar le energía ultrasónica final ti' le meyajta'ale' sonicación. Ba'axten supuesto le pulsación ultrasónica yéetel le modo ciclo xan ku páajtal ajustar individualmente.
Utia'al u reutilizar u parámetros u sonicación asab exitosos, je'el ooks ya'ab modos sonicación (je'ebix, k'iinil sonicación, intensidad, modo ciclo, etcétera) bey modos preestablecidos, ti' modo u páajtal k'a' máaxo'ob ku ch'a'abil yéetel jáan.
Utia'al u asab comodidad operativa, tuláakal le kúuchilo'ob ultrasónicas digitales páajtal manejar u ti' le mando u distancia ti' je'el navegador común (je'ebix, InternetExplorer, Safari, Chrome, etcétera). Le conexión LAN le jump'éel sencilla configuración plug-n-play ka ma' k'a'abet u instalación software adicional.
Tu Hielscher k ojel u éxito le sonicación muestras biológicas k'a'abet precisión ka repetibilidad. Tune', k diseñado k ultrasonidos bey dispositivos inteligentes yéetel tuláakal le ba'alo'ob ku permiten jump'éel wa u yilik muestras eficiente, fiable, reproducible yéetel tuniche'.

Le uláak' tabla ku ts'aik ti' jump'éel indicación le Buka'aj u ba'al u procesamiento aproximada u k sistemas ultrasónicos, tak micropuntas ultrasónicas yéetel homogeneizadores ultrasónicos clásicos tak ultrasonidos MultiSample utia'al u preparación tuniche' yéetel fiable numerosas muestras: