Transformación genética ti' células vegetales yo'osal ultrasonidos

Le transformación mediada tumen agrobacterias asistida tumen sonicación (SAAT) ti'al jump'éel método eficiente infectar células vegetales yéetel genes extraños utilizando Agrobacterium bey transportador. Le cavitación ultrasónica causa sonoporación, ka u describir u bey micro-herida dirigida u wa'ak'al vegetal. Ti' le k'iino'oba' micro-heridas ultrasónicamente creadas, le ADN yéetel le vectores ADN táan u béeytal u transportados eficientemente ti' le matriz t'aan.

sonoporación – Transformación t'aan mejorada tumen ultrasonidos

Le ultrasonido UP100H jach jump'éel homogeneizador laboratorio utilizado tu menudo utia'al wa u muestras placas yéetel t'aan meyajile'.Le ken u aplica ultrasonido baja frecuencia (aprox. 20 kHz) u suspensiones celulares, le táanil le cavitación acústica causan jump'éel permeabilización transitoria ti' le membrana ti' le jach celulares. Le efecto ultrasónico u leti'e', k'ajolo'on bey sonoporación yéetel ku meyajtiko'ob utia'al u transferencia genes ti' le células wa jach.
Le ventajas u ultrasonicación u basan u principio funcionamiento mecánico ma' térmico, ku beetik u sonicación in menudo bixake' asab versátil yéetel bey dependiente ti' le tipos células. Le ka'anatako'ob versátil ti' le sonoporación Jaap le posibilidad ti' le utilización paak'alo'ob transgénicas, yaan jump'éel potencial significativo ti' le bioproducción proteínas terapéuticas u humanas complejas. Le biorreactores u k'aaba' vegetal páajtal manipular ku genéticamente uchik, Je'e bix u páajtale' le páajtal contaminación yéetel patógenos yóolo'ob, ma' dañan le bacterias mediadoras transformación (je'ebix, Agrobacterium) yéetel le jump'éel método económico yéetel xoknáalo'obo' u biosíntesis.

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Ultrasonido UP200St, jump'éel potente ultrasonido bin yano'ob sonda 200 vatios utia'al genética, microbiología yéetel transformación t'aan

Ultrasonido UP200St (200W, 26kHz). yéetel carcasa juum

Le video ye'esik le yaan wa u muestras ultrasónicas UIP400MTP, ku Cha' le confiable wa u yilik muestras je'el placa estándar ya'ab k'oja'ano'ob pocillos utilizando ultrasonido ka'anal intensidad. Le aplicaciones típicas ti' le UIP400MTP incluyen lisis t'aan, ADN, ARN yéetel cizallamiento cromatina, bey extracción proteínas.

Ultrasonicador UIP400MTP utia'al u sonicación placas ya'ab k'oja'ano'ob pozos

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Transformación t'aan asistida tumen ultrasonidos

Le ultrasonidos bin yano'ob sonda bey le UP200St ku homogeneizadores jach confiables yéetel ampliamente utilizados utia'al wa u muestras yilik ti' genética, je'ebix, utia'al u transformación mediada tumen agrobacterias asistida tumen sonicación (SAAT).Le sonicación jach jump'éel láaka u aplica ondas ultrasonido baja frecuencia utia'al bok'ik partículas ti' solución, utia'al xa'ak'tik soluciones, aumentando bey le tasa transferencia u juuch' yéetel disolución. Simultáneamente, u sonicación u tselik le gases disueltos ti' le ts'a'abal. Ti' le transformación paak'alo'ob, le sonicación causará le formación microbobinas ti' u wa'ak'al vegetal ka mejorará u k'u'ubul ADN desnudo ti' le protoplasto le páak'alo'.

Utia'al u transformación genética, le Transformación Mediada tumen Agrobacterias Asistida tumen Sonicación (SAAT) leti' le método preferido yéetel yaan jump'éel eficiencia significativamente asab u le sonicación utilizada utia'al u transferir ADN desnudo yéetel vectores ti' ADN Jun ti' le protoplasto. Numerosos xook séen demostrado ti' le transformación asistida tumen sonicación mediada tumen Agrobacterium (SAAT) u utilizar u utia'al u inducir le interrupción kanáanil yéetel le formación heridas ti' le células vegetales yo'osal ondas ultrasonido yéetel u cavitación acústica resultante. Jump'éel Ts'a'akal ultrasónico corto crea microheridas way le explantes. Bey le células heridas taal u penetración u Agrobacterium tu asab taam le jach vegetales, aumentando bey le probabilidad u vegetales le células ku infecten. Ku ts'o'okole', le compuestos fenólicos secretados mejoran le transformación. Le microheridas generadas tumen ultrasonidos ku betiko'ob u penetración bacterias ti' le explante xan bixake' asab factible. SaaT u utilizó belal utia'al u transformación genética te' ba'alche'ob paak'alo'ob particularmente consideradas bey resistentes u Agrobacterium.
Le u bin jump'éel método jach simple yéetel económico, bey le mejora significativa ti' le transferencia ku genes mediada tumen Agrobacterium le le k'ajle' ventajas SAAT. Beyxan ti' kaambalilo'ob le ka'anatako'ob exitosa u SAAT ti' le transformación Chenopodium rubrum L. yéetel Beta vulgaris L., le enfoque xan u ts'o'ok aplicado ti' le producción holotoxinas termolábiles u bin yano'ob salvaje recombinante Escherichia coli yéetel adyuvantes le vacuna LT mutante u Escherichia coli ti' Nicotiana tabacum, ti' le u detectaron le títulos sistémicos ti' IgG específicos ti' LT-B asab ka'anatako'ob ti' aves.
(cf. Laere et ti' le., 2016; M. Klimek-Chodacka yéetel R. Baranski, 2014).

Le VialTweeter ku páajtal utilizar utia'al u infección tumen ADN le células planas, je'ebix, utilizando le transformación mediada tumen Agrobacterium (SAAT) asistida tumen sonicación

VialTweeter utia'al u sonicación simultánea u ya'ab k'oja'ano'ob tubos muestra, je'ebix, utia'al u transformación mediada tumen Agrobacterium asistida tumen sonicación (SAAT).

Procedimiento tuláakal utia'al u transferencia genes yéetel sonoporación ti' células vegetales

  1. Wa u xooko'obo' genético meyaj: Ken káaje' tumen mentik le genético xooko'obo' ku k'áato' introducir ti' le células vegetales. Le ba'ala' je'el u ADN plásmido, ARN jump'éel la ácidos nucleicos.
  2. Aislamiento células vegetales: Aísle le células vegetales ti' le ku k'áato' apuntar. Dependiendo de u experimento a células páajtal aislar u ti' jach wa cultivos vegetales.
  3. Suspensión t'aan: Suspender le células vegetales ti' jump'éel ka'a wa yáax tampón. Lela' tuukulo'obo' utia'al garantizar ti' le células kuxkinko'obi' sanas yéetel jump'éel noj propicio utia'al u absorción genes.
  4. Configura a Sonicator: Prepare u sonicador bin yano'ob sonda yo'osal parámetros preajuste sonicación bey amplitud, k'iin, energía yéetel temperatura. Sumerja le sonda ultrasónica ti' le suspensión t'aan.
  5. Wichkíil u ultrasonidos: Inicie le procedimiento sonicación. Le rápida oscilación xnuk le sonda genera burbujas cavitación ti' le líquido. Táan a burbujas ku expanden yéetel colapsan debido a le ondas ultrasónicas, creando muuk' mecánicas yéetel microstreaming ti' le suspensión.
  6. Sonoporación: Le muuk' mecánicas yéetel le microtransmisión generada tumen le cavitación crean temporalmente poros yéetel agujeros ti' le membranas le células vegetales. Le xooko'obo' genético presente ti' le suspensión je'el u páajtal u wokol ichil le células vegetales ti' le poros.
  7. Incubación: Ka' ts'o'ok u Ts'a'akal sonoporación, incubar le células vegetales ti' permitir ti' leti'ob ma'alobtal ka ma' bisa'ak u membranas. Lela' jump'éel paso crucial utia'al u garantizar le supervivencia t'aan yéetel le transferencia exitosa ti' genes.

Transferencia genes yéetel agrobacterias wa liposomas

Yaan ka'ap'éel formas náats'al u transfectar células vegetales. Utilizan agrobacterias, jump'éel género ti' bacterias gramnegativas, wa liposomas bey portadores le xooko'obo' genético.

  • Sonoporación mediada tumen agrobacterias: Agrobacterium tumefaciens jach jump'éel bacteria comúnmente utilizada ti' ingeniería genética u vegetal. Ti' le método, le plásmido ADN ba'ax ku taasik le gen deseado ku ts'otik ti' Agrobacterium, ku ts'o'okole' ku xa'ak'ta'al tuláakal yéetel células vegetales. Le suspensión t'aan somete sonoporación utilizando jump'éel sonicador bin yano'ob sonda. Le energía ultrasónica mejora transferencia le xooko'obo' genético u Agrobacterium ti' le células vegetales. Le método jach ampliamente utilizado utia'al u uchik u péeksa'al genética u paak'alo'ob.
  • Sonoporación mediada tumen liposomas: Le liposomas ku vesículas basadas ti' lípidos u páajtal u najil ts'aak xooko'obo' genético. Ti' le método, le liposomas cargados yéetel ADN plásmido jump'éel la ácidos nucleicos ku xa'ak'pajal yéetel células vegetales. Le sonoporación yéetel juntúul sonicador bin yano'ob sonda u emplea utia'al u facilitar le absorción liposomas tumen le células vegetales. Le ultrasonido interrumpe le bicapas lipídicas ti' le liposomas, liberando le xooko'obo' genético ti' le células vegetales. Le enfoque jach útil utia'al u xook transitorios expresión génica ti' células vegetales.

Beneficios científicamente probados ti' le transformación mediada tumen agrobacterias asistida tumen sonicación (SAAT).

Le transformación mediada tumen agrobacterias asistida tumen sonicación (SAAT) ku u aplicado u numerosas ba'alche'ob paak'alo'ob. Jump'éel Ts'a'akal ultrasónico corto yéetel relativamente O'olkij u cultivos células vegetales causa sonoporación, u posteriormente ku cha'antik jump'éel penetración taam u Agrobacterium bey transportador genes. Tu continuación u xook ejemplares u demuestran le táanil beneficiosos ti' le SAAT.

Sonicator UP200Ht yéetel micropunta utia'al u transfectar células vegetales yéetel genes yóol sonoporación

Sonicador UP200Ht utia'al u transfección génica ti' le sonoporación

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Transformación asistida tumen ultrasonidos Ashwagandha

Con el Fin de ma'alo'obkíinsiko'ob u eficiencia transformación ti' W. somnifera (k'ajo'olta'an bey ashwagandha wa cereza ke'elil), Dehdashti yéetel u colegas (2016) investigaron u búukinta'al acetosyringona (AS) yéetel le sonicación.
Le acetosyringona (AS) agregó ti' óoxp'éel jejelas súutukil jump'éel: pak'al líquido Agrobacterium ti', infección tumen Agrobacterium yéetel cocultivo explantes yéetel Agrobacterium. Tu yilubáa u adición 75 μM as le pak'al líquido Agrobacterium ka'ach óptima utia'al u inducción genes vir.
U kaambalil yo'osal adicional sonicación (SAAT) resultó ti' le asab expresión génica. Tu yiilubaa u expresión le gen gusA tu jaanta' peludas ka'ach utsil le le' yéetel le puntas le brotes ku sonicaron ichil 10 yéetel 20 ja'abo'ob, respectivamente. Le eficiencia transformación protocolo mejorado ku registró ti' jump'éel 66,5 ti chúumuk yéetel juntúul 59,5 ti chúumuk en el caso de le explantes u le' yéetel xnuk brote, respectivamente. Ti' comparación yéetel uláak' tsoolil bix, tu yilubáa u eficiencia transformación le protocolo mejorado ka'ach 2,5 Óoxten asab utia'al le' yéetel 3,7 Óoxten asab ti' le puntas disparo. Le análisis Southern blot confirmaron 1-2 copias ti' le transgén gusA ti' le líneas W1-W4, ka' jo'op' u detectaron 1-4 copias transgénicas ti' le internet ichil W5 generada tumen le protocolo mejorado.

Le ku bisik le sonicación (k'iin expuesto le ultrasonido) afecta le transformación mediada tumen Agrobacterium (SAAT) asistida tumen sonicación ti' le transformación ti' W. somnifera

Efecto le ku bisik le transformación mediada tumen Agrobacterium asistida tumen sonicación (SAAT) yóok'ol le frecuencia transformación ti' le explantes le' W. somnifera (u) yéetel xnuk brote (b).
(xook yéetel gráfico: © Dehdashti et ti' le., 2016).

Le sonicadores bey le UP200St ku utilizan utia'al u mentik xooko'obo' genético bey ADN, ARN, miARN yéetel le posterior transfección génica ti' le sonoporación. Le sonoporación ku cha'antik transfectar células vegetales yéetel genético xooko'obo' utilizando agrobacterium.

Homogeneizador bin yano'ob sonda UP200St yo'osal sonoporación yéetel transfección génica

Transformación piits' asistida tumen ultrasonidos

Hussain et ti' le. (2007) demuestran le táanil beneficiosos ti' le transformación piits' le asistida tumen sonicación. Le cavitación acústica causada tumen ultrasonido baja frecuencia crea microheridas ti' ka yáanal le superficie u wa'ak'al vegetal (sonoporación) yéetel Cha' u Agrobacterium viaje asab taamil yéetel completamente ti' u wa'ak'al vegetal. Beyo' u herir aumenta u probabilidad u infectar le vegetales células ku lu'umo'oba' asab Nib ti' u wa'ak'al. Yo'osal Trauma le eficiencia transformación SAAT, u p'íis le expresión génica ti' GUS. Le yaan reportero GUS jach juntúul t.u.m genes reporteros, particularmente útil ti' biología molecular yéetel microbiología paak'alo'ob. Ajustando ya'ab parámetros le SAAT, le expresión transitoria ti' GUS ti' taman utilizando embriones tech bey explante u yutstal significativamente. GUS u detectó tuméen yáax ka'atéen 24 h ka' u incubación le explantes yéetel le 48 h, le expresión GUS bin jach intensa, u beelal bey juntúul indicador útil ti' le transformación exitosa ti' le explant piits' ka' u sonicación asistida tumen Agrobacterium mediated transformation (SAAT). Le comparación ya'abkach yo'osal u transformación (in wojéeltik biolística, Agro, BAAT, SAAT), transformación mediada tumen agrobacterias asistida tumen sonicación (SAAT) tu ye'esaj, yéetel ya'ab, ti' ya'ala'al máaxo'ob máano'ob le transformación.

Le transformación mediada tumen Agrobacterium asistida tumen sonicación (SAAT) ye'esik jump'éel expresión transitoria significativamente asab ti' comparación yéetel le métodos alternativos ti' infección.

Elección le procedimiento transformación yóok'ol le k'oja'ano'obo' le expresión transitoria ti' GUS. Le transformación mediada tumen agrobacterias asistida tumen sonicación (SAAT) ye'esik jump'éel expresión transitoria significativamente asab.
(xook yéetel gráfico: © Hussain et ti' le., 2007).

 

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Le uláak' tabla ku ts'aik ti' jump'éel indicación le Buka'aj u ba'al u procesamiento u aproximado k ultrasonicators:

Volumen lote Tasa flujo Dispositivos recomendados
placas multipocillos leti' microtituladores N.a. UIP400MTP
tak 10 viales N.a. VialTweeter
tak 5 viales leti' tubos wa 1 vaso nojochil N.a. Cuphorn
1 u 500mL 10 200 mL leti' min UP100H
10 u 2000mL 20 400 mL leti' min. UP200Ht, UP400St
0.1 ti' 20L 0.2 u 4 L leti' min UIP2000hdT
10 ti' 100L 2 10 L leti' min UIP4000hdT
N.a. 10 100 L leti' min UIP16000
N.a. asab nojoch Cluster u UIP16000

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Literatura leti' Referencias


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