Lisis t'aan ku células BL21 tumen ultrasonidos
Le células BL21 le jump'éel cepa E. coli ba'ax ku meyajtiko'ob ampliamente ti' laboratorios investigación, biotecnología yéetel producción industrial debido a u Buka'aj u ba'al utia'al expresar proteínas ka'anal eficiencia. Le disrupción t'aan ultrasónica, le lisis yéetel le extracción proteínas u ti'al le método común aislar yéetel ch'a'abil teen le proteínas objetivo ti' yaan tu ts'u' t'aan le células BL21. Le ultrasonicación altera le célula tumen k'iini' ka libera tuláakal le proteínas atrapadas, u beetik u le 100 ti chúumuk le proteína ka'ansaje' táan disponible.
Células BL21 utia'al u expresión proteínas
Le célula BL21 jach jump'éel cepa bacteriana u E. coli químicamente competente jach u nupmo'ob yo'osal le transformación yéetel le expresión proteínas ka'anal nivel utilizando juntúul t.u.m inducción ARN polimerasa T7-IPTG. Le células BL21 permiten le expresión proteica u ka'anal eficiencia je'el gen ka'ansaje' táan yáanal le kanik jump'éel promotor T7. Le cepa u E. coli BL21 (DE3) leti' jump'éel cepa producción ti' proteínas bey je'el ti' ARN polimerasa T7 combinada yéetel vectores u expresión basados ti' promotores T7 yéetel u aplica ampliamente ti' laboratorios industria utia'al u producir proteínas recombinantes. Tu BL21 (DE3), expresión u gen u codifica le proteína recombinante jach transcrita tumen le ARN polimerasa T7 codificada cromosómicamente (T7 RNAP), ku transcribe waxak Óoxten asab séeba'an u le ARNP convencional ti' E. coli. Le je'ela' ku beetik u le cepa BL21 (DE3) bixake' ma'alob eficiente yéetel u p'áatal ti' le kaambalilo'ob celulares ti' expresión proteínas preferidos.
Protocolo utia'al u lisis ultrasónica yéetel le extracción proteínas células BL21
Le lisis t'aan ti' le células BL21 Meyajta'ab chuunil laat'a'an yo'osal ultrasonidos ti' combinación yéetel lauroil sarcosinato ti' sodio (xan k'ajóolta'an je'el bix sarkosyl) bey tampón lisis. Le ventajas disrupción t'aan ultrasónica yéetel le extracción proteínas radican ti' le fiabilidad, le reproducibilidad yéetel le funcionamiento sencillo, seguro yéetel séeba'an u le ultrasonidos. Le uláak' protocolo proporciona jump'éel dirección paso tu paso utia'al u lisis t'aan ultrasónica BL21:
- Con el Fin de tselik le proteínas chaperonas, le gránulos bacterianos BL21 ku resuspendieron tu 50 ml tampón Tris-EDTA sódico (STE) síis (compuesto tumen 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl suplementado yéetel 100 mM PMSF).
- Añaden 500 ul lisozima (10 mg leti' ml) yéetel le células ku incuban tu hielo ichil 15 min.
- Tu continuación u añaden 500 ul TDT yéetel 7 ml sarkosyl (10 ti chúumuk (p'el leti' v) compuesto tumen tampón STE).
- Le tuukulo'obo' mantener tuláakal le tampones u purificación helados yéetel mantener le muestras ti' hielo Láalajk'iin. Tuláakal le wook purificación k'a'abéet bisik u ka'ansaj ti' le cámara frigorífica wa páajtal.
- Utia'al u lisis ultrasónica yéetel u extracción proteínas, le muestras ku sonican ti' le Ultrasonido VialTweeter MultiSample ichil 4 x 30 segundos ti' le 100 ti chúumuk amplitud yéetel juntúul intervalo 2 minutos ichil Amal sonicación. Alternativamente, jump'éel homogeneizador ultrasónico bin yano'ob sonda yéetel micropunta, p'el. ej., UP200Ht yéetel S26d2 (3 x 30 seg, 2 min. pausa ichil ciclos ultrasónicos, 80 ti chúumuk amplitud).
- Utia'al le je'ela' wook ti' purificación, le muestras k'a'abéet mantener u te' hielo wa, alternativamente, almacenar u u - 80 ° C tak u posterior procesamiento.
Disruptor t'aan ultrasónico UP200St yéetel micro-tip S26d2 yo'osal lisis yéetel extracción proteínas
Lisis ultrasónica yáanal kanik temperatura presión
U kaambalil yo'osal preciso yéetel fiable ti' le temperatura jach crucial ka manipulan muestras biológicas. Le altas temperaturas inician degradación proteínas inducida térmicamente ti' le muestras.
Bey tuláakal le kaambalilo'ob mecánicas u wa u muestras yilik, le sonicación genera ooxoj. Ba'ale' le temperatura le muestras ku páajtal controlar uts ken u meyajtiko'ob le VialTweeter. Ti' presentamos ya'abkach opciones yo'osal monitorizar yéetel controlar u temperatura u muestras ka' jo'op' le beetik yéetel le VialTweeter yéetel le VialPress utia'al u análisis.
- Maak le temperatura le muestra: le procesador ultrasónico UP200St, u acciona le VialTweeter, táan equipado yéetel juntúul software na'at yéetel juntúul sensor temperatura enchufable. Conecte le sensor temperatura ti' le UP200St yéetel inserte xnuk le sensor temperatura ti' le tubos muestra. Ti' jump'éel pantalla táctil digital u boonil, u establecer ti' le menú le UP200St jump'éel rango temperatura específico utia'al u sonicación u muestra. Le ultrasonido ku detendrá automáticamente ka u alcance le wóolis temperatura ka u detendrá tak ka temperatura le muestra baje ti' le je'o' asab t'okik ti' le temperatura establecida ∆. Tu continuación le sonicación ku ka'a káajsik automáticamente. Le función na'at evita le degradación inducida tumen le ooxoj.
- Le bloque VialTweeter je'el u páajtal u preenfriar. Coloque le bloque VialTweeter (chéen le sonotrodo ma' transductor!) ti' le refrigerador wa congelador utia'al u preenfriar le bloque titanio ku yáantik posponer le aumento temperatura ti' le muestra. Wa páajtal, le muestra xan ku páajtal preenfriar.
- Meyaj hielo tikin utia'al u síistal ichil le sonicación. Use jump'éel bandeja Jach taam Chuup yéetel hielo tikin ka coloque le VialTweeter yóok'ol le hielo utia'al u le ooxoj u disipe jáan.
Clientes le yóok'ol kaaba' utilizan le VialTweeter yéetel le VialPress utia'al u meyaj Sáansamal wa u muestras ti' laboratorios biológicos, bioquímicos, médicos yéetel clínicos yilik. Le software na'at yéetel le kaambalil yo'osal temperatura le procesador UP200St, le temperatura ku controla bix fiable yéetel u evita u degradación le muestra inducida tumen le ooxoj. Le ultrasónica wa u yilik muestras yéetel le VialTweeter yéetel le VialPress ku ya'ala'al máaxo'ob máano'ob ma'alob fiables ka reproducibles.
Kaxáant le disruptor ultrasónico óptimo utia'al u ka'anatako'ob lisis
Hielscher Ultrasonics jach jump'éel fabricante yéetel ya'ab yaan ti' kaambalo'ob ti' le fabricación disruptores yéetel homogeneizadores celulares u ultrasónicos u ka'anal rendimiento utia'al laboratorios ti', sistemas sobremesa u escala industrial. Le Buka'aj u pak'al células bacterianas, u ba'ax ku kaxtik ti' investigación wa producción yéetel le volumen células ti' procesar tumen p'isib wa k'iin le ba'ax tu láakal utia'al u kaxtik le disruptor t'aan ultrasónico adecuado utia'al u ka'anatako'ob.
Hielscher Ultrasonics k'u'ubul ya'abkach soluciones utia'al u sonicación simultánea ti' muestras ya'ab k'oja'ano'ob (tak 10 viales yéetel le VialTweeter) yéetel muestras masivas (es decir placas microtitulación leti' placas ELISA yéetel le UIP400MTP), bey le clásico ultrasonido u laboratorio u bin yano'ob sonda yéetel jejeláas niveles ti' potencia 50 u 400 vatios tak procesadores ultrasónicos jaatsatako'ob industriales yéetel tak 16.000 vatios tumen unidad yo'osal le disrupción t'aan comercial yéetel le extracción proteínas ti' nukuch producciones. Tuláakal le ultrasonidos Hielscher beta'aniko'ob utia'al meyaj le 24 horas k'iin, 7 k'iin ti' le k'iino'ob, 365 k'iin ti' le ja'aba' u molayil kuuch. Le robustez yéetel le fiabilidad ku yáantajo'ob fundamentales ti' k dispositivos ultrasónicos.
Tuláakal le homogeneizadores ultrasónicos digitales u equipados yéetel juntúul software na'at, jump'éel pantalla táctil u boonil yéetel juntúul protocolizado automático u datos, ku p'áatal ti' le dispositivo ultrasónico ti' tuniche' nu'ukula' meyaj ti' le laboratorio yéetel le kúuchilo'ob producción.
Beet k wojéeltik ba'ax jejelas células ti', ba'ax volumen, yéetel ba'ax frecuencia, yéetel ba'ax ba'ax ku kaxtik yaan utia'al procesar u muestras biológicas. Recomendaremos ti' le disruptor células ultrasónico asab yáax utia'al le requisitos u tuukula'.
Le uláak' tabla k'u'ubul ti' jump'éel indicación le Buka'aj u ba'al u procesamiento aproximada u k sistemas ultrasonidos, tak homogeneizadores portátiles compactos yéetel ultrasonidos MultiSample tak procesadores ultrasónicos industriales utia'al u aplicaciones comerciales:
| Volumen lote | Gasto | Dispositivos recomendados |
|---|---|---|
| Placas 96 pocillos leti' microtitulación | n.d. | UIP400MTP |
| 10 viales u 0,5 u 1,5 ml | n.d. | VialTweeter tu UP200St |
| 0. 01 tu 250 ml | U 5 u 100 ml leti' min | UP50H |
| 0. 01 tu 500 ml | U 10 ti' 200 ml leti' min | UP100H |
| U 10 ti' 2000 ml | Ti' 20 u 400 ml leti' min | UP200Ht, UP400St |
| 0. 1 u 20L | 0. 2 u 4L leti' min | UIP2000hdT |
| U 10 u 100L | U 2 u 10 l leti' min | UIP4000hdT |
| n.d. | U 10 ti' 100 L leti' min | UIP16000 |
| n.d. | Mayor | Racimo u UIP16000 |
Xook k! Leti' k'áatiko'ob k!
UIP400MTP sonicador placa utia'al u interrupción celdas ka'anal rendimiento ti' placas 96 pocillos
ultrasonicador UP200Ht yéetel micropunta S26d2 u 2 mm utia'al u sonicación muestras mejen
A wojeltik yo'osal bix u utilizar u homogeneizador jach ultrasónico utia'al u preparación xoknáalo'obo' ka fiable u soluciones tampón.
Datos u tojol le su'utalil K'ajóolt
Escherichia Coli Bacteria
Escherichia coli jach jump'éel bin yano'ob bacteria, u ma' forma esporas, Gram-negativas yéetel u caracteriza tumen u beyo' xóolte' recto. Le bacteria E. coli u presente tu ka'a jeets', le janalbe'eno'ob yéetel le choochel humanos yéetel ba'alche'ob. Le E. coli suele u móvil yo'osal u búukinta'al flagelos peritricos, ba'ale' xan yaan tipos inmóviles. Le E. coli le le llamados áantajilo'ob quimioorganótrofos anaerobios facultativos, ba'ax u k'áat u ya'al ku capaces ti' u metabolismos respiratorios yéetel fermentativos. Óol tuláakal le máasewáalo'obo' ti' le tipos E. coli le benignos yéetel cumplen noj útiles ti' u wíinkilal je'ebix, suprimir tuméen ba'alche'ob bacterianas u dañinas, sintetizar vitaminas, etcétera.
Le células le bacteria Escherichia coli le llamado bin yano'ob B le jump'éel categoría yaabilajech u cepas E. coli, ba'ax ku utilizan ampliamente ti' le investigación utia'al u investigar mecanismos bey le sensibilidad ti' le bacteriófagos wa le kaambalilo'ob restricción-modificación. Ku ts'o'okole', le bacterias E. coli le valoradas bey juntúul tsíimin batalla fiable utia'al u expresión proteínas ti' laboratorios biotecnología yéetel ciencias u kuxtal. Je'ebix, le E. coli ku meyajtiko'ob utia'al sintetizar compuestos bey proteínas yéetel oligosacáridos escala industrial. Debido a yáantajo'ob específicas bey le deficiencia proteasa, le baja producción acetato ti' ka'anal u glucosa yéetel u permeabilidad mejorada, le células B u E. coli le le células huésped asab utilizadas utia'al u producción proteínas modificadas genéticamente.
Proteína recombinante
Le proteínas recombinantes (rProt) táan u adquiriendo jump'éel ka' significativa ti' ya'ab k'oja'ano'ob k'ab, incluidas le industrias producción química, farmacéutica, cosmética, ts'aak humana yéetel ba'alche', agricultura, janalbe'eno'ob yéetel ti' residuos.
Le producción proteína recombinante k'a'abet u búukinta'al juntúul t.u.m expresión. Bey sistemas celulares expresivos utia'al u producción ADN recombinante, ku páajtal utilizar tanto células procariotas bey eucariotas. Wa bien le células bacterianas le le asab utilizadas utia'al u expresión proteínas debido a ba'ax bey le t'okik ta manaj, le ch'a'abil escalabilidad yéetel le condiciones simples ti' le ka'a, le kaambalilo'ob libres células yéetel mamíferos, levaduras, algas, insectos yéetel células ku alternativas establecidas. Le bin yano'ob proteína, le actividad funcional, bey le rendimiento requerido ti' le proteína expresada influyen ti' le selección le t'aan utilizado utia'al u expresión proteínas.
Con el Fin de expresar proteína recombinante, jump'éel célula t'aana' ku k'a'ana'an u transfectada yéetel juntúul vector ADN u contenga le plantilla ADN recombinante. Tu continuación u cultivan le células transfectadas yéetel le plantilla. Bey yo'osal meyaj t'aan, le células transcriben yéetel traducen proteína k'ana'an ju'uno'ob, produciendo bey le proteína objetivo.
A medida ti' le proteínas expresadas p'áatal atrapadas ti' le matriz t'aan, le célula k'a'ana'an u lisada (interrumpida yéetel rota) utia'al u liberar le proteínas. Ti' jump'éel paso purificación posterior, le proteína ku separa yéetel purifica.
Le yáax proteína recombinante utilizada ti' u Ts'a'akal bin le insulina humana recombinante 1982. Bejla'e', ku ku ts'áiko'ob asab u 170 tipos proteínas recombinantes way yóok'ol kaabe' utia'al tratamientos ts'aako'ob. Le proteínas recombinantes comúnmente utilizadas ti' ts'aak le, Je'ebix, le hormonas recombinantes, le interferones, le interleucinas, le ba'ax tuméen, le ba'ax necrosis tumoral, le ba'ax coagulación k'i'ik'el, le fármacos trombolíticos yéetel le enzimas utia'al u k'aax k'aas k'oja'anilo'obo' importantes bey le diabetes, le enanismo, le infarto miocardio, le insuficiencia cardíaca congestiva, le apoplejía ts'o'omel, le esclerosis múltiple, le neutropenia, le trombocitopenia, le anemia, le hepatitis, le artritis reumatoide, le chaambalo', le k'oja'anil Crohn yéetel le terapias xu'ullsa'al le k'ak'as k'oja'anil cáncer. (cf. Phuc V. Pham, tu Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018).
Bibliografía leti' Referencias
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- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
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Sonicador VialTweeter utia'al u sonicación simultánea u 10 muestras, je'ebix, utia'al interrumpir células BL21
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