Fragmentación de alfa-sinucleína usando el sonicador VialTweeter
Le fibrillas yéetel cintas α-sinucleína ku fragmentan ti' le investigación científica utia'al u generar fragmentos fibrillas asab mejen wa páajtal moléculas u proteínas individuales, ku páajtal analizar ku asab uchik utilizando kúuchilo'ob yo'osal experimentales. Le sonicador VialTweeter jach juntúul le ultrasonidos asab utilizados ti' jump'éel fragmentación eficiente yéetel confiable ti' alfa-sinucleína.
α-sinucleína ti' le investigación
Le fibrillas alfa-sinucleína ku agregados u proteínas táan fuertemente asociados yéetel trastornos neurodegenerativos bey le k'oja'anil Parkinson yéetel ciertas formas demencia, incluida demencia yéetel wíinklil Lewy. Le investigación centrada ti' le fibrillas alfa-sinucleína yaan u bey ba'ax ku kaxtik comprender u ti' le progresión le k'oja'anil ka j posibles intervenciones terapéuticas. Yaan u láaj k'aastal le fibrillas alfa-sinucleína ti' fragmentos asab mejen, le investigadores páajtal investigar u yáantajo'ob estructurales específicas. Je'ebix, u fragmentación le fibrillas alfa-sinucleína Cha' u le investigadores investigar u interacciones yéetel uláak' moléculas bey proteínas, lípidos wa moléculas mejen. Ti' le producir fragmentos asab mejen, le lu'umo'. lelo'oba' u unión yéetel u afinidad tumen le socios interactúan ku páajtal probar u kin tuukul asab efectiva. Le fribrillas yéetel cintas α-Syn asab mejen xan páajtal we'esik toxicidad alterada yéetel bioquímicos táanil. Tune', jump'éel láaka fragmentación confiable yéetel eficiente, u produzca ya'ala'al máaxo'ob máano'ob reproducibles ti' jump'éel Ts'a'akal muestra séeba'an ka simple, jach crucial.
Fragmentación ultrasónica alfa-syn: Le sonicador VialTweeter jach le yaan wa u muestras ultrasónico establecido yilik u sonica tak 10 viales simultáneamente ti' exactamente le meyajo'ob condiciones. Le ajustes programables permiten le repetición simple yéetel rápida ti' le mismos experimentos, ku proporciona ya'ala'al máaxo'ob máano'ob ma'alob confiables yéetel reproducibles ti' le fragmentación fibrillas alfa-sinucleína.
Sonicador VialTweeter utia'al u fragmentación ultrasónica simultánea u ya'ab k'oja'ano'ob muestras alfa-sinucleína.
Wa u muestras le α-sinucleína yéetel juntúul sonicador
Jump'éel enfoque utia'al u xook le fibrillas alfa-sinucleína implica u extracción ka fragmentación utilizando yo'osal bix u sonicación. Le sonicación jach jump'éel tuukula' ku meyajtiko'ob ondas ultrasonido u ka'anal intensidad yéetel baja frecuencia yo'osal interrumpir yéetel láaj k'aastal le agregados proteínas, ku bisik ti' le liberación fibrillas asab mejen wa moléculas proteínas individuales. Le sonicador VialTweeter jach jump'éel dispositivo comúnmente utilizado te' xook u investigación relacionados yéetel le α-sinucleína ti' le propósito.
Numerosos xook investigación describen tsoolil bix unajilo'ob tu'ux yaan u muestras sonicación fibrillas alfa-sinucleína, u utilizan le Hielscher VialTweeter ti' jump'éel fragmentación eficiente yéetel confiable ti' le fibrillas α-sinucleína yilik. Yaan u fragmentar le fibrillas ultrasónicamente, le investigadores páajtal analizar le yik'áalil resultantes yéetel examinar u ba'ax, toxicidad yéetel interacciones yéetel uláak' moléculas. Le investigación proporciona a'alajil t'aan Páaybe'en yóok'ol le mecanismos subyacentes ti' le neurodegeneración yéetel potencialmente identifica túumben ku terapéuticos. Le tsoolil bix u sonicación α-sinucleína ma'alob establecidos u utilizan le sonicador VialTweeter permiten kéen p'áatak ya'ala'al máaxo'ob máano'ob confiables ka reproducibles.
Máak superiores: fibrillas alfa-sinucleína ma' fragmentadas
Máak inferiores: Fibrillas alfa-sinucleína fragmentadas tumen ultrasonidos yéetel le sonicador VialTweeter
(xook yéetel máak: ©Dieriks et ti' le., 2022).
Fragmentación ultrasónica u fibrillas α-sinucleína – Tsoolil bix
Dado u numerosos investigadores utilizan sonicador VialTweeter bey láaka fragmentación preferida utia'al u producir fragmentos uniformes fibrillas α-sinucleína, le tsoolil bix establecidos u uchik disponibles. Tu continuación u kaxtik yaan u tsoolil bix u fragmentación ejemplares.
Wa u neek' ClearTau yilik: Le fibrillas ClearTau u diluyeron u 10 μM ti' dH2O yéetel ku sonicaron ti' jump'éel amplitud le 70 ti chúumuk ichil 50 Guatemala mina'an u yotocho'ob yéetel 1 Guatemala mina'an u yotocho'ob ON 1 Guatemala mina'an u yotocho'ob ciclo OFF ti' tubo utilizando le sonicador UP200St yéetel VialTweeter. Neek'o'obo' ku caracterizaron tumen microscopía electrónica.
Medición de fluorescencia ThS: Le fibrillas ClearTau u diluyeron u 2,5 μM ti' dH2O yéetel ku sonicaron ti' jump'éel amplitud le 70 ti chúumuk ichil 50 Guatemala mina'an u yotocho'ob yéetel 1 Guatemala mina'an u yotocho'ob ON 1 Guatemala mina'an u yotocho'ob ciclo OFF ti' tubo utilizando UP200St yéetel VialTweeter. Ku utilizó le monómero Tau 4R2N u longitud u completa 2,5 μM bey kaambalil yo'osal. Ti' le reacción 100 μl, u añadieron 100 μl ThS (10 μM), produciendo concentraciones finales u proteína 1,25 μM. Le fluorescencia ThS jump'éel chéen ch'aaj u p'íis utilizando 96 placas inferiores ma'alob transparentes configuradas ti' le lector microplacas FLUOstar Omega yéetel excitación 445 nm yéetel emisión 485 nm.
(cf. Limorenko et ti' le., 2023).
Longitud xan ti' α-sinucleína yo'osal sonicación: Le heterogeneidad longitud ti' le fibrillas yéetel cintas α-syn ku redujo yo'osal sonicación ti' 20 minutos ti' hielo ti' tubos Eppendorf u 2 ml ti' jump'éel VialTweeter establecido 75 ti chúumuk amplitud, pulsos 0,5 s.
(cf. Bousset et ti' le., 2013).
Tu beetajo' u kanik ma'alobil le monoméricos humanos recombinantes WT wa S129A u-Syn yéetel le fibrilares polimorfos u generan, bey le u u-Syn 1-110. Posteriormente, le polimorfos fibrilares ku fragmentaron tumen sonicación ti' 20 min ti' tubos Eppendorf u 2 ml ti' le ultrasonido VialTweeter utia'al u generar partículas fibrilares yéetel jump'éel Buka'aj taamile' 42-52 nm, adecuadas utia'al u endocitosis.
(cf. Shrivastava et ti' le., 2020).
Caracterización u jo'op'éel polimorfos fibrilares α-Syn. (U) ku muestran micrografías electrónicas u yaantal fibrillas polimorfas fibrilares α-Syn teñidas negativamente, cintas, fibrillas-91, fibrillas-65 yéetel fibrillas-110 ka'ache' (carril superior) yéetel ka' le fragmentación yéetel le VialTweeter (carril inferior). (B) ku ye'esik le distribución longitud le polimorfos fibrilares fragmentados. Ku indica le meyaj ku (n) tu ensamblajes fibrilares ti' le u derivaron le histogramas.
(xook yéetel máak: Shrivastava et ti' le., 2020).
Le fibrillas α-Syn u fragmentaron tumen sonicación ti' 20 min ti' tubos Eppendorf u 2 ml ti' jump'éel VialTweeter utia'al u generar partículas fibrilares yéetel jump'éel Buka'aj taamile' 42-52 nm bin u evaluado tumen le análisis TEM.
(cf. Negrini et ti' le., 2022).
Le fibrillas resuspendidas91 (ti' PBS) ku fragmentaron bey ma' u adición u cultivos celulares tumen sonicación ti' 20 min ti' tubos Eppendorf 2 ml utilizando sonicador Vial Tweeter, alícuota, congelado ti' nitrógeno líquido yéetel almacenado tak u búukinta'al u - 80 ° kuxtal
(cf. Vajhøj et ti' le., 2021).
Sonicator UIP400MTP utia'al u fragmentación fibrillas alfa-sinucleína ti' placas ya'ab k'oja'ano'ob pocillos.
VialTweeter ka sonicadores laboratorio utia'al u fragmentación α-syn
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Le uláak' tabla ku ts'aik ti' jump'éel indicación le Buka'aj u ba'al u procesamiento aproximada u k ultrasonidos Buka'aj laboratorio:
| Dispositivos recomendados | Volumen lote | Tasa flujo |
|---|---|---|
| UIP400MTP | placas multipocillo leti' microtitulador | N.a. |
| Cuphorn ultrasónico | CupHorn utia'al u viales wa vaso u precipitados | N.a. |
| GDmini2 | Reactor ultrasónico u microflujo | N.a. |
| VialTweeter | 0.5 u 1.5mL | N.a. |
| UP100H | 1 u 500mL | 10 200 mL leti' min |
| UP200Ht, UP400St | 10 u 2000mL | 20 400 mL leti' min. |
Ti' máax ku yéetel to'on! Leti' k'áatiko'ob k!
Le VialTweeter Ku meyajtiko'ob comúnmente utia'al u fragmentar le fibrilla alfa-sinucleína bey paso wa u muestras preanalíticas yilik
Literatura leti' Referencias
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.
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