Imọ-ẹrọ olutirasandi Hielscher

Ultrasonic Lysis ti E. Coli

  • Awọn kokoro arun E. coli jẹ awọn kokoro-arun ti o wọpọ julọ ni imọ-a-mimi ati imọ-imọ-ẹrọ.
  • Awọn ohun iṣan ti o ti gbasọ ti Ultrasonic fi awọn iyasọtọ ti o ṣe atunṣe fun awọn liana ti E. coli.
  • Awọn iṣọ agbara ti iṣakoso ti iṣakoso ti iṣakoso ati awọn agbara oju-ipa ni o mu ki idarọwọ pipe ati giga isedijade ti o ni (fun apẹẹrẹ awọn ọlọjẹ, DNA).

Ipilẹ Ẹjẹ nipasẹ Cavitation

Escherichia coli bacteria ti wa ni reliably lysed lilo ultrasonic àsopọ homogenizers.Awọn ayẹwo homogenizers Ultrasonic ṣiṣẹ pẹlu approx. 20,000 wakati fun keji (ni 20kHz) ati ki o fa cavitation ni olomi tabi awọn afikun. Awọn ibiti o ti ni irọra ti o niiṣe ti o ni ailera ti o wa ni igbesi aye ati awọn iwọn otutu ti o ga julọ ti o ya awọn ẹyin ti o ya. Biotilẹjẹpe awọn iwọn otutu le de ọdọ iwọn Celsius pupọ, awọn ipele cavitation jẹ kekere ki wọn ko mu ilana naa ṣe pataki. Awọn olutirasandi ti ipilẹṣẹ cavitation accoustic ati ki o shear ologun perforate tabi fọ awọn cell membrane ti E.coli – da lori eto ẹrọ ti ultrasonic homogenizer.

Awọn anfani ti Ultrasonic Lysis

  • ipilẹ deede ti lysis (kikankikan, titobi, otutu)
  • iyipada ti o dara julọ si awọn ayẹwo kan pato
  • iṣakoso iwọn otutu
  • fun pupọ kekere si awọn ayẹwo nla pupọ (μL si liters)
  • itoju itọju mimo
  • Iwọn lainiọn-soke lati laabu si gbóògì
Ẹrọ ultrasonic VialTweeter fun laaye igbasilẹ ayẹwo igbasilẹ ti o to 10 lẹgbẹrun labẹ awọn ipo ilana kanna. (Tẹ lati tobi!)

VialTweeter fun ultrasonic lysis

Ibere ​​Alaye




Akiyesi wa Ìpamọ Afihan.


Nigbati kemikali ati enzymtic lysis le jẹ iṣoro – nitori pe kemikali kemikali le yi awọn ẹya amuaradagba pada ati iṣeto awọn idi mimimọ ati enzymatic lysis nilo igba igba ti o daamu ati kii ṣe reproducible – Imukuro ultrasonic jẹ ẹya ti o ni imọran, ọna imukuro alagbeka šiše.
Ultrasonic lysis ti da lori awọn ipa agbara nikan. Ko si awọn kemikali ti a fi kun, sonication ba opin awọn cell odi nipasẹ awọn ogun ogun. Kemikali lysis le ṣe atunṣe ọna amuaradagba ati iṣeto awọn iṣeduro. idarudapọ enzymatic nilo igba igba itupẹ ati kii ṣe reproducible.

Gbogbogbo iṣeduro

UP400St ultrasonicator pẹlu sisan riakitoSonication jẹ ilana ti o ni imọran julọ fun sisọ awọn iwọn kekere, alabọde ati titobi pupọ ti awọn sẹẹli alagbeka – lati inu awọn pico-liters ti o to 100L / hr (lilo alagbeka alagbeka sisan). Awọn sẹẹli ti ngbẹ nipasẹ ikun omi ati cavitation. DNA tun ti ṣafihan lakoko sonication, nitorina ko ṣe pataki lati fi DNase si idaduro idaduro.
Isakoṣo iwọn otutu:
Nipasẹ itọlẹ ayẹwo ati fifiyesi ayẹwo lakoko sonication lori yinyin, ayẹwo idibajẹ igba otutu ti ayẹwo le jẹ idilọwọ awọn iṣena.
Bi o ṣe yẹ, awọn ayẹwo yẹ ki o wa tutu tutu-tutu nigba lysis, ṣugbọn fun ọpọlọpọ awọn ayẹwo ti o to ti iwọn otutu ko ba jinde ju iwọn otutu ti asa tabi orisun alawọ. Nitorina o ṣe iṣeduro, lati pa idadoro lori yinyin ati lati sonicate pẹlu ọpọlọpọ awọn pulses ultrasonics kukuru ti iṣẹju 5-10 ati awọn iduduro ti 10-30 iṣẹju-aaya. Nigba awọn idaduro, ooru le tu silẹ lati le tun ṣe iwọn otutu kan. Fun awọn ayẹwo ti o tobi julo, orisirisi awọn reactors alagbeka sẹẹli pẹlu awọn pọọlu imukuro wa.

Awọn Ilana fun Igbaradi ti Awọn Lysates E. Coli

Ifọrọwọrọ ọrọ ati idasilẹ ti amuaradagba atunṣe

Awọn ohun ti a n ṣe pẹlu ultrasonic system ti E. coli pellet UP100H (Hielscher). Fun idi eyi, a ṣe atunṣe pellet alagbeka ni ohun ti n ṣe awari chilled (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 MM NaCl, DTT 5 mM, PMSF 1 mM) ati ki o tutu lori yinyin fun 10 min. Lẹhin naa, a ti mu idadoro pẹlẹpẹlẹ silẹ pẹlu 10 kukuru kukuru ti 10 s tẹle nipa aarin 30 s fun itutu. Lakotan, idoti alagbeka ti yọ kuro nipasẹ ultracentrifugation ni 4 ° C fun 15 min ni 14000 rpm. Fun ìmúdájú ti rPR ikosile, aṣaju-ọrun ti ṣiṣẹ lori 12% polyacrylamide geli ati atupalẹ nipasẹ SDS-PAGE ati Western blotting. Mimọ ti rPR ti ṣe nipasẹ Ni2+-NTA resin (Invitrogen, USA) ni ibamu si itọsọna olumulo. Ni ipele yii, a ti lo ọna imudani ti abinibi. A ṣe deedee ti amọradawọn ti a wẹ mọ nipa lilo electrophoresis lori gelisi polyacrylamide 12% ati atẹgun bulu ti Coomassie. A ṣe iṣeduro iṣeduro amuaradawọn nipasẹ ohun elo idanimọ protein ti Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al 2016)

Ultrasonic cell disruptor UP100H (100W) fun lysis, idẹruba alagbeka ati DNA shearing.

ultrasonic homogenizer UP100H (100W)

Idagbasoke Cell, Crosslinking ati igbaradi ti Awọn ẹya afikun E. coli

Fun SeqA ati RNA polymerase ChIP-Chip E. coli MG1655 tabi MG1655 ΔseqA ti dagba ni 37 ° C si OD600 ti nipa 0.15 ni 50 milimita LB (+ 0,2% glukosi) ṣaaju ki o to 27 μl ti formaldehyde (37%) fun alabọde alabọde ti a fi kun (idojukọ ikẹhin 1%). Agbelekun ni a ṣe ni gbigbọn fifẹ (100 rpm) ni iwọn otutu fun išẹju 20 min nipa atẹgun pẹlu 10 milimita ti 2.5 M glycine (fojusi fojusi 0,5 M). Fun awọn adanwo-ooru-idaamu, E. coli MG1655 ti dagba ni 65 milimita LB alabọde ni 30 ° C si OD600 ti nipa 0.3. Lẹhinna 30 milimita ti ibile ti gbe lọ si oṣupa ti o warmed ni 43 ° C ati iyokù ti o pa ni 30 ° C. Lilọ kiri ati fifun ni bi a ti salaye loke ayafi pe a pa awọn sẹẹli ni 30 tabi 43 ° C fun iṣẹju 5 ṣaaju ki o to siwaju gbigbọn ni otutu otutu. Awọn ẹyin ni a gba nipasẹ fifọ ati fifẹ lẹmeji pẹlu TBS tutu (pH7.5). Lẹhin ti idinkuro ni 1 milimita lysis saaju (Tris 10 mM (pH 8.0), 20% sucrose, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM, 10 miligiramu / mimu lysozyme) ati abe ni 37 ° C fun 30 min atẹle pẹlu afikun 4 milimita IP mimu, awọn sẹẹli ti wa ni ṣiṣan lori yinyin pẹlu igba 12 30 iṣẹju ati 30 iṣẹju-aaya fi opin si ni ohun kan UP400St ultrasonic procesor (Hielscher Ultrasonics GmbH) pẹlu 100% agbara. Lẹhin centrifugation fun 10 min ni 9000 g, 800 μl aliquotes ti supernatant ti a ti fipamọ ni -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Overproduction ati mimu ti awọn ensaemusi.

Fun idaabobo awọn proteinsidine (His10) -ajẹmọ ọlọjẹ, E. coli BL21 (DE3) ti yipada pẹlu awọn ere pET19b. Ti o ni irọrun kan ti a ti mọ ni ọsan nipasẹ fifọ, ati pe 1% ni a lo lati inoculate ikosile asa. Awọn sẹẹli ti o rù pET19mgtB ti dagba sii ni 22 ° C titi di isọmọ opitika ni 600 nm (OD600) ti 0,7. Awọn asa ti gbe lọ si 17 ° C ati ni idasilẹ nipasẹ 100 μM IPTG. Lẹhin 16 pm, awọn ibile ti ni ikore nipasẹ fifọ ni 7,500 × g ni 4 ° C. Awọn ẹyin ti a ni afẹfẹ ni 50 mM saline ti a fi bufeti (PBS) pẹlu NaCl 0.3 M ni pH 7.4 ati idasilẹ nipasẹ ultrasonication pẹlu S2 micro-tip sonotrode ni UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Germany) ni akoko kan ti 0,5 ati titobi ti 75%.
Awọn iṣelọpọ ti GTfC decahistidine-tagged ni a ti waye ni 37 ° C ni OD600 ti 0.6 pẹlu 100 μM IPTG. Awọn ẹyin naa lẹhinna ni abeabo fun 4 h, ti a ni ikore, ti wọn si ti ṣagbe bi a ti sọ loke fun MgtB.
Awọn igbasilẹ alagbeka ti ẹda ni a centrifuged ni 15,000 × g ati 4 ° C lati sọfo awọn idoti alagbeka. Awọn afikun awọn alaye ti a ti ṣalaye ni a ti fi ṣanṣo lori awọn ọwọn ti o jẹ itọka Itọsọna HisTrap FF 1-milimita pẹlu lilo ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Awọn ensaemusi ni a wẹ ni ibamu si ilana ti olupese fun imimu gradient ti awọn ọlọjẹ ti a fi aami si. Awọn solusan amuaradagba ti a sọ ni a rọ lẹmeji si awọn iwọn 1000 PBS 50 mM, pH 7.4, pẹlu NaCl 0.3 M ni 4 ° C. A ṣe iwadii ìwẹnu nipasẹ 12% SDS-PAGE. Awọn iṣeduro ti amuaradagba ti pinnu nipasẹ ọna Bradford nipa lilo Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany). (Rabausch et al 2013)

Isediwon ti Protein lati E. coli Bacteria
Awọn amuaradagba ti baitun (ninu ọran yii, MTV1 ti Thaliana Arabidopsis) ti dapọ si tag GST ati ti a sọ ni awọn ẹyin cellujerun BL21 Escherichia coli (E. coli).
1. Mu ẹja kan ti GST-MTV1 ati GST (bamu si asa ti aisan 50 milimita) ati ki o tun gbe ara wọn silẹ ni 2.5 mL mimu isanmi tutu.
2. Lo ohun ultrasonicator UP100H (ti a ni ipese pẹlu MS3 microtip-sonotrode fun awọn ipele kekere (2-5mL)) lati ṣubu awọn eegun aisan titi ti a fi fi wọn silẹ, eyi ti o tọka si nipasẹ agbara opa ti o dinku ati alekun sii. Eyi ni lati gbe jade lori yinyin, ati pe a ṣe iṣeduro lati sonicate ni awọn aaye arin (fun apẹẹrẹ 10 iṣẹju sẹyin ti o tẹle 10 iṣẹju-aaya lori yinyin ati bẹbẹ lọ). Abojuto ni lati mu ki o má ṣe fi ara rẹ pamọ pẹlu gaju nla. Ti o ba foaming tabi awọn agbekalẹ ti iṣawari funfun kan, a nilo lati sọ agbara naa silẹ.
3. Gbigbe ni kokoro-arun ti a ti ni lysed ojutu si 1,5 mL microcentrifuge tubes ati centrifuge ni 4 ° C, 16,000 xg fun 20 min.

Awọn Amuaradagba ti a ti yipada ni E. coli

VialTweeter jẹ ultrasonicator fun itọju kekere ayẹwo homogenizationIpinnu ti Sulfhydryl Awọn akoonu nipa 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Ẹtan
A ti lo E. E. coli MG1655 ibile kan lati ṣe inoculate MEDS minimal medium (1: 100). Awọn asa ti dagba soke titi ti A600 ti 0.4 ti de. A ti pin asa naa si awọn asa-15 milimita 15 fun itoju itọju. Ise asa ti a ko ni idasilẹ wa bi iṣakoso odi. 0.79 mM allicin (128 μg milimita-1) tabi diamita 1 mM ti a fi kun si ọkan ninu awọn aṣa meji ti o ku mejeeji. Awọn agbaiye ni won ti daabo fun 15 min. 5 milimita ti asa kọọkan ni a ti ni ikore (8,525 × g, 4 ° C, 10 min). Awọn ẹyin ti a wẹ lẹmeji pẹlu 1 milimita ti PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, 10 mM Na2HPO4, KH 2 mM2Ifiweranṣẹ4, pH 7.4, ti o ti fipamọ ni iṣaaju anaerobically lati lo) ati centrifuged (13,000 × g, 4 ° C, 10 min). Awọn ẹyin ti a ni atunṣe ni ipamọ lysis (PBS pẹlu HML guanidini 6 mM, pH 7.4) ṣaaju iṣaaju ni idinadura ni 4 ° C nipasẹ ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Germany) (3 x 1 min). Awọn idoti ti o ni wiwọn ni a ti pa nipasẹ fifọ (13,000 × g, 4 ° C, 15 min). A ti gbe oluso-opo naa si 3.5-ml QS-macro cuvette (10 mm) pẹlu igi gbigbọn ti o ni idẹ ati ti adalu pẹlu 1 milimita ti sẹẹli lysis. Ipese ti awọn ayẹwo ni a ni abojuto ni 412 nm pẹlu Jasrop V-650 spectrophotometer ti a pese pẹlu PSC-718 ti o ni iṣakoso-iṣakoso iṣakoso-iwọn otutu (Jasco) ni iwọn otutu. 100μl ti dithiobis 3 mM (2-nitrobenzoic acid) ti a fi kun. Ti ṣe ayẹwo ni ipasẹ titi o fi de opin. A ṣe ayẹwo ikolu ti thiol nipa lilo isodipupo ikunku ni412 = 13,700 M-1 cm-1 fun thio-2-nitrobenzoic acid (TNB). Awọn iṣiro celular thiol ti wa ni iṣiro da lori iwọn didun ẹyin ti E. coli ti 6.7 × 10-15 lita ati iwuwo cell ti A600 = 0,5 (deede si 1 x 108 awọn ẹyin milimita-1 asa). (Müller et al 2016)

Ni ipinnu Vivo Glutathione

E.coli MG1655 ti dagba ni MOPS minimal medium ni iwọn apapọ ti 200ml titi ohun A600 ti 0.5 ti de. Ibile ti pin si awọn aadọta 50-milimita fun itọju iṣoro. Lẹhin iṣẹju 15 ti abe pẹlu 0.79 mM larin, diamita 1 mM, tabi dimethyl sulfoxide (Iṣakoso), awọn ẹyin ni a ni ikore ni 4,000g ni 4 ° C fun 10 min. Awọn ẹyin ti a wẹ lẹmeji pẹlu Kupe pa ṣaaju ṣaaju imudurokuro ti awọn pellets ni 700μl ti KPE ifibọ. Fun deproteination, 300l ti 10% (w / v) sulfosalicylic acid ni a fi kun ṣaaju iṣeduro awọn ẹyin nipasẹ ultrasonication (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). A gba awọn olutọju lẹhin igbasilẹ (30 min, 13,000g, 4 ° C). Awọn iṣiro Sulfosalicylic acid ti dinku si 1% nipasẹ afikun ti awọn ipele 3 ti KPE n gbe. Awọn wiwọn ti ajẹyọyọ ati GSSG ni a ṣe gẹgẹbi a ti salaye loke. Awọn iṣiro Cellular glutathione ti wa ni iṣiro da lori iwọn didun ti ẹyin E. coli ti 6.7×10-15 lita ati iwuwo cell ti A600 0.5 (deede si 1×108 awọn ẹyin milimita-1 asa). Awọn iṣiro GSH ni a ṣe iṣiro nipasẹ iyokuro ti 2 [GSSG] lati lapapọ glutathione. (Müller et al 2016)

Ultrasonic disruptor fun cell lysis ati isediwon ti awọn ohun elo ti ibi (Tẹ lati tobi!)

Ibewe-írúàsìṣe ultrasonicator UP400St

Ifọrọwọrọ ti MAspat eniyan ni E. coli

Ultrasonic cell disruptor UP400St (400W) fun isediwon ti ohun intracellular (fun apẹẹrẹ awọn ọlọjẹ, organelles, DNA, RNA ati be be lo.)Awọn ileto kan ti E. coli BL21 (DE3) ti o ni abojuto veto ọrọ ni 30 milimita ti alabọde Luria-Bertani (LB) ti o ni 100 mg / mL ampicillin, lẹhinna gbin ni 37ºC titi di iwuwo opiti (OD600) de 0.6. Awọn ẹyin naa ni a ti ni ikore nipasẹ fifọnti ni 4,000 × g fun min 10, o si tun pada ni ipo 3L titun LB ti o ni 100μg / mL ampicillin.
Lẹhinna, ikosile amuaradagba ti ni iṣiro pẹlu isomopyl-β--1-thiogalactopyranoside 1MM (IPTG) fun 20 h ni 16ºC. Awọn ẹyin naa ni a ti ni ikore nipasẹ fifẹnti ni 8,000 × g fun iṣẹju 15 ati fo pẹlu fifipamọ A (NaH2PO4 20 mM, NaCl 0.5 MM, pH 7.4). O sunmọ 45g (ẹyin tutu) ti a gba lati aṣa L 3. Lẹhin ti o ti ni iṣiro, awọn igbasilẹ alagbeka ti a ni afẹyinti ni 40 milimita (fun 1 L) ibudo isunmi tutu ti A, ati lysed nipasẹ ultrasonication ni otutu-otutu otutu lilo ohun UP400St ohun elo (Dr. Hielscher GmbH, Germany). Awọn sẹẹli lysis ti wa ni centrifugged ni 12,000 rpm fun 15 min lati pin soluble (supernatant) ati awọn precipitated (awọn pellet) ida. (Jiang et al 2015)

Awọn tabili ni isalẹ yoo fun ọ ni itọkasi ti agbara gbigbe agbara ti wa ultrasonicators:

ipele iwọn didun Oṣuwọn Tisan Niyanju awọn ẹrọ
0.5 si 1.5mL na VialTweeter
1 si 500mL 10 si 200mL / min UP100H
10 si 2000mL 20 si 400mL / min UP200Ht, UP400St
0.1 si 20L 0.2 si 4L / min UIP2000hdT
10 si 100L 2 si 10L / min UIP4000
na 10 si 100L / min UIP16000
na tobi oloro ti UIP16000

Pe wa! / Beere Wa!

Jowo lo awọn fọọmu isalẹ, ti o ba fẹ lati beere afikun alaye nipa homogenization ultrasonic. A yoo dun lati fun ọ ni eto ultrasonic kan ti n ṣe awọn ibeere rẹ.









Jọwọ ṣe akiyesi wa Ìpamọ Afihan.


Iwe-iwe / Awọn itọkasi



Awọn Otitọ Tita Mọ

E.coli

Escherichia coli (E. coli) jẹ ipalara-odi, optionallyly anaerobic, fọọmu ti o ni eegun, bacterium coliform ti idin Escherichia ti o wọpọ ni inu ifun inu ti awọn ogan-ara ẹjẹ ti o ni idaamu (endotherms). Opo nọmba ti awọn eruku E. coli wa (tabi awọn subtypes) pẹlu awọn abuda ti o yatọ. Awọn iṣoro ti E. coli pupọ jẹ alaiwuṣe fun awọn eniyan, fun apẹẹrẹ B ati K-12 awọn iṣọn ti a lo fun igbagbogbo awọn ohun elo iwadi ni awọn ile-ẹkọ. Sibẹsibẹ, diẹ ninu awọn igara jẹ ipalara ti o le fa ailera pupọ.
E. coli ṣe ipa pataki ninu imọ-ẹrọ ti igbalode ati imọ-ajẹsara ti iṣẹ-ṣiṣe niwon awọn kokoro arun jẹ rọrun lati ṣe afọwọyi. Awọn ohun elo ti o wọpọ wọpọ eyiti o ni igba diẹ ninu lilo E. coli, fun apẹẹrẹ lati ṣẹda deoxyribonucleic acid (Reinbin) (DNA) recombinant tabi lati ṣiṣẹ bi ara-ara awoṣe.
E. coli jẹ alakoso pupọ fun iṣelọpọ awọn ọlọjẹ heterologous, ati awọn ọna amuye-pupọ pupọ ti o wa lati ṣe awọn ọlọjẹ ti nwaye ni E. coli. Lilo awọn plasmids eyiti o jẹ ki ikosile giga ti amuaradagba, awọn jiini le ṣee ṣe sinu kokoro arun, eyiti o jẹ ki o ṣe iru awọn ọlọjẹ ni awọn titobi pupọ ni awọn ilana ilana bakteria.
E.coli wa ni lilo bi awọn ile-iṣẹ alagbeka lati pese insulin. Awọn afikun awọn ohun elo pẹlu lilo awọn fọọmu E. coli ti a tunṣe lati se agbekalẹ ati lati ṣe awọn ajesara ati idasi awọn enzymu, lati ṣe awọn ohun elo biofuels, ati fun isọdọmọ.
Irẹlẹ K-12 jẹ ẹya ti o jẹ mutant ti E. coli ti o fi han pe ẹdọ muṣan Alkaline Phosphatase (ALP). Yi iyipada ba waye nitori abawọn ninu ọran ti o maa n koodu fun enzymu. Ti ọja kan ba n pese ọja lai si ipalara eyi ni a mọ bi iṣẹ isọsọ. Iru fọọmu ti o yatọ yii ni a lo fun isopọ ati mimọ-ara Epo-Ero ti ALP.

Ultrasonic DNA irẹrun

Awọn ologun ti o gbasilẹ ti ultrasonic jẹ ọna ti o lopọ lati yapa lati alagbeka ati fifọ DNA strands sinu awọn ege. Awọn cavitation akosile fọ awọn sẹẹli alagbeka ati awọn membranes lati yọ DNA lati awọn sẹẹli ki o si ṣe awọn egungun ti o to 600 – 800 bp ni ipari, eyi ti o jẹ apẹrẹ fun onínọmbà.
Tẹ nibi lati ni imọ siwaju sii nipa awọn homogenizers ultrasonic fun DNAN fragmentation!