Hielscher faka'ata tekinolosia

To'o e 'uli polotiini ultrasonic mei tohituku mo e ngaahi anga fakafonua 'o e to'oto'o

  • Ko ha sitepu ia ki he teuteu ha sipinga mahu'inga 'i he proteomics 'a e polotiini to'o e 'uli.
  • 'E lava ke ma'u 'a e polotini mei he fu'u 'akau mo e kili 'o e monumanu, yeasts mo ta'ofi.
  • Sonication ko ha foaki polotiini ma'olunga 'omi 'i loto 'i ha taimi nounou 'o e to'o hingoa 'a e founga to'o hingoa polotiini falala'anga, lelei.

 

To'o 'o e 'uli mei he pepa mo e selo

To'o e 'uli polotiini mei he pepa holoholo mo e fanga ki'i selo kuo ako'i lelei ko ha sipinga mahu'inga 'o e ha teuteu sitepu ia 'a ia 'oku fakahoko lolotonga e ngaahi founga biochemical mo e analytical tokolahi hange ko 'ELISA, PEESI, Fakahihifo 'o blotting, hono fakamafola lahi fau 'o e spectrometry, pe polotiini fakama'a. Ultrasonic to'oto'o faingata'a, lysis mo to'o e 'uli 'Oku 'omi 'e he founga controllable tofu pe 'oku ke fakapapau'i 'oku ma'olunga 'o e polotini.

To'o e 'uli polotiini mei he kili 'o e monumanu

Koe'uhi ko e teuteu ki he ngaah kotoa he kupu (e.g. kofuua, loto, ma'ama'a, uoua mo e ha fua), e kili 'oku totonu ke ke vakavakai'i ki ha ngaahi kongokonga iiki 'aupito mo e ngaahi me'angaue ma'a, 'i he 'aisi lelei taha, pea 'i he vave taha 'e lava ke ta'ofi 'a e ma'ulalo 'aki proteases (e.g. lysis fakapotopoto hange ko RIPA pe hypotonic lysis fakapotopoto 'oku 'i ai protease mo phosphatase inhibitor faka'ilo'ilongaua). Hili 'a e dissecting, 'oku fakauku e sipinga 'o ki he huhu'a 'o e nitrogen ki he 'unu Titolo he momoko. 'E lava ke ke tauhi 'i he-80 ° C ke ngaue'aki 'amui ange 'a e sipinga 'o pe ke keept 'i he 'aisi ki he tonu 'o e homogenization. Taimi pe ko ia 'i he 'ao 'o e to'o hingoa ultrasonic, 'aisi lysis momoko fakapotopoto (mo e protease inhibitors DTT, leupeptin mo e aprotinin) 'oku vave tanaki atu ki he fo'i leta 'o e sipinga (ki he mg 'o e kupu 'oku fakaongoongolelei'i 'e he approx. 'a e μL ~ 600 'o fakapotopoto e ~ 10). 'Oku fokotu'u atu ki he fo'i leta 'o e sipinga 'a e mg approx. 20-60 'a e konga pepa holoholo.
Ultrasonic homogenization, lysis mo e to'o hingoa 'oku fakahoko 'aki ha homogenizer ultrasonic hange ko e UP200Ht pe UP200St, kuo fakanaunau 'aki ha sonotrode keipolo micro-tokoni. Loloa 'o e taimi sonication ko sec. 60-90 'i ha siakale ultrasonic ko e founga 'o e sonication 'o e 15 sec. mo e 10 sec. tuku'anga taimi. E sipinga 'oku totonu ke tauhi 'i he 'aisi he taimi kotoa pe.
Hili ultrasonic homogenization / ko centrifuged to'o 'a e 'uli, 'a e 'oku e lysate 'i he toko 27,000 l ki approx. 20 min. Afterwards e supernatent 'oku tanaki, koe'uhi ke lava 'o fakapapau'i 'a e e tokanga polotiini 'aki ha assay polotiini hange ko Piesi polotiini assay BCA.

Ko ha founga mahu'inga 'o e teuteu 'o e sonication

Ultrasonic 'o e to'o e 'uli mei he ngaahi selo mo e UP200St

Kole 'a e fakamatala




Fakatokanga'i ange 'etau Tu'utu'uni totonu fakatautaha.


To'o e 'uli polotiini mei he toto 'o e serum

Ko e sipinga 'o e ki ha tuifio pe homogeneous 'o e serum mo e fakapotopoto 'o e phosphate, vortexed 'uluaki kimu'a pea toki to'oto'o ultrasonic lysis. Ki he lysis ultrasonic, sipinga 'o e ko e sonicated mo ha homogenizer 'i he fale fakatotolo fakakemi ultrasonic hange ko e UP100H ki he siakale 8 'i he 20% amplitude, ki he siakale 'o e takitaha sekoni 'e 5 'i mo e sekoni 'e 15 atu. Sonocation 'oku fakahoko 'i he sonicationg 'i he siakale pea 'i he tuku 'a e sipinga 'o e 'i he 'aisi koe'uhi ke ha ma'ulalo overheating mo e 'ea 'o e sipinga ko e faka'ehi'ehi mei ai. Talu mei he serum 'i ha konga lahi 'o e mamafa 'o e molecular ma'olunga polotini (hange ko e albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G mo e immunoglobulin A), 'a ia 'oku fepaki mo e mavahe 'a e polotini 'a e mafatukituki 'o e molecular ma'ulalo lolotonga IEF, ko e fakaongoongolelei'i ke deplete kinautolu mei he serum 'o faka'aonga'i ha 'otu fakama'ama'a atu ia.

To'o e 'uli polotiini mei he 'akau tohituku

Fu'u 'akau fo'ou, molu moluu, e.g. Mosi mo e ha fua, 'e lava ke faingofua hono maumau'i 'e he pe tuku 'a e ta 'a e sipinga 'o ha naunau 'i he fakapotopoto 'o e lysis ki he sonication. Faingata'a, ligenous to 'a e pepa holoholo, hange ko e ngaahi tenga'i 'akau, 'oku totonu ke 'e he fea 'iate hui mo e ha fua, 'a e kelekele momoa. Ni'ihi 'o e faingata'a, kuo pau ke 'i ai ha ngaahi naunau 'a e woody 'o e fu'u 'akau ke momoko pea mo e kelekele 'i he huhu'a 'o e nitrogen 'i he 'ao 'o to'o 'e sonication. Ki he fu'u 'akau to'oto'o anga fakafonua suspensions, ha faito'o ultrasonic 'i he vaha'a 'o e sekoni 'e 30 pea 150 'i ha fakapotopoto lysis 'oku meimei fe'unga. 'Oku fie ma'u 'e he to'a 'o e ngaahi naunau hange ko e tenga'i hina ha sonication lahi ange hange ko ia 'oku fakamatala'i atu 'i lalo.

Protocol ma'a e ultrasonic to'o e 'uli 'o e albumin mei he tenga'i hina

Tohituku ultrasonic homogenizer UP400St mo S24d40 - ki polotiini to'o e 'uli mei he fu'u 'akau mo e monumanu moluu (lomi'i ke fakalahi!)Ki he polotiini ultrasonic to'o hingoa 'o e albumin mei he tenga'i hina fakakatoa-kelekele efuefu, 10 l 'o ha tenga'i hina defatted efuefu mo e 100 mL 'o e deionised 'a e vai ko e totongi hono mo'ua 'oku tanaki atu 'i ha beaker ki he ipu sio'ata 250mL. 'Oku kau ai 'a e to'o hingoa polotiini 'i he sitepu 'e ua: 'uluaki, ko e sonicated 'a e sipinga 'o mo ha ultrasonicator vakili-fa'ahinga UP400St (400W, 24kHz) mo teuteu'i 'aki sonotrode S24d7. 'Oku tuku 'a e beaker sio'ata 'i ha kaukau vai momoko lolotonga e homogenization ultrasonic. He e 'atakai 'o e ultrasonicator UP400St mo e sensor plugable mafana ne fakapapau'i 'oku tauhi ma'u pe 'a e e sipinga 'o e 'ea 'i lalo 30°. C. 'I he hono pule'i 'o e mafana 'o e 'ea totonu lolotonga sonication, ha denaturation 'o e albumin ko e faka'ehi'ehi mei ai. Ko hono ua, na'e fakahoko ai 'a e to'o hingoa 'aki ha mixer 'i rpm 'e 200 tupu vave pea mo ha 30°. C. Hili ia 'oku 'ave 'a e beaker ki ha kau Sieka thermostatic. 'Oku to'o 'a e globulin 'o fakafou 'i he dialysis mo fakafonu 'a e vai. Lava tu'unga ta'epau ki he loto vilitaki 'a e puipuitu'a 'o e albumin 'a e na'e to'o polotiini hili hono to'o 'o e globulin, pea 'oku toki liliu ia ke tuku = 3.0 'o faka'aonga'i 'a e HCl 0.1 'o e M ki he albumin coagulation. 'Oku fakamavahe'i 'e centrifugation 'i he 5000 l, 20° C e konga fefeka mo e redissolved 'i he deionised 'o e vai. 'Oku fakahoko tu'o ua ke fakatupulaki e fika polotiini 'i he albumin ko e tokanga 'a e albumin coagulation.

Tuku taha e tokanga 'a e to'o hingoa ultrasonic polotiini 'alakalaine ki hono teuteu'i 'o e polotiini mei he laise bran ngaahi faka'ali'ali tukulolo 'i ha taimi nounou ange 'aupito 'a e to'o hingoa 'a e ngaahi ola 'o e faito'o ultrasonic 'i polotiini ma'olunga ange – Fakatatau ki he ngaahi founga anga-maheni 'o e to'o hingoa.

Ultrasonic me'angaue VialTweeter ki he to'o hingoa polotiini mei ha ngaahi sipinga 'o e kupu (lomi'i ke fakalahi!)

VialTweeter ki he ngaahi sonication 'ikai fakahangatonu.

Ngaahi lelei

  • vave
  • 'omi ma'olunga
  • lelei 'aupito
  • Ko e pule tonu ki he ngaahi fakangatangata
  • ngaahi ola 'o e ngaahi
  • ngaahi scalability

Sipinga 'o ha protocol ki he teuteu ma'a enzyme iNOS 'oku lele lelei

Ke ma'u 'a e kakato 'oku lele lelei iNOS enzyme (e.g. ki he faito'o konatapu sivi), 'oku fokotu'u atu he protocol ko 'eni: E to'oto'o fakamavahe'i e 'uli ke fokotu'u 'a e totonu 'i he 'aisi mo e sonicate mo ha UP100H 'i he 10µm amplitude 'i he founga 'o e siakale 'o e 5 sec. sonication mo e 25 sec. 'a e fiemalie 'i he 'aisi. E founga 'oku totonu ke ke toutou approx. 3. Fakasi'isi'i 'a e toe tu'u 'a e 'ea 'a e tuku'anga 'o e taimi 'i he vaha'a 'o e siakale 'o e sonication mo ko ia te ke fakasi'isi'i 'a e hono fakatu'utamaki 'o e denaturation.

Polotiini ultrasonic Solubilization

'E lava ke ke fakavave'i 'e he sonication he founga polotiini 'o solubilization, 'a ia 'oku fa'a fie ma'u 'a e ngaahi houa lahi. 'I he maau ke 'oua overheat 'a e sipinga 'o mo ta'ofi polotiini ma'ulalo mo e ngaahi liliu 'i he Fakalelei 'oku 'i ai 'a e urea, e mafana ultrasonic 'oku totonu ke 'ikai fuoloa ange 'i he ngaahi lau sekoni.

Ngaahi fakahinohino fakalukufua

Pule'i 'a e mafana 'o e 'ea: Ke fakapapau'i ha polotiini ma'olunga 'oku 'omi ta'e denaturation 'ea mafana 'o e 'ea lolotonga e to'o hingoa kuo pau ke ke mapule'i. Homogenizers ultrasonic 'i he Siteiti-'o e-fakatata 'o e Hielscher – ui foki ko e ultrasonic disintegrator pe sonificator – 'Oku controllable tofu pe. Na'a nau ha'u mo ha sensor plugable mafana 'o e 'ea. 'I he ngaahi me'a 'o e 'atakai 'o e homogenizer ultrasonic, ha mafana 'i he lahi taha 'e lava ke fokotu'u. 'I he taimi ko e a'u ki ni Meki mafana 'o e 'ea, e ultrasonicator 'otometiki pe hono ta'ofi kae 'oua kuo vali pata'i 'o e sipinga 'o kai.
Fakapotopoto: E choise 'o ha fakapotopoto fe'unga mo e totonu 'o e tohi 'o e fakapotopoto 'oku kehekehe mei he kili ki he kili pea kuo pau ke ke fika'i atu 'e sivi'i 'a e 'ahi'ahi mo e fehalaki.
Tuenoa / fakama'a: 'E lava ke 'i ai e polotiini lysates ha fu'u hulu lahi 'o biomolecules hange ko DNA pe e kelolii, 'a ia 'e lava ke to'o 'e he polotiini precipitation (deoxycholate-trichloroacetic 'esiti) pe fakafetongi fakapotopoto.

Lipooti 'oku 'omi polotiini fakautuutu hono faka'aonga'i 'o e sonication mo e ko e kupu ultrasonic homogenization mo e lysis founga ngaue ke lava 'o fakalelei'i e founga ngaue to'o hingoa lolotonga 'aupito 'a e Chittapalo mo e Noomhorm (2009) – fakaivia ki ha ngaahi faingamalie fo'ou ki he to'o hingoa fakakomesiale.

Ongo 'a e malu'i mo e ongo nofo'anga SPB-L mo e ultrasonic me'angaue UP200St 'a e Hielscher. (Lomi'i ke fakalahi!)

Tohituku ultrasonic homogenizer UP200St ki he to'o hingoa polotiini lelei

Tofu pe mo e mapule'i 'o e faito'o ultrasonic (lomi'i ke fakalahi!)

Mapule'i 'o e browser ki he tonu 'o e ngaue mo e vakai'i 'o e founga ngaue 'o e sonication

Ko e naunau ultrasonic ki polotiini to'o e 'uli

'Oku 'oatu 'e he Ultrasonics 'o e Hielscher ha kehekehe lahi 'o e homogenizers ultrasonic koe'uhi ko e movete 'a e fanga ki'i selo, pepa holoholo, pekitilia, fanga, 'isite, pea mo e spores.
'Oku malohi mo faingofua ke fakalele 'a e Hielscher 'a e loki fakasaienisi ultrasonicators. Langa ki he 24/7 tafa, fokotu'utu'u kinautolu ko e loki fakasaienisi 'a e longomo'ui mo lelei mo e ngaahi device taupotu ki 'olunga 'a e sea. Ki he ngaahi me'angaue kotoa pe, he output ivi pea mo e amplitude 'e lava ke tofu pe mapule'i. He manafa falahi 'o e Naunau fakaava e toe fokotu'utu'u ke fili mei ai. E ngaahi naunau faka'ilekitulonika hange ko e VialTweeter, UP200Ht, UP200St, mo e UP400St ma'u ha mapule'i fakafekau'aki 'o e 'ea mo ha kaati SD 'i ki hono lekooti 'o e ngaahi fakamatala fakahangatonu.
Ma'a e sonication 'ikai fakahangatonu, tau'ataina hono faka'uli'i kolosi mo e download 'o e ngaahi founga kehekehe, 'oku tau foaki he VialTweeter pe ko e Ultrasonic CupHorn.
'O makatu'unga pe 'i ho'o tohi kole, naunau, mo e sipinga 'o ha tohi, tau 'e lekomeni ke e taha fe'unga mo e fokotu'utu'u ki ho'o sipinga 'o teuteu. Fetu'utaki mai kiate kimautolu he 'aho ni!

Fetu'utaki mai kiate kimautolu! / Kole kiate kitautolu!

Kataki 'o faka'aonga'i e foomu 'i lalo, kapau 'oku ke loto ke kole ha fakamatala lahi ange fekau'aki mo e ultrasonic homogenization. Te tau fiefia ke 'oatu ha polokalama ultrasonic fakataha ho'o ngaahi fie ma'u.









Kataki 'o fakatokanga'i ange 'etau Tu'utu'uni totonu fakatautaha.


Ngaahi fakamo'oni fakafolofola/ngaahi tohi

  • Chittapalo T, A Noomhorm (2009): 'Oku concentrates 'a e to'o hingoa Ultrasonic alkali tokoni'i 'o polotiini mei he laise defatted bran mo e ngaahi koloa 'o e polotiini. Int J me'akai Sci Technol 44:1843 – 1849.
  • Simões, 'Onitelea E.S:; Peleila, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunesi, 'Ana F.; Komesi, Sofia E.; Lotilikesi, Petelo M.; Vakai, Adrian C.; D'Hooge, na'e; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Petelo M.; Lotilikesi, Sesilia M.P. (2013): Lelei fakaakeake 'o e polotini mei ha sipinga lahi 'o e ma'u'anga tokoni hili 'a e trizol pe trizol RNA 'o e LS to'o e 'uli mo e taimi loloa na'e tauhi. BMC Genomics 2013, 14:181.


Ngaahi mo'oni'i me'a 'oku mahu'inga ke 'ilo'i

Proteomics

Ko e mala'e fakatotolo 'oku fekumi 'a e polotini mo e proteome 'a e Proteomics. Fullfil 'o e polotini ha kehekehe lahi 'o e mahu'inga 'o e ngaahi ngaue 'i loto 'i he organisms. E proteome ko e seti kakato 'o e polotini 'oku fakahaa'i 'aki ha genome, to'oto'o, kili, pe e Laumalie 'i ha taimi pau. 'Oku kehekehe pe 'a e proteome mo e taimi mo e ngaahi fie ma'u makehe, pe loto mafasia, 'oku fa'ufa'u ha to'oto'o pe e Laumalie. Kae toe mahino ange, ko e seti 'o e polotini fakahaa'i 'i ha fa'ahinga foaki to'oto'o pe e Laumalie, 'i ha taimi, 'i he ngaahi tukunga defined. Ko e fo'i lea ko e fakatahataha'i ai e polotini mo e genome. Ko hono ako 'o e proteome 'a e Proteomics.

Polotiini

'Oku 'a e polotini 'oku biomolecules lahi, macromolecules 'ulungaanga – 'Oku fa'u ia mei ha seini loloa 'e taha pe lahi ange 'o e amino acid toenga Uli 'e toe. 'Oku ma'u ia 'i he organisms kotoa pe 'a e tupu'anga 'a e vegetal mo e fanga manu fakatou'osi 'a e polotini pea 'oku nau mahu'inga ai ki he tokolahi taha 'o e ngaahi ngaue totonu. Talu mei he taimi 'oku 'i ai ha fakamatala totonu lahi 'a e polotini, 'oku nau ma'u ki analytical taumu'a, e.g. proteomic fakatotolo. Na'e kau 'a e ngaue mahu'inga taha 'oku fakahoko 'aki e polotini 'i he catalysis 'o e to'onga metabolic, DNA replication, ko e tali ki he fakafefine, pea mo e transport 'o e molecules mei he feitu'u 'e taha ki ha taha kehe. 'Oku kehe 'a e polotini mei he taha fakatautautefito 'i honau fakahokohoko 'o e amino 'esiti, 'a ia 'oku lau kae hiki 'e he fakahokohoko 'o e nucleotide 'o e honau ngaahi afa, mo e 'a ia 'oku meimei ko e ola 'o polotiini Pelu ki ha fa'unga pau pe 'oku ne fakapapau'i ko e 'ekitiviti hono. 'Oku 'a e polotini – Makehe mei he peptides – Ko e taha 'o e ngaahi konga mahu'inga 'o e me'akai. Ko ia ai, ko e proteomics ko ha me'angaue malohi 'i he saienisi 'o e me'akai ke fakahoko lelei ange 'a e founga ngaue, me'akai malu mo fakafuofua'i koniteina.

Electrophoresis 'o e gel

Ko e founga lalahi ki he mavae mo e fakaikiiki 'o e macromolecules hange ko DNA, RNA mo e polotini ko 'enau kongakonga, 'o makatu'unga 'i honau lahi mo e pule 'a e gel electrophoresis. 'Oku faka'aonga'i ia 'i he lesoni kemi kiliniki ke fakamavahe'i 'a e polotini 'a e tukupa mo e/pe lahi (IEF agarose, Ee lahi 'o e tau'ataina) pea 'i he Gottingen, saienisi 'o e mo'ui molecular mo e proteomics ke mavahe ai ha tokolahi 'o e tuifio 'a e fanga ki'i kongakonga DNA mo e RNA 'aki hono loloa, ke nau fakafuofua'i 'a e lahi 'o e Kongakonga DNA mo e RNA pe ke fakamavahe'i 'a e polotini 'e tukuaki'i.

Ngaahi anga fakafonua 'o e to'oto'o

Anga fakafonua to'oto'o ko he founga pule'i 'o e tupulaki 'a ia 'oku tanumaki ai e fanga ki'i selo 'i he pule'i 'o e ngaahi tukunga. 'Oku kehekehe 'a e ngaahi tu'unga 'o e anga fakafonua to'oto'o ki he fa'ahinga takitaha to'oto'o. Ko hono fakalukufua, he 'atakai 'o ha anga fakafonua to'oto'o 'oku kau ha ipu fe'unga (e.g. Petri ipu) mo substrate pe fetu'utaki'anga ia ngaahi naunau 'o e me'atokoni fakatupu ivi mahu'inga (amino 'esiti, kelolii, vaitamini, koloa), ngaahi mo'oni'i me'a 'o e tupulaki, fa'u ha ngaahi homouni, pea mo e kasa (CO2, 'OIAUE2), pea 'oku ne pule'i 'a e 'atakai 'o e physio-kemikale (pH fakapotopoto, 'a e teke malohi osmotic, mafana). 'Oku fie ma'u e lahi taha 'o e ngaahi selo ha kitu'a pe substrate loi, kae lava ke hoko 'a e ngaahi anga fakafonua kehe to'oto'o tanumaki e tete 'i tau'ataina, 'i he anga fakafonua fetu'utaki'anga (anga fakafonua fakamavahe'i e 'uli, pea fakamavahe'i e 'uli to'oto'o).
'Oku faka'aonga'i 'a e ngaahi anga fakafonua lahi 'o e ngaahi laine 'o e fanga monumanu to'oto'o 'i he ki hono fa'u 'o e pena viral mo kehe ha ngaahi koloa biotechnologically derived. 'Oku ako 'a e ngaahi selo 'o e tangata 'o e tefito ke fakalahi 'a e tokolahi 'o e fanga ki'i selo 'o fakafaikehekehe'i 'a e ngaahi selo ki somatic to'oto'o kehekehe ki ha ngaahi taumu'a transplantation.

Sipinga 'o e konga pepa holoholo

'Oku fakamatala'i 'e he e kupu 'o e fo'i lea ko ha Mopaila fakakonga, ko ia 'oku 'i ha tu'unga organisational 'i he vaha'a 'o e fanga ki'i selo mo ha 'okani kakato ai e naunau to'oto'o. 'Oku fakataha mai 'a e fanga ki'i selo tatau, mei he tupu'anga tatau 'oku fakahoko fakataha ha ngaue pau, 'i he kili. 'I he 'a e kulupu 'oku lele lelei 'a e lahi 'o e pepa holoholo, 'oku fokotu'u 'a e ngaahi faingata'a 'o e 'okani.
Ko e tu'unga ta'epau 'a e kili 'o fakatotolo 'i he saienisi 'o e mo'ui, histology/histopathology, parasitology, Gottingen, immunohistochemistry pea mo ke tanumaki mo to'o 'a e DNA. 'E lava ke ke fakafaikehekehe'i ia 'i he vaha'a 'o e fanga monumanu (feitu'u nofo'anga: mammal tohituku) mo e to 'a e kili. 'Oku fakakulupu 'a e pepa holoholo 'aki e fanga monumanu ki he ngaahi tefito'i fa'ahinga 'e fa 'o e connective, uoua, tailiili, mo e kupu 'o e epithelial. Ko e subdivided 'a e kili 'o e fu'u 'akau ki he ngaahi polokalama ko 'eni 'a e kupu 'e tolu: e epidermis e kili 'o e kelekele mo e kili vascular.
'E lava ke teuteu'i 'a e kupu ha ngaahi sipinga mei he monumanu pe e mavahe 'a e ngaahi konga 'o e fu'u 'akau, hui e.g., e uoua, etc.

Sino maha

Toto, serum, plasma, cerebrospinal 'a e lolo, favai mo synovial 'a e lolo 'oku maha 'o e sino, 'a ia 'oku ne 'oatu ha ma'u'anga diagnostically mo e fakamatala. Ko ia ai, ko ha teuteu ngaahi 'o e sino 'a e lolo 'a e sipinga ki he vakai'i 'o e fakamatala 'oku mahu'inga. 'Oku fekau'aki ia mo e manafa longomo'ui falahi 'o e ngaahi kongokonga 'oku 'i heni 'i he sino maha 'a he 'uluaki faingata'a.

Loto vilitaki polotiini tokanga

Bradford assay, Lowry assay mo e assay 'esiti (BCA) 'a e bicinchoninic ko e assays angamaheni ke fakapapau'i pe ko e fakatahataha'i 'o e polotini. Bovine serum albumin (BSA) ko e taha 'o e polotiini lahi taha hono faka'aonga'i angamaheni.

Lysis 'a e fakapotopoto

Kuo pau ke fakapotopoto 'a e lysis choosen 'i he fakatatau ki he naunau to'oto'o pe e kupu (anga fakafonua 'o e kili, fu'u 'akau, pekitilia, tu'ungafulufulua, mo e ha fua), pea tatau ai pe pe ko e fanga ki'i selo 'oku 'i ha fale pea mo e fa'ahinga fa'unga. 'Oku fa'u 'a e kehekehe 'o e buffers 'o e lysis ki he to'o hingoa 'o e polotini, membranes mo e organelles mo e me'afo 'oku vaivai 'e taha pe lahi ange. 'Oku fa'a fili 'a e koa fo 'o fakafou 'i he ngaahi sivi 'o e 'ahi'ahi mo e fehalaki pe – Kapau 'oku ma'u – Fakatatau ki he ha polotiini lolotonga to'o hingoa e protocol. Kuo pau ke fenapasi ia mo e tupu'anga 'o e kili mo e polotini 'a e e koa fo. Ko hono fakalukufua, he koa fo pehe sai ia ki ha ngaahi kupu tukupau / 'oku fili 'a e polotiini, kae lava ke tauhi ma'u 'a e ngaue maximal e polokalama 'a e na'e to'o. 'Ikai ngata ai, telia na'a to'o ha hingoa 'o e membranes mo e organelles, ha koa fo vaivai 'oku tauhi 'e he manifi tu'u ma'u pe. 'Oku meimei ke me'afo 'oku vaivai hono ngaue 'aki angamaheni 'i he lysis buffers nonionic pe zwitterionic, hange ko e CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40, pea mo Tween 20.
Hange ko 'eni, pepa holoholo hange ko e 'uto, hono 'ate, intestine, kofuua, spleen etc. 'e lava ke hoko pe buffered mo RIPA – Neongo pe ko e 'oku totonu ke fakakau 'a e inhibitors protease mo e DTT (e.g. 'i he gel electrophoresis).
Lysis fakapotopoto ki he uoua skeletal moluu ('aisi momoko): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 e mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, glycerol 'a e 10% (Ng. lea/v), 1 mM EDTA, fakalahi 'a e 1 mM dithiothreitol mo inhibitor protease mo e phosphatase kavamalohi 'i he ngaahi
Tepile 'o buffers angamaheni mo 'enau kehekehe pH. Ko hono fakalukufua, 'oku fa'a anga'aki hono faka'aonga'i 'a e ngaahi buffers 'i he 'uhinga 'o e 20-50 mM.

Fakapotopoto pH kehekehe
Citric acid – NaOH 2.2 – 6.5
Ko e sotiume citrate – Citric acid 3.0 – 6.2
Ko e sotiume acetate – acetic acid 3.6 – 5.6
Cacodylic ko e 'esiti sotiume Soleki – HCl 5.0. – 7.4
MES – NaOH 5.6 – 6.8
Ko e sotiume dihydrogen phosphate – disodium peroxide phosphate 5.8 – 8.0
Imidazole – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Hydrochloride 'o e Triethanolamine – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
Ko e sotiume tetraborate – boric acid 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
Glycine – NaOH 8.6 – 10.6

'Oku fakahaa'i 'e he ko e lahi taha 'o e buffers ha fakafalala pH 'i he mafana 'o e 'ea. 'Oku tautautefito 'eni ki he Tris buffers. Na'e liliu 'a e pKa mei he 8.06 'i he 'aho 25 'o ° C ki 8.85 'i he 0°. C.
(pH mo pKa 'o ha fakapotopoto: pH fakafuofua'i e fakatahataha'i 'o e ions peroxide 'i ha founga fakalelei'i aqueous. pKa (= hokohoko ai 'a e 'esiti dissociation) ko ha fekau'aki, ka ko e fua lahi pau ange, 'i he 'oku tokoni ia ke ke tala 'a e founga te nau ngaue ha molecule 'i ha tu'unga 'ulungaanga mahu'inga 'o e pH pau.)

TRIzol

Ko ha founga kemikale 'oku faka'aonga'i ke to'o 'a e RNA/DNA/polotiini lolotonga e to'o hingoa 'o e thiocyanate-phenol-chloroform guanidinium 'a TRIzol. Hono faka'aonga'i 'o e tokoni ultrasonically TRIzol to'o e 'uli ko e ola 'o ma'olunga 'omi DNA, RNA mo e polotiini mei he sipinga 'o tatau pe mo e ma'olunga taha kehe ai e ngaahi founga to'o hingoa.