Hielscher faka'ata tekinolosia

Ultrasonic Lysis 'o e Coli e.

  • E. coli pekitilia 'oku e pekitilia lahi taha hono faka'aonga'i 'i he microbiology mo e biotechnology.
  • 'Oku fakahaofi 'e he to'oto'o ultrasonic disruptors 'a e falala'anga mo e ngaahi ola ki he lysis 'o e. coli.
  • Lahi ka tofu pe controllable cavitation mo e kosi malohi ola 'i he kakato 'o e faingata'a pea mo e talangofua (e.g. polotini, DNA) 'a e ma'olunga 'o e to'o hingoa.

To'oto'o faingata'a 'e Cavitation

'Oku ngata lysed 'a Escherichia coli pekitilia 'o ngaue 'aki 'a e kupu ultrasonic homogenizers.Homogenizers ultrasonic vakili-fa'ahinga fakalele mo approx. siakale toko 20,000 ki he Ha'ele 'Anga Ua ('i he 20kHz) mo e ngaue cavitation 'i he viviku pe supsensions. Cavitation fai ai e fuofua microscopic ngaahi tafa'aki he ngaahi fakamalohi hange ko vekiume mo e mafana ma'olunga 'oku hae'i vahe'i 'a e ngaahi selo. Neongo 'e a'u 'a e mafana 'o e 'ea ki he Celsius 'e toko lau afe lahi 'a e ngaahi mata'itohi, 'oku iiki na'a nau 'ikai fakamafana'i e founga 'aupito 'a e ngaahi tohi cavitation. Na'e 'oatu 'a e ha 'e fai ai e fuofua cavitation mo e perforate 'a e ngaahi malohi 'o e kosi pe maumau'i 'a e e manifi to'oto'o 'o e E.coli – Fakatatau mo e 'atakai me'angaue 'o e homogenizer ultrasonic.

Ngaahi lelei 'o e Ultrasonic Lysis

  • tofu pe mo e mapule'i 'o e lysis (malohi, amplitude, mafana 'o e 'ea)
  • tokolahi lelei 'o e adaption ki ha ngaahi sipinga pau
  • pule'i 'a e mafana 'o e 'ea
  • ki ha ngaahi sipinga iiki 'aupito ke lahi 'aupito (µL ke litres)
  • faito'o fakamisini haohaoa
  • ngaahi me'afua-hake mei loki fakasaienisi ki hono ngaohi
'Oku faka'ata 'a e device ultrasonic VialTweeter ki he teuteu 'a e sipinga 'o download 'o e vials 10 hake ke 'i he tu'unga tatau pe 'o e founga. (Lomi'i ke fakalahi!)

VialTweeter ki he ultrasonic lysis

Kole 'a e fakamatala




Fakatokanga'i ange 'etau Tu'utu'uni totonu fakatautaha.


Ka 'e lava pe ke faingata'a 'a e kemikale mo e enzymtic 'o e lysis – Talu mei he taimi 'e lava ke liliu 'a e ngaahi fale polotiini pea fakafe'iloaki 'a e ngaahi palopalema 'o e fakama'a 'a e kemikale lysis mo enzymatic lysis 'oku fie ma'u 'e fuoloa taimi pea 'oku 'ikai ko ngaahi 'e he incubation – ko ha founga faingata'a 'a e ngaahi, 'aukai to'oto'o 'a e ultrasonic faingata'a.
'Oku makatu'unga 'a e ultrasonic lysis 'i he ngaahi malohi fakamisini pe. 'Oku tanaki atu ai 'a e 'ikai ha kemikale, na'e maumau'i 'e sonication 'a e holisi to'oto'o 'i he ngaahi malohi 'o e kosi. 'E lava ke liliu e fa'unga polotiini lysis kemikale mo e fakafe'iloaki 'a e ngaahi palopalema 'o e fakama'a. 'Oku fie ma'u 'e taimi loloa 'a e incubation 'a e enzymatic faingata'a pea 'oku 'ikai ngaahi.

Lahi 'o e ngaahi fokotu'u

Ultrasonicator 'a e UP400St mo e pa 'a e tafe 'atomiKo e founga manakoa taha ki he lysing lahi 'aupito iiki, mo Lotoloto mo lalahi 'o to'oto'o suspensions 'a e sonication – mei he kae-lita a'u ki he 100 L/hr ('o faka'aonga'i ha to'oto'o fehufaki ultrasonic). 'Oku lysed 'e he huhu'a kosi mo e cavitation 'a e ngaahi selo. 'Oku foki pe DNA lolotonga sonication, ko ia 'oku 'ikai fie ma'u ke tanaki atu 'a e DNase ki he to'oto'o fakamavahe'i e 'uli.
Pule'i 'a e mafana 'o e 'ea:
'I fakamokomoko'i maama fakalaumalie 'a e sipinga 'o mo tauhi 'a e sipinga 'o e lolotonga sonication 'i he 'aisi, ma'ulalo 'ea 'a e sipinga 'o e sipinga 'e lava ke faingofua pe ta'ofi.
Ko hono mo'oni, ha ngaahi sipinga 'oku totonu ke tauhi momoko fau lolotonga lysis, ka ko e lahi taha samples fe'unga ia kapau 'e 'ikai ke tu'u 'a e mafana 'o e 'ea 'i 'olunga he 'ea 'a e ma'u'anga tokoni 'a e anga fakafonua pe kupu. Ko ia 'oku fokotu'u atu, ke ke tauhi 'a e fakamavahe'i 'o e 'uli 'i he 'aisi pea sonicate 'i he pulses ki he ultrasonics nounou lahi 'o sec 5-10 mo e fanga ki'i motu fakataimi 'a e 10-30 sec. Lolotonga e fanga ki'i motu fakataimi, 'e lava ke molia atu 'a e vela 'o e 'ea kae lava ke toe fokotu'u ha mafana ma'ulalo. Ki ha sipinga e to'oto'o lahi ange, 'oku lava ke ma'u 'a e kehekehe fehufaki to'oto'o reactors mo saketi fakahaofi fakamokomoko'i.

Protocols ki he teuteu 'o e Lysates 'o e Coli E.

Fakahaa'i fakaikiiki mo e fakama'a 'o e polotiini recombinant

Na'e sonicated 'a e pellet e. coli mo ha polokalama ultrasonic UP100H (Hielscher). Na'e resuspended 'a e pellet to'oto'o ki he taumu'a ko 'eni, 'i he fakapotopoto 'o e mokosia lysis (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) mo e vali pata'i 'o kai 'i he 'aisi he miniti 'e 10. Hili ia, na'e sonicated ai 'a to'oto'o fakamavahe'i e 'uli mo e 10 'o e mafana nounou e 10 s 'oku muimui 'i he vaha'a 'o e 30 s ki fakamokomoko'i. Ko hono faka'osi, na'e to'o 'a e veve to'oto'o 'e ultracentrifugation 'i he 'aho 4 'o ° C ki ha miniti 'e 15 'i he 14000 rpm. Na'e lele 'i he gel 'o e polyacrylamide 12% 'a e supernatant ki he hilifakinima 'o e fakahaa'i ia 'o e rPR, mo vakai'i 'i he PEESI 'e SDS mo e blotting 'o e Hihifo. Na'e fakahoko 'a e fakama'a 'o e rPR hono faka'aonga'i 'o e Ni2 +-NTA he huhu'a (Invitrogen, USA) 'o fakatatau ki he fakahinohino 'a e kautaha na'a nau ngaohi. 'I he tu'unga ko 'eni, na'e faka'aonga'i e founga fakama'a tu'ufonua. Na'e fakafuofua'i 'a e tu'unga haohaoa 'o e polotiini fakahaohaoa'i 'o faka'aonga'i 'a e electrophoresis ki he 12% polyacrylamide gel mo e staining ki he Coomassie lanu pulu mui. Na'e fua 'enau tokanga polotiini fakahaohaoa'i 'e he naunau assay ki he polotiini Endure BCA (PIESI, USA). (Azarnezhad et e 'Alama 2016)

To'oto'o ultrasonic disruptor UP100H (100W) ki he lysis, to'oto'o faingata'a mo kosi e fulufulu'i DNA.

Ultrasonic homogenizer UP100H (100W)

To'oto'o tupulaki, Crosslinking mo e teuteu 'o e ngaahi konga 'o e to'oto'o e. coli

Ki he SeqA mo e pinati-pinati. e RNA polymerase coli MG1655 pe MG1655 ΔseqA na'e tupu 'i he 37° F OD ha600 'o fekau'aki mo e ml 'o e 0.15 'i he 50 LB (+ 0.2% suka) 'i he 'ao 'o e μl 27 'o formaldehyde (37%) ki he ml fetu'utaki'anga na'e tanaki (% 'o e 1 'enau tokanga faka'osi). Na'e fakahoko 'a e Crosslinking 'i he tuai 'ene tetetete (100 rpm) 'i he mafana 'o e loki ki he miniti 'e 20 'oku muimui 'i he lau mo e 10 'o e ml 'o e glycine 2.5 M (faka'osi 'enau tokanga 0.5 M). Ki he ngaahi 'ahi'ahi vela-'ohovale, 'a e loto, na'e tupulaki 'i he fetu'utaki'anga 65 ml LB 'i he 'aho 30 'o ° C e. coli 'o e MG1655 ki ha OD600 'o e kau 0.3. Faifai na'e hiki ai 'a e ml 30 'o e anga fakafonua ki ha flask 'osi fakamafana'i 'i he 43° C mo e toenga 'oku tauhi 'i he 30°. C. Crosslinking mo e lau na'e fakamatala'i atu 'i 'olunga, tuku kehe pe 'a ia na'e tauhi 'i he 30 pe 43 ° F ki he miniti 'e 5 'a e fanga ki'i selo kimu'a pea toe fakatuotuai tetetete 'i he mafana 'o e loki. Na'e tanaki 'e he centrifugation 'a e fanga ki'i selo 'o fufulu tu'o ua mo momoko TBS (pH7.5). Hili 'a e resuspension 'i he 1 ml lysis fakapotopoto (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, lysozyme 10 mg/ml) mo e muimui 'a incubation 'i he 37° f ki he miniti 'e 30 'i he tanaki atu 'o e 4 ml IP fakapotopoto, na'e sonicated 'e he ngaahi selo 'i he 'aisi mo sec 30 tu'o 12 mo e tutuku 'a e 30 sec 'i he ha UP400St ultrasonic processor (GmbH 'o e Ultrasonics Hielscher) 'aki 'a e malohi 'o e 100%. Hili 'a e centrifugation ki ha miniti 'e 10 'i he 9000 l, na'e tauhi e 800 μl aliquotes 'o e supernatant 'i he-20 °. C. (Waldminghaus 2010)

Overproduction mo e fakama'a 'o e 'enisaimi (enzyme).

Ki he overproduction 'o e decahistidine (His10)-polotini, na'e liliu 'a e BL21(DE3) mo e pET19b constructs e coli e. 'i he faka'ilonga'i (tag). Na'e toli 'e ha preculture po kakato 'e centrifugation, pea na'e faka'aonga'i 'a e 1% ke ke malu'i ha anga fakafonua 'o e fakahaa'i ia. Kuo lalahi 'i he 'aho 22 'o ° C 'a hono fakahoko 'o e pET19mgtB 'a e ngaahi selo a'u ki ha density 'oku 'i he 600 nm (OD600) 'o e 0.7. Na'e hanga 'e he anga fakafonua 'o hiki ki he 17° C pea fakaafe'i 'e 100 μM IPTG. Hili e 16 h, na'e utu ai 'a e anga fakafonua 'i centrifugation 'i he 7,500 × l 'i 4°. C. Na'e resuspended 'i he uepisaiti mM 50 buffered faka-phosphate saline (PBS) mo 0.3 M NaCl 'i he pH 7.4 mo maumau'i 'e he ultrasonication mo ha sonotrode keipolo micro-tokoni S2 'i he e ngaahi selo e UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Siamane) 'i ha siakale 'o e 0.5 mo ha amplitude 'o e 75%.
Na'e fakaafe'i 'e he overproduction 'o e GtfC 'o e decahistidine-faka'ilonga'i (tag) 'i he 37° C 'i ha OD600 'o e 0.6 mo 100 μM IPTG. Ngaahi selo leva incubated ki 4 h, utu, pea lysed 'o hange ko ia 'oku 'i 'olunga ki he MgtB.
Na'e centrifuged 'a e to'oto'o fakamatatu'a mekehe 'i he 15,000 × l mo e 4° C ke fokotu'una e veve to'oto'o. Na'e fakaheka 'a e ngaahi fakamatala mahino mai 'i he 'otu HisTrap FF fakamatatu'a 1-ml faka'aonga'i ha polokalama tanaki ÄKTAprime (GE ki he mo'uilelei). Na'e fakama'a e 'enisaimi (enzyme) 'o fakatatau ki he protocol 'a e kautaha na'a nau ngaohi ma'a e gradient 'o e elution 'o e polotini hono-faka'ilonga'i (tag). Na'e dialyzed 'a e ngaahi founga eluted polotiini tu'o ua ki ha voliume 'e 1,000 'o e 50 mM PBS, pH 7.4, mo 0.3 M NaCl 'i he 4°. C. Na'e vakai'i 'a e fakahaohaoa 'e 12% SDS 'i he PEESI. Na'e fakapapau 'a e tokanga 'a e polotiini 'aki e Bradford e founga hono faka'aonga'i 'o e loti-Quant (Carl Roth GmbH, Kalasilua, Siamane). (Rabausch et e 'Alama 2013)

To'o 'a e 'uli 'o e polotiini mei he pekitilia e. coli
Fused ki ha pine GST ha polotiini tatali 'o tokanga (ko 'eni thaliana MTV1 'o e Arabidopsis me'a,) pea fakahaa'i 'i he ngaahi selo 'o e coli (e. coli) BL21 Escherichia.
1. to'o 'e taha 'o e pellet 'o e GST-MTV1 mo e GST ('oku fekau'aki mo e anga fakafonua hangatamaki 50 ml) mo resuspend takitaha 'i 2.5 mL 'aisi to'o hingoa momoko fakapotopoto.
2. faka'aonga'i ha ultrasonicator UP100H (fakanaunau 'aki MS3 microtip-sonotrode ki he ki'i tohi (2-5mL)) ke maumau'i 'a e ngaahi selo hangatamaki kae 'oua kuo nau 'oku lysed, 'a ia 'oku fakahaa'i atu ai 'e reduced opacity mo e viscosity lahi ange. Ko 'eni kuo ke fakahoko ia 'i he 'aisi, pea 'oku fokotu'u atu ki he sonicate 'i he tenipi (e.g. 10 sekelitali sonicating muimui 10 sec 'i he 'aisi 'o pehe atu). 'Oku ma'u 'a e tokanga ke to'o ke 'oua 'e sonicate mo malohi fu'u ma'olunga. Kapau 'oku 'ilo'i koa pe hono fa'u 'o ha hinehina hoko ai, 'oku fie ma'u e malohi ke tuku hifo.
3. transfer e founga pekitilia lysed ke 1.5 mL microcentrifuge tiupi mo e centrifuge 'i he 4° C, toko 16,000. x l ki ha miniti 'e 20.

Liliu faka-Allicin e polotini 'i coli e.

E VialTweeter ko ha ultrasonicator fiemalie ki ha sipinga 'o ha ki'i homogenizationFakapapau'i 'a e fakahokohoko 'o e tohi Sulfhydryl e 5, Assay 5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
Na'e faka'aonga'i 'a e anga fakafonua 'o e po kakato ha e. coli 'o e MG1655 ke ke malu'i 'a e fetu'utaki'anga si'isi'i pe 'a e kau MOPS (1:100). Na'e tupu aerobically e anga fakafonua kae 'oua kuo ne a'u ki ha A600 'o e 0.4. Na'e vahevahe 'a e anga fakafonua ki he 'e tolu 'o e ngaahi anga fakafonua e 15-ml ke faito'o 'a e loto-hoha'a. 'Oku hoko 'a e ha anga fakafonua 'ikai faito'o ko ha mapule'i 'oku kovi. 0.79 mM allicin (128 μg ml-1) pe 1 mM diamide na'e tanaki atu ki he taha 'o e toenga 'o e toko ua ha ngaahi anga fakafonua takitaha. Na'e incubated 'e he anga fakafonua he na'e utu 'e 15 min. 5 ml 'o e ngaahi 'ulungaanga fakafonua takitaha 'i centrifugation (8,525 × l, 4° C, miniti 'e 10). Na'e fufulu 'e he ngaahi selo tu'o ua mo e ml 1 'a e PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4pH 7.4, tauhi anaerobically kimu'a pea toki faka'aonga'i) mo e centrifuged ('e 13,000 × l, 4 ° C, miniti 'e 10). Na'e resuspended 'i he lysis 'a e fakapotopoto (PBS mo 6 mM guanidinium HCl, pH 7.4) kimu'a 'i he faingata'a 'i he 'aho 4 'o ° C 'a e fanga ki'i selo 'aki ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Siamane) (3 × 1 miniti 'e). Na'e pelleted 'a e veve to'oto'o 'e centrifugation ('e 13,000 × l, 4 ° C, miniti 'e 15). E supernatant kuo hiki ki ha 3.5-ml QS-macro cuvette (mm 'e 10) 'i ha pa ha fakatupu fe'auhi pea na'e tuifio mo e 1 ml 'o e lysis fakapotopoto. Na'e tokanga'i 'a hono faka'auha 'o e sipinga 'i he 412 nm mo ha spectrophotometer 'o e Jasco V-650 fakanaunau 'aki e PSC-718 to'oto'o 'oku pule'i 'e he mafana 'o e 'ea ma'u (Jasco) 'i he loki 'a e 'ea. Na'e tanaki atu 'a e 100μl 'o ha founga 3 mM dithiobis ('esiti 2-nitrobenzoic). Na'e tokanga'i 'e faka'auha 'a kinautolu kae 'oua kuo a'u ki faitonunga. Na'e fakahoko 'a e fika'i 'aki 'a 'enau tokanga 'o e thiol hono faka'aonga'i 'o e ϵ coefficient hono faka'auha412 = MITA 'E 13,700-1 senitimita 'e-1 ki he thio-2-nitrobenzoic 'a e 'esiti (TNB). Thiol telefoni to'oto'o 'i hono 'uhinga na'e fika'i 'i ha tohi 'o e ngaahi selo e. coli 'o e 6.7 × 10-15 lita mo ha density to'oto'o ha600 = 0.5 (tatau pe ia mo 1 × 108 ngaahi selo ml-1 anga fakafonua). (Müller et e 'Alama 2016)

'I he loto fakapapau 'o e Glutathione 'o e Vivo

Na'e tupu 'a e E.coli MG1655 'i he MOPS si'isi'i pe fetu'utaki'anga 'i ha fakakatoa 'o e tohi 'o e 200ml kae 'oua kuo A600 'o e 0.5 na'e a'u ki he. Na'e vahevahe 'a e anga fakafonua ki he 50-ml e anga fakafonua ke faito'o 'a e loto-hoha'a. Hili e na'e utu 'a e miniti 'e 15 'a e incubation mo e ngaahi selo 0.79 mM allicin, 1 mM diamide pe dimethyl sulfoxide (pule), 'i he na'e fufulu 'a l 'e 4,000 tupu 'i he 'aho 4 'o ° C ma'a e fanga ki'i selo 'o e 10 min. tu'o ua mo fakapotopoto KPE kimu'a 'i he resuspension 'o e pellets 'i he 700µl 'o e KPE fakapotopoto. Ki he deproteination, na'e tanaki atu 'a l. 300 'a e 10% (Ng. lea/v) sulfosalicylic 'esiti kimu'a pea fakamovetevete 'o e fanga ki'i selo 'e ultrasonication (miniti 'e 3 x 1; VialTweeter ultrasonicator). Na'e tanaki 'a e supernatants hili e centrifugation (miniti 'e 30, 13, 000 l, 4° C). Na'e holo 'a e 'uhinga 'esiti 'a e Sulfosalicylic ki he 1% 'aki hono tanaki atu 'o ha ngaahi voliume 3 'o KPE fakapotopoto. Na'e fakahoko 'a e fua 'o e fakakatoa 'o e glutathione mo e GSSG hange ko hono fakamatala'i 'i 'olunga. Glutathione telefoni to'oto'o 'i hono 'uhinga na'e fika'i 'i ha tohi 'o e ngaahi selo e. coli 'o e 6.7×10-15 lita mo ha density to'oto'o ha600 0.5 (tatau pe ia mo 1×108 ngaahi selo ml-1 anga fakafonua). Na'e fika'i 'a e 'uhinga 'o e GSH 'e subtraction 'o e 2 [GSSG] mei he glutathione fakakatoa 'o. (Müller et e 'Alama 2016)

Disruptor ultrasonic to'oto'o lysis mo e to'o hingoa 'o e ongomatu'a totonu naunau (lomi'i ke fakalahi!)

Vakili-fa'ahinga ultrasonicator UP400St

Ko e fakahaa'i ia 'o e fa'ahinga 'o e tangata 'o e mAspAT 'i he coli e.

To'oto'o ultrasonic disruptor UP400St (400W) ki he to'o hingoa 'o e ngaahi me'a intracellular (e.g. polotini, organelles, DNA, RNA mo e ha fua.)E tautaha ko e nofo'anga o E. coli BL21 (DE3) hono tukuloto'i e ongo'i e fakahaa'i vector 'i he mL 30 'o e Luria-Bertani (LB) mo Lotoloto 'oku 'i ai 100μg/mL ampicillin, mo leva hono fakatupulaki 'o 'i he 37ºC a'u ki he density 'oku (OD600) a'u ki 0.6. E ngaahi selo utu 'e centrifugation 'i he 4,000 × l ki he miniti 'e 10, pea na'e resuspended 'i he 3L fo'ou LB fetu'utaki'anga 'oku 'i ai 'a e ampicillin 100μg/mL.
Faifai, na'e fakaafe'i ai 'a e polotiini fakahaa'i mo 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ki he 20 h 'i he 16ºC. Na'e utu 'e centrifugation 'i he toko 8,000 × l ki ha miniti 'e 15 'a e fanga ki'i selo pea fufulu mo fakapotopoto ai (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, hono mata'itohi pH 7.4). Na'e ma'u 'a e fanga ki'i selo 'o e fakafuofua'i 45 l (viviku mamafa) mei he anga fakafonua 3 L. Hili centrifugation, e pellets to'oto'o na'e resuspended 'i he mL 40 (ki he anga fakafonua 'o e 1 L) to'o hingoa momoko fau fakapotopoto A, mo e lysed 'i he ultrasonication 'i hono faka'aonga'i 'o e mafana 'o e 'ea momoko fau ha UP400St me'angaue (Dr. Hielscher GmbH, 'i Siamane). Na'e centrifuged 'a e lysis to'oto'o 'i he rpm 'e 12,000 ki ha miniti 'e 15 ki he mavahevahe vaia pe (supernatant) mo e fractions 'o e precipitated (pellet). (Jiang et e 'Alama 2015)

'Oku 'omi 'e he e tepile 'i lalo ha faka'ilonga ia 'o e tu'unga 'o e ngaue ki he fakafuofua'i 'o e hotau ultrasonicators:

Kulupu (batch) 'o e tohi 'Oku tafe mai 'a e 'ea 'Oku fokotu'u atu 'a e ngaahi me'angaue
0.5 ke 1.5mL n.a. VialTweeter
mL 'o e 1 ki he 500 10 ki he 200mL/miniti 'e UP100H
mL 'i he 10 ki he 2000 20 ki he 400mL/miniti 'e UP200Ht, UP400St
0.1 ki he 20L 0.2 ke 4L/miniti 'e UIP2000hdT
10 ki he 100L 2 ki he 10L/miniti 'e UIP4000
n.a. 10 ki he 100L/miniti 'e UIP16000
n.a. lalahi fakataha'i 'o e UIP16000

Fetu'utaki mai kiate kimautolu! / Kole kiate kitautolu!

Kataki 'o faka'aonga'i e foomu 'i lalo, kapau 'oku ke loto ke kole ha fakamatala lahi ange fekau'aki mo e ultrasonic homogenization. Te tau fiefia ke 'oatu ha polokalama ultrasonic fakataha ho'o ngaahi fie ma'u.









Kataki 'o fakatokanga'i ange 'etau Tu'utu'uni totonu fakatautaha.


Ngaahi fakamo'oni fakafolofola/ngaahi tohi



Ngaahi mo'oni'i me'a 'oku mahu'inga ke 'ilo'i

E.coli

Escherichia coli (e. coli) ko ha bacterium gram-negative, facultatively anaerobic, fakafotunga 'e he va'a ukamea, coliform 'o e genus ko Escherichia, 'a ia 'oku fa'a ma'u 'i he intestine ma'ulalo ange 'o e warm-blooded organisms (endotherms). 'Oku 'i ai ha fu'u tokolahi 'o fakataha e. coli (pe subtypes) mo e ngaahi 'ulungaanga kehekehe. Ko e lahi taha e. coli lea 'oku 'ikai fakatu'utamaki pe ki he tangata, ke fekumi e.g. B mo e K-12 mo e lea 'a ia 'oku angamaheni 'aki hono faka'aonga'i ki he ngaahi polokalama 'i he laboratories. Ka neongo ia, ko e ha ha lea 'oku fakatu'utamaki pea lava 'o fakatupu 'a e fu'u puke lahi.
E. coli 'o fakahoko 'a e fatongia mahu'inga 'i he 'enisinia ongomatu'a totonu 'o onoponi pea 'oku faingofua pe ke kakaa'i 'a e microbiology lalahi talu mei he pekitilia. Angamaheni loki fakasaienisi polokalama 'a ia ne fakakau 'a e fa'a ngaue 'aki e. coli, e.g. ke fa'u 'a e recombinant deoxyribonucleic acid (DNA) pe ke hoko ko ha laumalie 'o e sipinga.
E. coli ko ha matapule fulufulu'isipi 'aupito ki he faiva 'o e polotini heterologous, mo manifold polotiini fakahaa'i polokalama 'oku 'ata ki he fakatupu 'o e polotini recombinant 'i he coli e.. Faka'aonga'i 'a e plasmids 'a ia 'oku ne fakangofua 'a e ma'olunga 'o e fakahaa'i levolo 'o e polotiini, ngaahi afa 'e lava ke ke fakafe'iloaki ki he pekitilia, 'a ia 'oku malava ai ke fakatupu ha fa'ahinga polotini 'i ma'olunga lahi 'i he ngaahi founga pahu lalahi.
'Oku faka'aonga'i 'a e E.coli ko ha falengaue to'oto'o ke fakatupu ha 'inisulini. 'Oku kau 'i he ngaahi polokalama lahi ange hono faka'aonga'i 'o e fanga ki'i selo 'o e fakalelei'i e. coli ke fakatupulaki mo fakatupu ha Pena pea 'enisaimi (enzyme immobilised), ke ne fakatupu 'a e biofuels, pea pehe ki he bioremediation.
He mafasia ko e K-12 ko ha mutant 'a e coli e. lahi 'oku fakahaa'i 'e he enzyme 'alakalaine Phosphatase (ALP). 'Oku hoko 'a e mutation ko 'eni koe'uhi ko ha palopalema 'i he Sini 'oku ma'u pe 'a e kouti ki he enzyme. Kapau 'oku ne 'omi ha Sini ha koloa ta'e 'i ai ha fa'ahinga inhibition 'oku 'iloa 'eni ko ha 'ekitiviti constitutive. 'Oku faka'aonga'i 'a e foomu mutant pau ko 'eni ki he tuenoa mo e fakama'a e enzyme ALP.

Ko e DNA ultrasonic kosi e fulufulu'i

Kosi e tumu'aki ultrasonic malohi ko ha founga hono ngaue 'aki angamaheni ke fakamavahe'i mei he to'oto'o mo maumau'i 'a e ngaahi tu'oni afo 'o e DNA ki ha ngaahi kongokonga. Cavitation fai ai e fuofua maumau'i 'a e ngaahi holisi 'o e to'oto'o mo e membranes ke to'o 'a e DNA mei he fanga ki'i selo 'o fakatupu 'a e kongakonga 'o fakafuofua ki he 600 – 800 'a e pisope 'i he loloa, 'a ia 'oku fe'unga ki he vakai'i 'o e fakamatala.
Lomi'i 'i heni ke ako lahi ange fekau'aki mo e homogenizers ultrasonic ki he DNA fragmentation!