Hielscher faka'ata tekinolosia

Lysis ultrasonic ki he feitu'u fakahihifo 'o e Blotting

  • E fakahihifo 'o fakamolemole'i ko ha founga analytical ki he fakatokanga vela 'o e polotini pau 'i ha sipinga 'o e kupu homogenate pe to'o 'a e to'oto'o.
  • Ke lele ha fakahihifo 'o fakamolemole'i pe ke fua 'aki e 'ekitiviti enzyme, 'oku fie ma'u lahi assays ke lava 'o hu ki he ngaahi naunau (e.g. polotini, DNA, subcellular kongakonga) fihia 'i he to'oto'o.
  • Ko ha founga falala'anga mo faingofua-ki he-fai to'oto'o mapule'i 'a e faingata'a mo e lysis 'a e sonication.

To'oto'o ultrasonic faingata'a

Polotiini to'o e 'uli mei he pepa holoholo mo e fanga ki'i selo kuo ako'i lelei ko e sitepu 'uluaki ki ha ngaahi founga fakanatula, biochemical mo e analytical (PEESI, Western blotting, 'ELISA, hono fakamafola lahi fau 'o e spectrometry, mo e ha fua) pe ha polotiini fakama'a lahi. Ke ma'u ha polotiini ma'olunga 'oku 'omi, e naunau to'oto'o mo e kupu kuo pau ke ke lelei motuhia / lysed. To pe to'oto'o pe monumanu moluu, sonication ko e founga ki hono teuteu faingofua ho'o to'oto'o lysate mo e 'aukai.

Ngaahi lelei 'o e Sonication

  • 'Aukai & lelei
  • tafa faingofua
  • 'Oku 'omi ha polotiini ma'olunga
  • ngaahi / repeatable
  • tofu pe pule'i
  • scalable

Immunoprecipitation Protocol ki he fakahihifo 'o e Immunoblotting

A. reagents

Ki hono teuteu 'o e ngaahi founga, pea faka'aonga'i 'a e vai fakama'a hange ko Milli-Q.

  • 1 X Phosphate Buffered Saline (PBS)
  • 1 x to'oto'o Lysis fakapotopoto: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, pyrophosphate ko e sotiume 'o e 2.5 mM, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, μg 1/ml Leupeptin
    Mahu'inga: Tanaki ke faka'aonga'i 'a e 1 mM PMSF 'i he taimi pe ko ia ki mu'a.
  • 15 μl polotiini ha + 15 μl polotiini G 'oku fe'unga ki he IP, ka ko ia 'e lava ke fakafalala ho'o Palaimeli antibody mo e sipinga 'o ha tohi. Te ke lava foki 'o faka'aonga'i 'a e tuifio tomu'a polotiini A / agarose G (e.g. polotiini A ki he IgG 'oku holoki hifo 'a e ki'i lapisi) mo polotiini G ki he mausi IgG fusi hifo
  • 3 x SDS sipinga 'o fakapotopoto: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 'i he 'aho 25 'o ° C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, lanu 'o e bromophenol 0.03% w/v
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter ki ha sipinga 'o ultrasonic teuteu

Fetu'utaki mai kiate kimautolu! / Kole kiate kitautolu!





Kataki 'o fakatokanga'i ange 'etau Tu'utu'uni totonu fakatautaha.


Ko ha sitepu mahu'inga 'a e sonication lolotonga e teuteu 'a e sipinga 'o

UP200St 'aki e keipolo micro-tokoni ki he sipinga 'o sonication

B. teuteu 'a e 'o to'oto'o Lysates

  • Utu e ngaahi selo. Ke utu 'a e ngaahi selo 'i he tu'unga nondenaturing, to'o e mitia pea vaima'a 'a e fanga ki'i selo tu'o taha mo e PBS momoko fau.
  • To'o 'a e PBS mo tanaki 0.5 ml 1 momoko fau X to'oto'o lysis fakapotopoto ke takitaha peleti (senitimita 'e 10) mo incubate 'a e 'u lau'i peleti 'i he 'aisi he miniti 'e 5.
  • Kili'i manu 'a e fanga ki'i selo atu 'a e 'u lau'i peleti pea 'ave ki he microcentrifuge tiupi. Tauhi 'i he 'aisi.
  • Sonicate tu'o ua 'i ha sekoni 'e 10 'i he immunoprecipitation momoko fau fakapotopoto (IP fakapotopoto: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 mo e protease inhibitor e tuifio). Ki he sonication, e VialTweeter pe 'oku 'i ai ha ultrasonicator vakili hange ko e UP100H pe UP200Ht 'Oku fe'unga mo e taha.
  • Centrifuge 'a e lysates 'i he 15,000 l 'i ha miniti 'e 10 'i he 4°. C.
  • 'Ave 'a e supernatant ki ha fo'i leta fo'ou. (Kapau 'e lava ke ke tauhi 'a e ngaahi fie ma'u, lysate 'i he –80 °. C.)
  • Tanaki atu 'a e antibody 'o e Palaimeli ki he supernatant. Ko e incubated 'a e supernatant mo e antibody Palaimeli ki h 1 'i he 'aho 4 'o ° C 'i he malumalu 'o hono ue'i holo e mama. 'Oku angamaheni 'aki hono tanaki 'a e antibody 'o e Palaimeli 'i ha lahi 'o e pa'anga 10 x lahi ange 'oku fakatefito 'i he me'a 'oku faka'aonga'i ki he feitu'u fakahihifo 'o e blotting. (Te ke lava ke kamata 'aki e 1μg ki he 100μL.)
  • Ko e toki incubated 'a e supernatant lahi ange mo e fefiofi 'o tatau lahi 'o e pa'anga 'o e polotiini A-agarose (Invitrogen) mo e agarose polotiini G ki h 1 'e taha.
  • Fufulu 'a e pellets 'o e agarose tu'o tolu mo IP fakapotopoto. Hili ia, to'o e polotini ha'isia mo e fakapotopoto hono fakahu 'a e PEESI 'e SDS 'e he 'ea fakamafana 'i he 95° C he miniti 'e 5.

C. Immunoprecipitation

  • To'o 'a e 200 μl to'oto'o lysate pea tanaki atu mo antibody 'o e Palaimeli. Incubate mo e angavaivai pepee ha po 'e taha 'i he 4°. C.
  • Tanaki atu ha polotiini A pe e G agarose kula (20 μl 'o e 50% fakahoko slurry). Incubate mo e pepee angavaivai 'i ha houa 'e 1 – 3 'i he 4°. C.
  • Microcentrifuge ki he sekoni 'e 30 'i he 4°. C. Fufulu 'a e pellet tu'o nima mo µl 'e 500 tupu 'o fakapotopoto lysis 1 to'oto'o e X. Tauhi 'i he 'aisi he lolotonga e washes.
  • Resuspend 'a e pellet mo e μl 3 20 X SDS sipinga 'o ki he fakapotopoto. Vortex, pea toki microcentrifuge ki he sekoni 'e 30.
  • Vela e sipinga ke 95 – 100° C ki he miniti 'e 2 – 5 mo e microcentrifuge 'i ha ki'i miniti 1 'i he toko 14,000 X l.
  • Uta e sipinga (15 – 30 μl) 'i he PEESI 'e SDS gel (12 – 15%).
  • 'Analaiso 'a e sipinga 'i he feitu'u fakahihifo 'o e blotting.

Fetu'utaki mai / kole ke ma'u ha fakamatala lahi ange

Talanoa mai kiate kimautolu fekau'aki mo ho'o ngaahi fie ma'u 'o e ngaue'anga. Te mau fokotu'u 'a e ngaahi fakangatangata fe'unga taha hono fokotu'u mo e ngaue ki ho'o ngaue.





Kataki 'o fakatokanga'i ange 'etau Tu'utu'uni totonu fakatautaha.


Protocols 'o e Sonication lahi ange

Fakahihifo 'o fakamolemole'i 'analaiso mo ultrasonicator UP50H

Muimui protocol na'e faka'aonga'i 'i he ako 'o e Kriebisch et 'Alama (2011):
Na'e mama'o 'a e polotiini fakakatoa mei he fanga ki'i selo 'o e MC3T3-E1 ngaohi lelei'i mo 1,25(OH)2T3 (10−8 M) pe me'alele. Na'e lysed 'e he ngaahi selo 'i ha fakapotopoto ko ia 'oku 'i ai e 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (toutai fakasaienisi); 0.1% ko e sotiume dodecyl sulfate (SDS) (toutai fakasaienisi); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) mo e 0.5% ko e sotiume deoxycholate (Merck). Na'e sonicated 'a e to'oto'o lysate ki he 'aho 2 'o × 10 s 'i he siakale 'o e 1 mo e amplitude 80 mo e UP50H Ultrasonic Processor (Hielscher, ha tekinolosia, Teltow, 'i Siamane). Talu mei ai na'e centrifuged ai 'a e naunau ki he miniti 'e 10 'i he toko 14,000 'a e rpm pea na'e faka'aonga'i 'a e supernatant ki he blotting 'o e Hihifo. Na'e kai 'i he sipinga 'o fakapotopoto mo reducing fakafofonga (Invitrogen) 'a e μg 'o e uofulu ma nima 'o e polotiini pea toki fakamavahe'i 'e SDS 'i he PEESI hono faka'aonga'i 'o e gels 'o e polyacrylamide % 'o e 4 – 12 (Invitrogen) pea hiki ki ha nitrocellulose manifi (tokanga'i 'o e mo'ui lelei GE). Na'e ta'ofi 'e he manifi ki h 1 mo TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) 'oku 'i ai 1% casein (Sigma-Aldrich) mo e 1% Tris (m 'e 1). Hili 'a e ta'ofi 'o e, na'e incubated e manifi mo hono ngaue'i holo ki'i ha po 'e taha 'i he 'aho 4 'o ° C mo e antibody Palaimeli (lapisi 'o e tangata 'o fakafepaki ki he Mamonga kautaha CBS 1/500, 'o fakatupulaki 'a e 'i he fale fakatotolo fakakemi 'o e Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Incubation mo e peroxidase 'o ha horseradish (HPR)-na'e fakahoko 'a e antibody conjugated hono ua (Dako) ki he 1h 'i he mafana 'o e loki. Na'e fakatupulaki 'e fakangalo'i kotoa 'e fakatupulekina chemiluminescence (Perkin 'Elema).

Ngaahi fakamo'oni fakafolofola/ngaahi tohi



Fekau'aki mo e feitu'u fakahihifo 'o e Blotting

Fakangalo'i 'oku founga ngaue analytical feitu'u DNA, RNA mo e polotini 'oku 'ave ki ha makehe koe'uhi ke lava ke nau mavahe.
He fakatonga 'o fakamolemole'i 'oku faka'aonga'i e fakatokanga vela 'o e DNA, e to'o fakatokelau ki he RNA mo e fakamolemole'i 'o e hihifo ki polotini.
Blotting 'o e Hihifo 'oku ui foki ko polotiini immunoblotting koe'uhi ko e ngaue 'aki 'a e ha antibody ke 'ilo'i pau 'a hono antigen. Ko e taha ia 'o e vakai'i 'o e fakamatala mahu'inga taha 'o e ngaahi founga ke 'ilo'i ai 'a e polotini pau 'i he sipinga 'o e Hihifo ko e Blotting. 'I he fakahihifo 'o fakamolemole'i, 'oku te ai 'a e polotini 'i he membranes ke 'ilo'i ai kinautolu 'o faka'aonga'i antibodies monoclonal pe polyclonal.
SDS-polyacrylamide gel polotini tu'ufonua electrophoresis (PEESI SDS) 'oku fakamavahe'i 'e he fa'unga 3-D pe denatured 'a e polotini 'a e loloa 'o e polypeptide. E polotini 'oku hili ia pea hiki ki ha manifi ('i he angamaheni ko e nitrocellulose pe PVDF), feitu'u nau 'oku 'uli'i ia 'aki antibodies pau ki he polotiini taketi. 'Oku fakakau 'a e sitepu ki he electrophoresis gel 'i he fakahihifo 'o fakamolemole'i 'analaiso e ke fakalelei'i 'a e palopalema 'o e cross-reactivity 'o e antibodies.
Hili ia, 'oku tamate'i 'a e polotini fakamavahe'i ki ha matrix (lahi taha pe 'i he nitrocellulose pe PVDF manifi), 'a ia 'oku nau 'uli'i ia 'aki antibodies. Ngaue ko ha vakili e antibodies pea 'oku filifili ki he polotiini taketi. 'Oku fakahaa'i 'e he e fakamatala fakaikiiki 'o e feitu'u 'oku 'i ai mo e malohi 'o e fai pau 'a e ngaahi fakaikiiki 'o e fakahaa'i ia 'o e polotini taketi 'i he sipinga 'o e foaki. Blotting fakahihifo 'o lava ke ne 'ilo'i 'a e taumu'a polotiini 'a ia 'oku ma'ulalo ange 'i he 1ng koe'uhi ko e ma'olunga hono fakalelei'i 'o e gel electrophoresis mo e specificity malohi mo ma'olunga 'a e ongo'ingofua 'o e immunoassay. 'Oku faka'aonga'i 'a e ngaahi founga fakafaiako he fakahihifo 'o fakamolemole'i 'i he saienisi 'o e mo'ui molecular, Gottingen, immunogenetics pea mo e ngaahi ngoue kehe 'o e fekumi 'i he ngaue.
'Oku kau 'i he ngaahi founga kehe 'oku fekau'aki mo e Toti 'o fakamolemole'i 'analaiso, immunohistochemistry mo immunocytochemistry fe antibodies 'oku ngaue 'aki ke 'ilo'i ai 'a e polotini 'i he pepa holoholo mo e fanga ki'i selo 'e immunostaining, mo e fakafehokotaki 'e he enzyme immunosorbent assay ('ELISA).