Ультразвуковое производство высокоочищенных шизофиллановых β-глюканов

Шизофиаллан – грибковый β-глюкан с иммуномодулирующими свойствами. Для высокоактивного лекарственного воздействия шизофиллан должен иметь низкую молекулярную массу, чтобы показать улучшенную биодоступность. Было доказано, что ультразвук снижает молекулярную массу шизофиллана. Как надежный и эффективный метод, обработка ультразвуком может быть легко применена для получения низкомолекулярного шизофиллана.

Грибы Шизофиллум

Виды гриба Schizophyllum растут в природе на разлагающихся деревьях после сезонов дождей. Плодовые тела собирают в следующий сухой сезон. Виды Schizophyllum богаты биохимическими соединениями, такими как глюканы, и поэтому потребляются особенно в тропических странах в качестве пищи и лекарств. Благодаря своим иммуномодулирующим, противогрибковым, противоопухолевым и противовирусным свойствам, коммуна Schizophyllum, также известная как гриб Splitgill, привлекла биотехнологические и фармацевтические компании.
Полисахарид шизофиллан, также известный как сизофиран, сонифилан или сизофилан, является основным β-глюканом, обнаруженным в грибах Schizophyllum, которые предлагают высокоэффективный биологически активный β-глюкан шизофиллан.
Грибы коммуны Schizophyllum растут в природе на деревьях, мицеллиум также можно культивировать в ферментационном бульоне. Для фармацевтических и косметических применений низкомолекулярный шизофиллан намного более эффективен, чем высокомолекулярный шизофиллан. Это связано с тем, что низкомолекулярный шизофиллан показывает значительно лучшую биодоступность и скорость всасывания. Кроме того, высокомолекулярный шизофиллан часто проблематичен в приложениях, поскольку он приводит к высокой вязкости его водных растворов.
Ультразвуковое уменьшение размера является высокоэффективным и надежным методом снижения молекулярной массы шизофиллана, тем самым повышая качество молекулы β-глюкана.

Протокол по производству низкомолекулярного шизофиллана

Поскольку молекулярный шизофиллан демонстрирует значительно лучшую биодоступность и свойства применения, исследовательская группа Smirnou исследовала ультразвук для расщепления и уменьшения размера молекулы β-глюкана шизофиллана.

Ультразвуковая обработка шизофиллана

β-1.3(1.6)-Глюкан шизофиллан (SPG) был получен путем подводного культивирования гриба S. commune в биореакторе с использованием сахарозы в качестве субстрата.
После окончания культивирования культуральный отвар разбавляли деминерализованной водой до концентрации шизофиллана 2 г/л и ультразвуком Ультразвуковой процессор UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Германия) в режиме рециркуляции при следующих параметрах и условиях: расход среды 50 мл/с, частота 20 кГц, мощность 2000 Вт, сонотрод типа BS2d22, бустер типа B2-1.4 и амплитуда 100%. Температура культурального бульона в начале обработки ультразвуком составляла 25°С. Ультразвуковой культуральный бульон (удельная потребляемая энергия 100 Вт/мл) фильтровали через глубинный фильтр Seitz HS800 под давлением 1,5 бар при 40°C. Ультразвуковой шизофиллан (uSPG) для химической характеристики осаждали из фильтрата с тройным количеством изопропилового спирта при лабораторной температуре и сушили при 60°C для 12 ч uSPG растворы для иммунологических исследований получали следующим образом: (1) ультразвуковой культуральный фильтрат бульона диафильтровали через кассету PES серии Pall Centramate T (отсечка 100 кДа) при 0,8 бар и диафильтрацию продолжали до тех пор, пока ретентитарная проводимость не составила 20 мкСм/см; (2) раствор концентрировали диафильтрацией до концентрации uSPG 1 г/л и стерилизовали автоклавированием при 120°C/20 мин. Денатурированный uSPG получали аналогичным образом, за исключением того, что NaOH добавляли в культуральный фильтрат бульона в концентрации 0,2 М и подщелачиваемый раствор инкубировали в течение 30 мин при лабораторной температуре перед диафильтрацией.

Аналитические методы

Выход мицелия оценивали гравиметрически: культуральный отвар разбавляли водой 1:4, центрифугировали 10000 × г при 25°С в течение 20 мин, осадок промывали тройным количеством воды, сушили при 60°С и взвешивали. Шизофиллан осаждали из надосадочного вещества с тройным количеством изопропилового спирта, сушили при 60°С в течение 24 ч и определяли его выход гравиметрически. pO2 в культуральном бульоне измеряли оптическим зондом Hamilton-Visiferm DO 120 (Гамильтон, Швейцария).
Динамическую вязкость культурального бульона измеряли на тестере HAAKE Visco Tester 6L со шпинделями 1L и 2L при 4°C и скоростью вращения 30 об/мин. Скорость фильтрации рассчитывали от времени фильтрации 500 мл культурального бульона до 200 × 200 мм глубинного фильтра Seitz HS800 (Pall, США) при давлении 1,5 бар и 40°C.
Молекулярную массу uSPG измеряли SEC-MALLS на ВЭЖХ-системе Alliance (Waters) с последовательно подключенными колонками PL aquagel OH60 и PL aquagel OH40, а детектор miniDAWN TREOS (Wyatt) концентрировали диафильтрацией до концентрации uSPG 1 г/л и стерилизовали автоклавированием при 120°C/20 мин. Денатурированный uSPG получали аналогичным образом, за исключением того, что NaOH добавляли в культуральный фильтрат бульона в концентрации 0,2 М и подщелачиваемый раствор инкубировали в течение 30 мин при лабораторной температуре перед диафильтрацией.

Результаты:
Ультразвуковая обработка была применена непосредственно к 144-часовому культуральному бульону S. commune с мицелием для облегчения последующей обработки SPG.
Характеристики шипофиллана ультразвукового: Ультразвуковой шизофиллан (uSPG) осаждали из культурального бульонного фильтрата спиртом и характеризовали. По оценкам SEC-MALLS, МВт uSPG составляет около 1 МДа. Средняя молекулярная масса шизофиллана от жидкого брожения составляет примерно 5 МДа, в то время как при твердотельном культивировании она может достигать до 10 МДа. Сравнивая молекулярную массу ультразвукового шизофиллана с молекулярными массами нативного необработанного шизофиллана, можно наблюдать снижение молекулярной массы от 5 до 10 раз за счет ультразвуковой обработки.
Обработанный ультразвуком полисахарид uSPG содержал 0,7% мас./мас. белка и 1,0% мас./мас. остатка после воспламенения. Гидролизат uSPG состоял из глюкозы более чем на 99%. Аналитические результаты показывают, что обработка ультразвуком случайным образом расщепляет β-глюкановую основу, а боковые ветви остаются нетронутыми, тем самым уменьшая размер и молекулярную массу шизофиллана. Иммунологические исследования по существу не содержащего белка и эндотоксина uSPG показали, что ультразвуковой низко-Mw шизофиллан обладает выраженной иммуномодулирующей активностью.

Пониженная вязкость: Ультразвуковое лечение привело к значительному снижению вязкости культурального отвара. Во время ультразвуковой обработки вязкость культурального отвара изменялась нелинейно: снижение вязкости было быстрым в начале ультразвуковой обработки, но позже замедлилось. Удельный энергозатрат 100 Вт/мл был достаточным для снижения вязкости культурального бульона почти в 7 раз.

Улучшенная фильтрация: Обработанный ультразвуком культуральный бульон протекал через фильтр быстрее, чем необработанный культуральный бульон (удельный вход энергии 0 Вт/мл) с высокомолекулярной СПГ. Кроме того, ультразвуковая обработка значительно снизила потери продукта во время фильтрации. Фильтрат необработанного культурального бульона с высокомолекулярной СПГ (удельный вход энергии 0 Вт/мл) содержал 0,3 ± 0,07 г/л СПГ, в то время как концентрация СПГ до глубинной фильтрации составляла 2 г/л. Напротив, фильтрат ультразвуковой культуры мощностью 100 Вт/мл содержал СПГ в концентрации 2,2 ± 0,2 г/л, что соответствует почти нулевым потерям продукта.

Заключение: В своем заключении исследовательская группа резюмирует, что ультразвуковая обработка является эффективной технологией производства низкомолекулярного шизофиллана, который затем может быть использован в косметике и медицине. Ультразвук, при нанесении на полный культуральный бульон с мицелием, приносит определенные преимущества производству шизофиллана. Это снижает потери продукта при последующей переработке и делает возможным производство высокоочищенного полисахарида благодаря эффективному использованию ультрафильтрации.
Кроме того, исследователи обнаружили, что ультразвуковая обработка шизофиллана легко масштабируется. Один блок опытного завода ультразвукового дезинтегратора UIP2000hdT переработал 1 литр культурального отвара за 110 с в проточном режиме. Производительность системы может быть легко увеличена за счет последовательного подключения дополнительных ультразвуковых установок.

Высокопроизводительное ультразвуковое оборудование для грибковой обработки глюканов

Фрагментация полисахаридов, таких как глюканы, а также других биологически активных соединений, таких как хитин и хитозан, может быть надежно обработана с помощью высокопроизводительного ультразвукового оборудования Hielscher. Наши ультразвуковые аппараты могут обеспечивать высокие амплитуды, обеспечивают точный контроль над параметрами процесса и могут работать 24/7 при большой нагрузке и в сложных условиях. Линейка оборудования Hielscher Ultrasonics надежно отвечает этим требованиям. Помимо выдающихся ультразвуковых характеристик, ультразвуковые аппараты Hielscher могут похвастаться высокой энергоэффективностью, что является значительным экономическим преимуществом. – особенно при использовании на коммерческом крупномасштабном производстве.
Ультразвуковые аппараты Hielscher - это высокопроизводительные системы, которые могут быть оснащены аксессуарами, такими как сонотроды, бустеры, реакторы или проточные ячейки, чтобы оптимально соответствовать вашим потребностям процесса. С цифровым цветным дисплеем обеспечивается возможность предустановленных запусков ультразвука, автоматическая запись данных на встроенную SD-карту, дистанционное управление браузером и многие другие функции, высочайшее управление процессом и удобство для пользователя. В сочетании с прочностью и большой несущей способностью ультразвуковые системы Hielscher являются вашей надежной рабочей лошадкой в производстве. Снижение молекулярной массы β-глюканов, таких как шизофиллан, требует мощного ультразвука для получения целевого расщепления и конечного высококачественного продукта шизофиллана, который может быть использован для фармацевтических применений.

В приведенной ниже таблице приведена приблизительная производительность наших ультразвуковых аппаратов: