Extracción ar proteínas ultrasónica tejidos ne cultivos celulares
- Extracción proteínas ge 'nar bi thogi nt'ot'e ar muestra esencial jar proteómica.
- Proteínas xi extraer ar do̲ni ne tejidos animales, levaduras ne microorganismos.
- Sonicación ge 'nar nt'ot'e extracción proteína confiable, ya nt'ot'e xi hño di rendimientos proteínas mbo 'nar pa ar extracción hingi maa.
Extracción proteínas tejidos ne células
Extracción proteínas ya tejidos ne ya células cultivadas ge 'nar bi thogi mfädi esencial muestra realiza Nxoge dí técnicas bioquímicas ne analíticas komongu ar ELISA, PAGE, Ar borrar occidental, espectrometría masas, wa ar purificación proteínas. Ultrasónico interrupción, ar lisis ne ar extracción ar célula ge 'nar técnica precisamente controlable pa xi hño altos rendimientos proteínas.
Extracción proteínas ar tejido animal
Pa ar nt'ot'e nga̲tho tamaño tejidos (riñón, mu̲i, pulmón, músculo, etc.), ar tejido da da disecado jar trozos xi t'olo bo̲jä nu'u̲ limpias, dige hielo ko preferiblemente ne xähmä nu'bu̲ 'me̲t'o nu'bu ar degradación ya proteasas (hne. ej. tampón lisis komongu) RIPA wa lisis hipotónica buffer da contiene ya proteasa ne fosfatasa inhibidor cóctel). 'Mefa xta disección, ar muestra bí sumerge jar nitrógeno líquido pa congelar ngutha. Ar muestra to conservar ar a — 80 ° C pa ár 'mefa ár njäts'i Tange'u njapu'befi wa da cuidadas jar hielo homogeneización inmediata. Ngut'a 'be̲tho ar extracción ultrasónica, tampón ar lisis ntse̲t'i ar hielo (ko ar inhibidores ar proteasa TDT, leupeptin ne aprotinina) rápidamente ar agrega jar tubo muestra (ya ~ 10 mg tejido ar recomiendan aproximadamente ~ 600 μL tampón). Aprox. 20 — 60mg tejido ar recomendado ya tubo muestra.
Homogeneización ultrasonidos, lisis ne extracción ar realiza ko 'nar homogenizador ultrasónico Komo ar UP200Ht o UP200St, equipado ko 'nar sonda nts'ä. Sonicación duración ar 60 — 90 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i ja 'nar modo ciclo ultrasónico sonicación 15 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i ne pa descanso 10 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i. Ar muestra da conservar ar jar hielo nga̲tho ar pa.
'Me̲fa ar homogeneización ultrasónica yá extracción, lisada ar centrifuga bí 27.000 ar g Nxoge aprox. 20 t'olo ora 'me̲fa bí recoge ar supernatent, pa ndi concentración proteína to da determinada ja 'nar análisis proteína tales como ensayo Pierce proteína BCA.
Extracción proteínas ultrasónicas células ko UP200St
Extracción proteínas suero ya ji
Pa 'nar mezcla homogénea ar suero ne ar tampón fosfato, ar muestra ar agitar ar 'be̲tho lisis celular ultrasónico. Pa ar lisis ultrasónica, dá gi 'ñudi bí sonicó ko 'nar homogeneizador laboratorio ultrasonidos Komo ar UP100H 8 ciclos jar amplitud ar 20%, pa ya ciclos nu'bu̲ 5 segundos encendido ne 15 ya segundos apagado. Sonocation ar lleva da t'ot'e xi hño ya sonicationg jar ciclos ne colocando ar muestra hielo ir nge nä'ä bí evita 'nar degradación térmica ne sobrecalentamiento ar muestra. Ke ar suero contiene 'nar Nar dätä hño yá 'bede ya proteínas mar hñets'i be̲xu molecular (tales como albúmina, α1 — antitripsina, transferrina, haptoglobulin, inmunoglobulina G ne inmunoglobulina A), da interfieren ko ar separación proteínas hñets'i'i be̲xu molecular Nxoge ar IEF, ar recomienda pa agotar ar suero ar utilizando 'nar columna agotamiento.
Extracción proteínas tejido ar planta
Tejido vegetal xi 'tu̲ki, za̲tho, ngu, musgo, etc., pe interrumpir ar hingi hembi da colocando ar he̲'mi muestra picada jar tampón lisis ya sonicación. Duro, ligenous ya tejidos, ar vegetales komongu ya semillas, agujas abeto etc., da to ar ximha̲i seca. 'Ra ya duros, materiales do̲ni leñosas tsa da congelados ne nitrógeno líquido antes ar obtuvieron ya sonicación. Planta celular jár 'mui suspensiones, 'nar nt'ot'e ya ultrasonido entre 30 ne 150 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i ja 'nar tampón lisis ga̲tho ar xingu. Hñei mäs resistente komongu ya semillas calabaza requieren 'nar mäs intensa sonicación Komo ar pede tso̲kwa continuación.
Nthuts'i nkohi extracción ultrasónica albúmina ya semillas calabaza
Pa ar extracción ultrasónica proteína albúmina polvo semilla calabaza fina jar ha̲i, jar 'nar Baso ar precipitados vidrio 250 ar mL ar añaden 10 g semillas calabaza desgrasada polvo ne 100 mL ar dehe desionizada komongu solvente. Ar extracción ar proteína ir bo̲ni jar yoho ya pasos: jar ndu̲i lugar, ar muestra bí sonicó ko 'nar ultrasonicador ar klase sonda UP400St (400W, 24kHz) ko sonda montada S24d7. Ar Baso vidrio ar coloca ja 'nar nsaha ar dehe fría Nxoge ar homogeneización ultrasónica. Ar za ar ultrasonicador UP400St ko sensor mpat'i extraible asegura ke ar mpat'i ar muestra bí mantiene nzäm'bu̲ por debajo de 30 ° c.ndunthe Control preciso ar mpat'i Nxoge jar sonicación, bí evita ar desnaturalización ar albúmina. Jar segundo lugar, ar extracción bí realizó ko 'nar batidora velocidad 200 rpm ne 30° c.ndunthe Gem'bu̲ bí transfiere ar Baso 'nar agitador termostático. Globulina ar elimina ir nge ya diálisis ko ar dehe destilada. 'Me̲fa ar retiro globulina, extracto proteína to da muestreado pa ár njäts'i ya perfil ar albúmina ne ar ajusta 'mefa da pI = 3.0 utilizando 0.1 M HCl pa coagulación albúmina. Ar fase ar sólida bí separa ya centrifugación 5000g, 20° C ne redisuelve jar dehe desionizada. Coagulación albúmina ar realiza yoho ya 'nandi pa aumentar nä'ä da 'yadi wa ya proteína ja ar concentrado ar albúmina.
Extracción proteínas alcalinas ultrasónico pa jar nt'ot'e proteína concentrado ar Arros salvado demuestra da ya resultados ar nt'ot'e ultrasónico jar proteínas mäs rendimiento ja 'nar pa significativamente mäs hingi maa ja ar extracción – Comparado ko ar nt'ot'e ar extracción convencionales.
VialTweeter pa ar sonicación indirecta.
- ngut'a
- altos rendimientos
- altamente nt'ot'e xi hño
- Control preciso ya parámetros
- resultados reproducibles
- escalabilidad lineal
Nthuts'i nkohi nt'ot'e muestra pa ar enzima iNOS funcional
Da uni ar enzima iNOS completamente funcional (nt'udi pa detección drogas), bí recomienda ar Xtí nthuts'i nkohi: ar suspensión células da t'ot'e jar hielo ne da t'uni ultrasonidos ko 'nar UP100H ko amplitud 10 jar modo ciclo ku̲t'a ya 'na̲te ya mfe̲ts'i sonicación ne 25 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i descansan ja ar hielo. Ar nt'ot'e da 'yo̲t'e ar aproximadamente 3 bes. Ar pa ntsa̲ya̲ ja ciclos sonicación reduce ar aumento ar mpat'i ne ir reduce riesgo desnaturalización.
Solubilización proteína ultrasónico
Sonicación ar tsa̲ da acelerar ar proceso solubilización proteína, ne nu'bu̲ da nthe̲hu̲ 'ra requiere ar ndunthe ya ora. Pa hingi sobrecalentar jar muestra ne nu'bu ar degradación proteínas ne nyokwi jar soluciones da contengan ya urea, ya explosiones ultrasónicas hingi tsa durar nä'ä da 'ra ya ya 'na̲te ya mfe̲ts'i.
Instrucciones Nxoge
Control mpat'i: Pa xi hño 'nar rendimiento mar hñets'i hmädi proteico hinda desnaturalización térmica, da controlar ar ar mpat'i Nxoge ar extracción. Homogeneizadores ultrasónicos ar dätä arte Hielscher – 'nehe llamado desintegrador ultrasónico wa ya sonificator – ya precisamente controlable. Ba ko 'nar sensor mpat'i extraible. Ja ya opciones configuración homogenizador ultrasónico, ar to da t'ot'e 'nar mpat'i máxima. Nu'bu̲ ar alcanza nuna ar máximo mpat'i, ultrasonicador pa automáticamente asta ar muestra ar xi enfriado.
Almacenador intermediario: Ar jwahni 'nar buffer adecuado ne ar volumen na za búfer varían ar tejido jar tejido ne tsa da calculado — out ya pruebas ensayo ne error.
Aislamiento yá purificación: Lisados ar proteína xi contener 'nar exceso biomoléculas komongu ar ADN wa ar carbohidratos, ya ne nuya tsa da removidos ya precipitación proteínas (ácido tricloroacético desoxicolato) wa cambio buffer.
Chittapalo ne Noomhorm (2009) informaron da rendimiento proteína bi hñuts'i utilizando sonicación ne da proceso ar homogeneización ultrasónica ar tejido ne ar lisis to mejorar significativamente ya procesos ar extracción 'bui – habilitación 'ra'yo hño extracción yá 'ma.
Homogeneizador ultrasónico ar tejido UP200St pa extracción nt'ot'e xi hño jar proteína
Control explorador pa 'nar operación precisa ne seguimiento proceso sonicación
Equipo ultrasónico pa ar extracción proteínas
Hielscher Ultrasonics ofrecen 'nar nt'ot'e ho 'bui ndunthe ya gama ar Homogenizadores ultrasónicos da desintegración ya células, tejidos, bacterias, microorganismos, levaduras ne ar esporas.
Ultrasonicators laboratorio Hielscher ya potentes ne ya fáciles ar operar. Construido pa 'nar funcionamiento 24 yá 7, gi 'bu̲hu̲ diseñados komongu ar dispositivos sobremesa robusto ne ya nt'ot'e xi hño ar laboratorio. Pa nga̲tho ya dispositivos, ar salida ar energía ne ar amplitud xi da precisamente controladas. Ar nt'ot'e ho 'bui ndunthe gama ar Accesorios ar gi xoki mäs opciones configuración. Ya dispositivos digitales tales komongu VialTweeter, UP200Ht, UP200St, ne UP400St pe̲ts'i 'nar control ar mpat'i mfaxte ne 'nar tarheta SD incorporada pa grabación datos automáticas.
Pa ar sonicación indirecta, dí contaminación cruzada ne simultáneo múltiples muestras, ofrecemos ar VialTweeter wa ar Cuphorn ultrasónico.
Dependiendo de ár nt'ot'e, ar hñei ne volumen muestra, gi recomendamos ar configuración xí adecuada pa jar nt'ot'e ar muestra. Contactar ga nu'bya xkagentho!
Ot'a yá referencias
- Chittapalo T, ma Noomhorm (2009): Álcali asistida ultrasónica extracción ar proteína salvado Arros desengrasado ne propiedades ar proteína ar concentra. Int J Food Sci Technol 44:1843 — 1849.
- Ar Simões, André:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofía ne.; Rodrigues, ar Pedro M.; Nä'ä, c.ndunthe Adrian; D 'nar Hooge, Rudi; Boi, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, ar Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Eficientes ar recuperación proteínas muestras múltiples fuente 'mefa xta trizol wa trizol LS ARN extracción ne almacenamiento ya'bu̲ ar plazo. BMC Genomics 2013, 14:181.
Hechos Bale ar penä ga pädi
Proteómica
Proteómica ar hwähi nthoni da investiga ya proteínas ne ar proteoma. Proteínas cubrir 'nar nt'ot'e ho 'bui ndunthe ya gama 'befi vitales mbo ja ya hmunts'i. Ar proteoma ge ar conjunto proteínas xi hño ir nge 'nar genoma, célula, tejido wa organismo ja 'nar t'olo ora determinado. Ar proteoma varía ko ar pa ne 'ña'ño requisitos wa tensiones, da somete ja 'nar célula wa ya organismo. Mäs específicamente, ar conjunto proteínas xi hño jar determinado 'nar klase ar célula wa ya organismo, ja ya 'nar t'olo ora dado, jár nkohi njäts'i. Ar ngäts'i ge 'nar mezcla proteínas ne ar genoma. Proteómica ar estudio ar proteoma.
Proteína
Ya proteínas ya biomoléculas dätä, macromoléculas llamadas – nä'ä bí componen ja 'nar wa mäs cadenas largas ar aminoácidos. Ya proteínas gi 'bu̲hu̲ 'bui nga̲tho ya Hmunts'i ndu'mi vegetal ne ya animal ne ya cruciales pa mäs ndunthe ja yá 'befi ar biológicas. Ke ya proteínas contienen 'nar Nar dätä hño yá 'bede ya ungumfädi biológica, bí extrajeron ngäts'i analíticos, ngu, pa investigaciones proteómicas. Ar función mäs mahyoni realizada ir nge ya proteínas incluyen ar catálisis reacciones metabólicas, ar replicación ar ADN, respuesta jar estímulos ne ar transporte moléculas 'nar lugar ma ma'na. Ya proteínas ar diferencian principalmente jar ár secuencia aminoácidos, nä'ä ar dictado ya secuencia nucleótidos ya genes, ne da nu'bu̲ da nthe̲hu̲ 'ra bí traduce jar proteína plegable ja 'nar estructura tridimensional específica da determina ár nt'ot'e. Ya proteínas ya – 'Nehe péptidos – 'na ya componentes clave ya nts'i. Ir ar proteómica ge 'nar potente herramienta jar ciencia ya nts'i pa optimizar procesos, ntsuni alimentaria ne valoración nutricional.
Electroforesis jar gel ya
Electroforesis jar gel ge ár nt'ot'e principal pa separación ne análisis macromoléculas tales como DNA, ar RNA ne ar proteínas, nja'bu Komo yá fragmentos, basados ár tamaño ne ar carga. Ar gi japu̲'be̲fi química clínica da separar ya proteínas ya carga wa tamaño (agarosa IEF, esencialmente Ndäse̲ ja ar tamaño) ne jar Bioquímica, biología molecular ne ar proteómica da separar 'nar nthogi mixta fragmentos ADN ne ar ARN ir nge ar longitud, pa nda estimar ar tamaño ar Fragmentos ADN ne ARN wa da separar ya proteínas ya carga.
Cultivos celulares
Cultivo celular ar proceso crecimiento controlado ir nge ar nuna ya células bí cultivan jár nkohi controladas. Nkohi cultivo celular varían pa kadu̲ ar klase ar célula. Da general, mbo jar ximha̲i 'nar cultivo celular ir bo̲ni jar 'nar recipiente adecuado (nt'udi, placa ar Petri) ko sustrato wa nt'uni da suministra ya nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores crecimiento, hormonas ne gases (CO2, Wa2) ne regula mbo jar ximha̲i physio — chemical (tampón ar pH, presión osmótica, mpat'i). Mäs xingu ya células t'ot'e 'nar superficie wa sustrato artificial, mente ne ma'ra culturas célula xi da cultivado mpe̲fi flotando en medio de cultivo (cultivo suspensión, suspensión ar célula).
Totales cultivos líneas celulares animales ar utilizan jar producción industrial vacunas virales ne ma'ra productos derivados ar biotecnología. Ar cultivan células nänä humanas pa ntu̲ngi hñuts'i ya células ne ya células ar diferencian jar varios xingu ya células somáticas pa ar ngäts'i ar trasplante.
Muestras tejido
Ar tejido ar ngäts'i pede 'nar celular intermedio, ho ar he̲'mi ar célula xi 'nar za̲ ár nthe̲ organizativo ja ya células ne 'nar jar completo. Ar tejido, ja ya células similares, ndezu̲ ar xkagentho 'rini da conjuntamente realizan 'nar función específica, gi montadas. Agrupación funcional tejidos múltiples, mi o̲t'e ya estructuras complejas Ts'ut'ubi.
Ar muestras tejido pa ár nthoni jar biología, histología yá histopatología, Parasitología, bioquímica, inmunohistoquímica, nja'bu̲ Komo pa cultivar ne extraer ADN. Ar tsa̲ da distinguir entre me̲ti (Subdivisión: tejido mamíferos) ne tejido ar planta. Ya tejidos animales ar agrupan ja ya goho xingu hontho ar conectivo, muscular, nervioso ne tejido epitelial. Tejido ar planta bí subdivide ja ya nuya sistemas hñu ya tejidos: ar tejido vascular, ar epidermis ne ar tejido ar planta.
Xi hoki ya muestras tejido me̲ti wa ya xeni jar planta, ngu, hueso, músculo, hojas, etcetera.
Fluidos corporales
Ya ji, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, saliva ne ar líquido sinovial ya fluidos corporales, da ofrecen 'nar Nar dätä hño fuente ungumfädi diagnóstico relevante. Ir ar mahyoni 'nar sofisticada nt'ot'e muestras líquidos corporales da análisis. Ar ndui dificultad ar asocia ko ar nthegi xi hño. rango dinámico ja ya componentes 'bui ja ya fluidos corporales.
Njäts'i ár concentración ar proteína
Ensayo ar Bradford, Lowry análisis ne ensayo bicinchoninic ácido (BCA) ge ensayos pa ngatho pa ar tsa da jäts'i concentración proteínas. Albúmina suero bovino (BSA) ge 'na ya proteínas mäs utilizadas estándar.
Tampón lisis
Tampón lisis da da elegido ir nge ar he̲'mi ar célula wa tejido (cultivo ar tejidos, do̲ni, bacterias, hongos, etc.), ne nu'bu̲ ya células gi 'bu̲hu̲ 'nar estructura ne ar klase ar estructura. 'Nar nt'ot'e ho 'bui ndunthe gama almacenadores intermediarios lisis pa ar extracción proteínas, membranas ne orgánulos gi formulados ko detergentes 'na wa nä'ä. Ar detergente ar selecciona nu'bu̲ da nthe̲hu̲ 'ra ir nge ya pruebas ensayo ne error wa – Nu'bu̲ xi disponible – de acuerdo a 'nar nthuts'i nkohi ar extracción proteína existente. Ar detergente da da compatible ar fuente tejido ne ya proteínas. Jar Nxoge, ar detergente mäs za̲tho da mpe̲fi pa 'nar tejido específico yá proteína, ar elegido pa da zeti ar máxima funcionalidad ar extracto. 'Nehe, nu'bu 'nar extracción ya membranas ne organelos, 'nar detergente za̲tho mantiene ar membrana intacta. Detergentes utilizados tampones lisis ya jar ár dätä hingi iónicos wa zwitteriónico, ngu, grietas, desoxicolato, Triton™ X — 100, ar NP40 ne ar Tween 20.
Ngu, ya tejidos komongu ar cerebro, hígado, intestino, riñón, bazo etc. xi simplemente almacenar temporal ko RIPA – wat'i ya inhibidores proteasa ne TDT (nt'udi pa ar electroforesis jar gel) tsa incluir ar.
Tampón lisis tejido muscular esquelético (helada): 2,7 mM KCl jar 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1% Tritón X — 100, glicerol 10% (w/v), 1 mM EDTA, 1 mM Ditiotreitol complementado ko inhibidor ar proteasa ne ar fosfatasa cóctel
Tabla buffers hne ngatho ne ár rango ar pH. Da general, nuya buffers ar utilizan normalmente jar concentraciones 20 — 50 mM.
| Tampón ar | rango pH |
|---|---|
| Ácido cítrico – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Citrato sodio – Ácido cítrico | 3.0 – 6.2 |
| Acetato sodio – ácido acético | 3.6 – 5.6 |
| Sal sódica ácido cacodílico – Ácido clorhídrico | 5.0 – 7.4 |
| AR ZÄNÄ – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Fosfato ar biácido ar sodio – fosfato hidrógeno disódico | 5.8 – 8.0 |
| Imidazol – Ácido clorhídrico | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Hidrocloruro trietanolamina – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Ácido clorhídrico | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricina – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraborato sodio – ácido bórico | 7.6 – 9.2 |
| Bicina – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glicina – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Almacenadores intermediarios 'nar dätä xe̲ni muestran 'nar dependencia pH ko ar mpat'i. Esto es hontho makwäni pa ya búferes Tris. Ar tse̲ yá mpa̲ti ar pKa 8.06 ma 25° C da 8.85 ya 0 ° c.ndunthe
(pH ne pKa 'nar tampón: hñeti ar pH ar concentración iones hidrógeno ja 'nar njäts'i acuosa. pKa (constante disociación ácida =) ge 'nar relacionado, pe ar medida mäs concreta, da ayuda ya predecir Temu̲ actuará 'nar molécula 'nar hmädi pH específico.)
TRIzol
TRIzol ge 'nar njäts'i química nä'ä da gi japu̲'be̲fi pa extraer ar ADN yá ARN yá proteína Nxoge ar extracción ar tiocianato — fenol — cloroformo ar guanidinio. Njapu'befi ya ultrasonidos asistida TRIzol extracción resulta jar altos rendimientos DNA, RNA ne proteínas xkagentho muestra ne sobresale nuna ar modo ma'ra ya nt'ot'e extracción.