Tecnología ultrasonido Hielscher

Ultrasónico lisis ar e. Coli

  • Bacteria e. coli ge ar bacteria xí comúnmente utilizada Microbiología ne ar biotecnología.
  • Disruptores endocrinos ar célula ultrasonidos proporcionan resultados fiables ne reproducibles pa ar lisis ar e. coli.
  • Intensa aún mi precisamente controlables cavitación esquileo ya ndu nzafi ne ocasionar nxo̲ge ar interrupción ne ar extracción mar hñets'i rendimiento (ngu proteínas, ADN).

Interrupción célula ir nge ar cavitación

Bacteria Escherichia coli ar lisis confiablemente usando Homogeneizadores ultrasonidos ar tejido.Homogeneizadores ultrasónicos ar klase sonda operan ko aproximadamente 20.000 ciclos ya mfe̲tsi (20kHz) ne causa cavitación jar líquidos wa ya supsensions. Áreas microscópicas ar cavitación acústica vacío — komongu presiones ne altas temperaturas da desgarrar ya células. Anke ya temperaturas ar xi alcanzar varios miles ya grado ar centígrados, volúmenes cavitación ya ngut'ä t'olo hingi calientan considerablemente ar proceso. Ar ultrasonido genera ar cavitación acústica ne ya ndu nzafi Ts'ut'ubi perforan wa rompen ar membrana ar célula ar e. coli – dependiendo de ar za ar dispositivo homogenizador ultrasónico.

Ventajas lisis ultrasónico

  • control preciso lisis (intensidad, amplitud, mpat'i)
  • óptima adaptación ma muestras específicas
  • control mpat'i
  • pa muestras xi t'olo ma na dätä (μL ma litros)
  • ár nt'ot'e mecánico binu
  • escalado lineal ndezu̲ ar laboratorio ar producción
Ar dispositivo ultrasónico VialTweeter permite ar nt'ot'e muestra simultánea asta 10 viales jár da ehese̲ ar nkohi proceso. (Click pa agrandar!)

VialTweeter pa lisis ultrasónico

Nu'bu da 'yadi ungumfädi




Pets'i ja ma Nt'eje privacidad.


Gem'bu̲ ar lisis química ne enzymtic xi da problemático – lisis químico xi alterar estructuras proteínas ne presenta hñäki purificación ne lisis enzimática requiere pa incubación bes ne hingi ar reproducible – disrupción ultrasónica ge 'nar nt'ot'e ár interrupción ar sofisticada, ngut'a ja ar célula.
Ar lisis ar ultrasónica ar basa únicamente ja ya ndu nzafi mecánicas. Hingi ar añaden sustancias químicas, ar sonicación 'wagi Jot'i celular ya nsani cortantes. Lisis ar química ar tsa̲ da alterar ar estructura ya proteínas ne introducir hñäki purificación. ar interrupción enzimática requiere largos tiempos incubación ne hingi ar reproducible.

Mfädi Nxoge

UP400St ultrasonicador ko reactor flujoSonicación ar técnica mäs njohya yá 'mu̲ise̲ pa lisis cantidades xi t'olo, medianas ne ya dätä suspensiones celulares – ya ar pico-litros asta 100 litros yá ora (utilizando 'nar celda flujo ultrasónico). Ya células ya t'ot'e jar lisis cavitación ne esquileo líquido. ADN 'nehe ar cortado Nxoge jar sonicación, nja'bu da Hingar mahyoni agregar ADNasa bí suspensión ar células.
Control mpat'i:
Dá gi 'ñudi ya prerefrigeración ne manteniendo ar muestra Nxoge ar sonicación hielo, degradación térmica ar muestra ar muestra to da mä 'met'o ar hingi hembi da.
Idealmente, ya muestras tsa da zeti ar heladas Nxoge jar lisis, pe pa mäs xingu ya muestras ar xingu nu'bu̲ ar mpat'i hingi ar eleva por encima de ar mpat'i ar cultivo wa ar fuente tejido. Ir ar recomienda, pa da zeti ar suspensión dige ar hielo ne ar sonicar ko varios pulsos ultrasónicos cortos 5 — 10 seg ne pausas 10 — 30 seg. Nxoge ya pausas, pa ar tsa̲ da disipar ar pa da t'ot'e 'nar mpat'i xí hñets'i'i. Pa muestras células mäs mña dätä, varios reactores celdas flujo ko chaquetas enfriamiento gi 'bu̲hu̲ da 'mui.

Protocolos pa jar nt'ot'e E. ya Coli lisados

Análisis jar hmä ne purificación proteínas recombinantes

Ar pelotilla ar e. coli ar sonicó ko 'nar ko ultrasonidos UP100H (Hielscher). Pa nä'ä di 'bui, precipitado ar células bí resuspendió jár tampón ar lisis ntse̲t'i (50 mM Tris — HCl ar pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ne enfriado jar hielo Nxoge 10 t'olo ora. Ne gem'bu̲ bí bí sonicada ar suspensión celular ko 10 ze̲di cortas 10 s seguido ya intervalo 30 s pa ar refrigeración. Ir último, restos células bí quitado ya ultracentrifugación 4° C Nxoge 15 min bí 14000 ar rpm. Pa ar confirmación jar hmä ar rPR, ar sobrenadante bí nixtri jar gel poliacrilamida jar 12% ne da analizadas ya SDS — PAGE ne Western blot. Purificación ar rPR bí 'yo̲t'e usando Ni2 +Resina — NTA (Invitrogen, USA) nä'ä mä ar guía ar fabricante. Ja xí etapa, bí utilizó ar nt'ot'e purificación xi. Ar pureza ar proteína purificada bí evaluada ir nge ya electroforesis jar gel poliacrilamida 12% ne 'mefa ár njäts'i Tange'u tinción azul Coomassie. Concentración ar proteína purificada bí medida ya kit ensayo proteína Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et jar el. 2016)

Disruptor celular ultrasónico UP100H (100W) ya lisis, alteración ar célula ne ar ADN ar Ts'ut'ubi.

Homogeneizador ultrasónico UP100H (100W)

Crecimiento ar célula, reticulación ne ya nt'ot'e extractos células ar e. coli

Pa coli SeqA ne E. ar viruta RNA polimerasa MG1655 wa MG1655 ΔseqA bí hñuts'i jar 37° C ja 'nar OD600 ar dige 0.15 jar 50 ml LB (+ 0.2% glucosa) 'be̲tho 27 μl formaldehído (37%) ir nge ya ml ar agregaron (concentración final 1%). Entrecruzamiento ar realizó jar agitación lenta (100 rpm) jar mpat'i ambiente Nxoge 20 min, seguido ar Temple ko 10 ml glicina 2,5 M (concentración final ar 0,5 M). Pa experimentos choque térmico, e. coli MG1655 bí crecida da medio 65 ml LB 30° C ja 'nar OD600 ar aproximadamente 0.3. 'Mefa 30 ar ml jár 'mui bí transferido ja 'nar matraz pre calentada jar 43° C ne ar resto 30° c.ndunthe Reticulación ne ar amortiguamiento bí Komo ar describió ma 'met'o mi, menu ne ya células ar mantuvieron da 30 wa 43 ° C Nxoge 5 ya t'olo ora 'be̲tho mäs lenta agitación jar mpat'i ambiente. Ya células ma recogidas ya centrifugación ne lavadas yoho ya 'nandi ko ar tse̲ TBS (pH7.5). 'Me̲fa resuspension jar 1 ml tampón lisis (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sacarosa, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, lisozima ar 10 mg yá ml) ne ar incubación 37° C Nxoge 30 min seguido ya adición 4 ml buffer IP, ya células ma sonicadas dige ar hielo 12 ar bes 30 ar seg ne ar 30 ar seg pausas jar 'nar UP400St procesador ultrasonidos (Hielscher Ultrasonics GmbH) ko 100% ar nts'edi. 'Mefa xta centrifugación Nxoge 10 ya t'olo ora da 9000 g 800 aliquotes μl ar sobrenadante ma almacenadas a — 20 ° c.ndunthe (Waldminghaus 2010)

Sobreproducción ne purificación enzimas.

Ya sobreproducción decahistidine (His10) — ko ar etiqueta proteínas, e. coli BL21 (DE3) bí transformó ko construcciones pET19b. 'Nar xui ar planas bí cosechado ya centrifugación, ne 1% ar utilizó da inocular 'nar jár 'mui ya hmä. Ya células da pET19mgtB ma cultivadas ma 22° C asta 'nar densidad óptica ma 600 nm (OD600) ar 0,7. Ar cultivo bí trasladado 17° C ne inducido ya IPTG 100 ar μM. 'Mefa xta 16 h, ar cultivo bí cosechado ya centrifugación 7.500 × g 4 ° c.ndunthe Ya células ar resuspendió jar njäts'i salina 50 mM ko tampón fosfato (PBS) ko 0,3 M NaCl ma pH 7.4 ne perturbadas ya ultrasonidos ko 'nar sonda nts'ä S2 jar ar UP200St ultrasonicador (Hielscher, Teltow, nu Alemäña) 'nar ciclo 0.5 ne 'nar amplitud 75%.
Sobreproducción decahistidine tagged GtfC bí inducida bí 37° C ja 'nar OD600 ya ar 0,6 ko 100 μM IPTG. Ya células ma gem'bu̲ incubadas Nxoge 4 h sofo ne lisis nu'u̲ bí indicó ma 'met'o mi pa MgtB.
Extractos celulares crudo ar centrifugaron bí 15.000 ar × g ne 4° C da sedimentos ya restos celulares. Ya extractos clarificados ma cargados ja ya columnas HisTrap FF crudo 1 ml usando 'nar ko ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Ya enzimas ar purificaron nä'ä mä nthuts'i nkohi fabricante pa elución gradiente proteínas ár etiquetado. Soluciones proteínas eluídas ar dializaron yoho ya 'nandi kontra 1.000 volúmenes 50 mM PBS, pH 7,4, ko 0,3 M ar NaCl da 4° c.ndunthe Ar purificación ar analizó ya 12% SDS — PAGE. Ar concentración ar proteína bí determinó ir nge ar nt'ot'e Bradford gi japu̲'be̲fi Roti — Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, nu Alemäña). (Rabausch et jar el., 2013)

Extracción proteínas ar Bacteria e. coli
'Nar proteína cebo ya 'befi (da este caso, MTV1 ar Arabidopsis thaliana) ar fundida 'nar etiqueta GST ne nt'untho nä'ä mä jar células BL21 Escherichia coli (e. coli).
1 gi 'nar pelotilla GST — MTV1 ne GST (correspondiente ma cultivo bacteriano 50 ml) ne resuspender tampón extracción jar tse̲ hielo 2,5 ar mL.
2 utilice 'nar ultrasonicador UP100H (equipado ko micropunta MS3 — sonda pa volúmenes t'olo (2 — 5 mL)) da romper ya células bacterianas asta da lisis, nä'ä ar indicada ya opacidad ar reducida ne ar aumento ar viscosidad. 'Me̲hna pe̲ts'i da da da t'ot'e ja ar hielo, ne bí recomienda da t'uni ultrasonidos jar intervalos (ngu 10 seg sonicando seguido ya 10 ar seg nu jar hielo ne bí nja'bu̲ bí sucesivamente). Hñeti gi 'ñehe ar hingi da t'uni ultrasonidos xi mextha ar intensidad. Nu'bu̲ bí detecta ar formación espuma wa ar formación precipitado 'nar blanco, ar intensidad da reducir ar.
3 transferir ár njäts'i ya bacterias sometidas lisis tubos ar microcentrífuga 1.5 mL ne centrifugar 4 ° C, 16.000 x g ir nge ar 20 ar min.

Proteínas modificadas alicina jar e. coli

Ar VialTweeter ge 'nar cómodo ultrasonicador pa homogeneización muestras t'oloNjäts'i contenido sulfidrilo ya 5, 5 — Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) ensayo
'Nar jár 'mui ar xui xudi MG1655 ar e. coli ar utilizó pa inocular made mínimo fregonas (1: 100). Jár 'mui bí cultivada aeróbicamente asta 'nar A600 0.4. Jár 'mui da dividió jar hñu culturas 15 ml pa ar nt'ot'e ar estrés. 'Nar jár 'mui hingi tratada mahyoni komongu control negativo. alicina 0,79 mM (128 μg ml)— 1) wa 1 mM diamida bí agregado ma 'na ya restantes yoho culturas kadu 'na. Culturas ar incubaron ya 15 ya t'olo ora 5 ml ja ya cultivo cosecharon ya centrifugación (8.525 × g, 4° C, 10 ya t'olo ora). Ya células ma lavadas yoho ya 'nandi ko 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2DESPUÉS AR AR4pH 7,4, almacenada anaeróbicamente 'bu̲ 'be̲tho ga) ne centrifugado (13.000 x g, 4 ° C, 10 ya t'olo ora). Ya células ar resuspendió jar buffer lisis (PBS ko Guanidinio 6 mM HCl, pH 7,4) 'be̲tho ar interrupción da 4 ° C ya ultrasonidos ()VialTweeter (ultrasonicador, Hielscher GmbH, nu Alemäña) (3 × 1 min). Restos células bí peleteado ya centrifugación (13.000 x g, 4 º C, 15 min). Ar sobrenadante bí transferido 'nar cubeta ar QS — macro 3,5 ml (10 mm) ko 'nar barra xí ar agitación magnética ne mezclado ko 1 ml tampón lisis. Extinción ya muestras bí monitoreado bí 412 nm ko 'nar espectrofotómetro Jasco V — 650 equipado ko ar soporte control mpat'i célula PSC — 718 (Jasco) jar mpat'i ambiente. Ar agregaron 100μl njäts'i 3 mM Ditiobis (2 — nitrobenzoico ácido). Extinción bí monitoreada asta zo̲ni ar saturación. Cálculo ar concentración tiol ar realizó ir nge ar ε ar coeficiente extinción412 = M 13.700— 1 cm— 1 TiO — 2 — nitrobenzoico ácido (TNB). Ya concentraciones tioles celulares ar calculan en base a 'nar volumen células ar e. coli 6,7 × 10— 15 litros ne ko 'nar densidad celular ár A600 = 0.5 (equivalente jar 1 × 108. ml células— 1 jár 'mui). (Müller et jar el. 2016)

Ja ár njäts'i ya glutatión Vivo

E coli MG1655 bí crecida jar made mínimo fregonas ja 'nar volumen Nxoge 200 ml asta 'nar600 ar 0,5 ar alcanzó. Jár 'mui da dividió jar 50 ml culturas pa ar nt'ot'e ar estrés. 'Me̲fa 15 min incubación ko alicina 0,79 mM, 1 mM diamida wa dimetilsulfóxido (control), ya células ar cosecharon da 4.000 g ma 4 ° C Nxoge 10 t'olo ora ya células ar lavaron yoho ya 'nandi ko tampón KPE 'bu̲ 'be̲tho resuspensión pellets jar 700μl buffer KPE. Pa deproteination, 300l ácido sulfosalicílico 10% (p/v) bí agregaron 'bu̲ 'be̲tho ar interrupción ya células ya ultrasonidos (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicador). Sobrenadantes ma recogidos 'mefa xta ar centrifugación (30 ar min, 13, 000 g, 4 º C). Concentraciones ácido sulfosalicílico disminuyeron 1% ir nge ar adición 3 volúmenes tampón KPE. Ar realizaron mediciones glutatión Nxoge ne GSSG nu'u̲ bí describió ma 'met'o mi. Ya concentraciones glutatión celular ar calculan en base a 'nar volumen células ar e. coli 6.7×10— 15 litros ne ko 'nar densidad celular ár A600 0(equivalente ma 1.5×108. ml células— 1 jár 'mui). Ar calcularon ya concentraciones GSH ya substracción 2 [GSSG] ar glutatión Nxoge. (Müller et jar el. 2016)

Disruptor ultrasónico lisis celular ne extracción hñei biológico (Click pa agrandar!)

Ultrasonicador ar klase sonda UP400St

Hmä mAspAT jä'i jar e. coli

Disruptor celular ultrasónico UP400St (400W) pa ar extracción ar materia intracelular (proteínas, organelos, DNA, RNA etcetera.)Ho̲ntho ar colonia ar E. coli BL21 (DE3) albergando jar hmä vector jar 30 ar mL ampicilina 100μg yá mL ko made Luria — Bertani (LB) ne gem'bu̲ cultivadas ma 37 º c asta ar densidad óptica (OD600) alcanzó 0.6. Ya células ma cosechadas ya centrifugación ma 4.000 x g Nxoge 10 t'olo ora ne resuspendió jar 3L xi 'ru̲ki LB made da contiene ampicilina 100μg yá mL.
'Mefa, ar hmä ar proteína bí indujo ko 1 mM isopropílico β — ᴅ — 1 — tiogalactopiranósido (IPTG) pa h 20 da 16 º c.ndunthe Ya células da cosecharon ya centrifugación 8.000 × g ya 15 ya min ne lavaron ko tampón (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7.4). Ar obtuvieron células aproximada 45g (be̲xu nxa) ar jár 'mui 3 ar L. 'Mefa xta centrifugación, ya pellets células ar resuspendió jar buffer extracción helada 40 mL (pa jár 'mui 1 L) jar ne lisada ya ultrasonidos jar helada ar mpat'i utilizando 'nar UP400St instrumento (Dr. Hielscher GmbH, nu Alemäña). Ar lisis ar celular bí centrifugó bí 12.000 rpm Nxoge 15 min bí soluble ar separa (sobrenadante) ne fracciones precipitado (pellet). (Jiang et jar el., 2015)

Xtí tabla bí xta ar 'nar indicación ya mfeni ya procesamiento aproximado HMUNTS'UJE ultrasonicators:

Volumen lote Tasa flujo Dispositivos recomendados
0.5 1.5mL n.a. VialTweeter
1 jar 500mL 10 200 mL yá min UP100H
10 da 2000mL 20 400 mL yá min. UP200Ht, UP400St
0.1 da 20L 0.2 4 L yá min UIP2000hdT
10 da 100L 2 10 L yá min UIP4000
n.a. 10 100 L yá min UIP16000
n.a. mäs dätä Cluster ar UIP16000

Ja ar contacto ko ngekihe! Yá preguntar ga!

Jaki utilice ar Xtí formulario, nu'bu̲ gi da 'yadi ungumfädi adicional dige ar homogeneización ultrasónica. Estaremos encantados ar ofrecer bí 'nar ko ya ultrasónico ar satisfacer ya requerimientos.









Pets'i ja ma Nt'eje privacidad.


Ot'a yá referencias



Hechos Bale ar penä ga pädi

E coli

Escherichia coli (e. coli) ge 'nar bacteria gram negativa, facultativamente anaerobia, ja ya barra xí, coliforme ar género Escherichia da o comúnmente jar intestino mäs hñets'i'i ja ya hmunts'i ya ji mpa (ya endotherms). Jawa Nar dätä hño 'nar 'bede ya cepas ar e. coli (wa subtipos) ko 'na'ño ya características. Mäs xingu ya cepas ar e. coli ar inofensiva ja ya jä'i, e.g. B ne ë — 12 cepas ne ar utilizan comúnmente pa aplicaciones jar laboratorios nthoni. Wat'i, ra cepas ya perjudiciales ne xi causar enfermedades graves.
E coli 'ñeni 'nar he̲'mi mahyoni ja ar ja xí 'ño ingeniería biológica ne Microbiología industrial ndezu̲ ya bacterias ar hei ar manipular. Laboratorio aplicaciones pa ngatho da implican tso̲kwa menudo njapu'befi ya e. coli, ngu, pa da t'ot'e ya ácido desoxirribonucleico recombinante (ADN) wa da nu'u hingi nthe komongu 'nar organismo modelo.
E coli ge 'nar huésped xi versátil pa ar producción proteínas heterólogas, ne sistemas ya hmä proteínas múltiples gi 'bu̲hu̲ da 'mui da producción proteínas recombinantes jar e. coli. Utilizando plásmidos da permiten jar hmä za̲ ár nthe̲ mar hñets'i proteína, genes xi introducir ar ja ya bacterias, da permite producir ya proteínas jar dätä cantidades jar procesos fermentación industrial.
E coli ar utilizan komongu fábricas 'nar célula bí producir ar insulina. Ma 'ra ya aplicaciones incluyen njapu'befi ar células ar e. coli modificada pa nte ne producir vacunas ne enzimas inmovilizadas, pa nda producir biocombustibles, nja'bu komongu pa ar biorremediación.
Ar cepa ë — 12 ge 'nar dets'e mutante e. coli da sobre — expresa ar enzima fosfatasa alcalina (ALP). Nuna ar mutación bí produce nu'bya 'nar defecto jar gen codifica pa ar enzima constantemente. Nu'bu̲ 'nar gen produce 'nar producto hinda ni 'na jar inhibición ar pädi komongu ya nt'ot'e constitutiva. Nuna ar nt'ot'e mutante específica ar gi japu̲'be̲fi pa aislar ne purificar ar enzima fosfatasa alcalina.

Ultrasónico ADN Ts'ut'ubi

Ya ndu nzafi Ts'ut'ubi ultrasónico gi 'bu̲hu̲ nt'ot'e comúnmente utilizado pa separar ar célula ne ar filamentos ar DNA bí romperá jar pedazos. Cavitación acústica 'wagi ya paredes celulares ne membranas pa extraer ADN ya células ne generar fragmentos ar getu'bu̲ ar 600 – 800 bp ar longitud, nä'ä ar ideal pa ar análisis.
'Yot'e clic nuwa da uni mäs ungumfädi dige homogeneizadores ultrasónicos fragmentación ar ADN!