Lisis ultrasónica pa Western Blotting
- Western blot ge 'nar nt'ot'e analítico pa ar detección proteínas específicas ja 'nar muestra ar homogeneizado tejido wa extracto celular.
- Pa ejecutar 'nar Western blot wa da medir ar nt'ot'e enzimática, xingu ya ensayos requieren nthogi ja ya materiales (nt'udi, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) atrapados ar célula.
- Ar sonicación ge 'nar nt'ot'e fiable ne hei ar 'ye̲ pa ar disrupción ne ar lisis celular controlada.
Disrupción celular ultrasónica
Extracción proteínas tejidos ne células cultivadas ge ar ndu̲i bi thogi pa dí técnicas biológicas, bioquímicas ne analíticas (PAGE, Western blot, ELISA, espectrometría masas, etcétera) wa da purificación ar proteínas. Da uni 'nar mar hñets'i rendimiento proteico, hñei ar celular ne ar tejido tsa da alterados yá lisados ya bí nt'ot'e xi hño. Tanto nu'bu̲ t'o̲t'e células vegetales nu'u̲ tejidos animales, ar sonicación ge ár nt'ot'e pa ndi hoki ar lisado celular ya nt'ot'e hei ne ngut'a.
Ventajas ar sonicación
- Ngutha & Xi hño
- Hei operación
- Mar hñets'i rendimiento proteico
- Reproducible yá Repetible
- Controlado ko precisión
- escalable
Sonicador VialTweeter pa ar nt'ot'e muestras ya ultrasonidos, komongu ar disrupción ar celular ne ar aislamiento proteínas
Nthuts'i nkohi inmunoprecipitación pa ar inmunoblot occidental
A Reactivos
Pa ar nt'ot'e ya soluciones, utilice ar dehe purificada komongu Milli — Q.
- 1 x njäts'i salina tamponada ko fosfato (PBS)
- 1 tampón lisis celular: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% ar Triton X — 100, 2,5 mM pirofosfato sodio, 1 mM β — glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg yá ml ya leupeptina
Mahyoni: Agregue 1 mM PMSF ngut'a 'bu̲ 'be̲tho ga. - 15 μl de proteína A+15 μl de proteína G son suficientes para la IP, pero puede depender del anticuerpo primario y del volumen de la muestra. 'Nehe tsa̲ da utilizar proteína A/G agarosa premezclada (nt'udi, proteína A pa ar reducción IgG kwa ne proteína G pa ar reducción ar IgG t'u̲ngu)
- Tampón de muestra 3X SDS: 187,5 mM de Tris-HCl (pH 6,8 a 25 °C), 6 % con SDS, 30 % de glicerol, 150 mM de DTT, 0,03 % con azul de bromofenol
B nt'ot'e lisados celulares
- Cosecha ya células. Pa recolectar células jar nkohi hingi desnaturalizantes, retire ya nt'ot'e ne enjuague ya celdas 'nar pa PBS helado.
- Retire ar PBS ne añada 0,5 ml tampón lisis celular 1 X helado ja ya placa (10 cm) ne incube ya placas hielo Nxoge 5 t'olo ora.
- Raspe ya células ya placas ne transferir ya da tubos ar microcentrífuga. Da zeti jar hielo.
- Sonicar yoho ya 'nandi ja ya 10 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i jar tampón ar inmunoprecipitación helado (tampón IP: 50 mM Tris — HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% ar NP — 40 ne ar mezcla inhibidores ar proteasa). Ts'ut'ubi nu'bu ar sonicación, ar VialTweeter wa 'nar ultrasonido sonda, ngu ar UP100H o UP200Ht ya mäs ya adecuados.
- Centrifugar los lisados a 15.000 g durante 10 minutos a 4 °C.
- Transfiera ar sobrenadante ja 'nar tubo 'ra'yo. (Si es necesario, el lisado se puede almacenar a –80 °C).
- Agregue ar anticuerpo primario ja ar sobrenadante. Ar sobrenadante ar anticuerpo primario ar incuba Nxoge 1 h da 4 °C jár ligera 'nar agitación. Ir 'me̲t'o general, ar anticuerpo primario ar agrega ja 'nar yá 'bede 10 ya 'nandi mäs concentrada ke ar nä'ä bí usa pa western ar blot. (Puede comenzar con 1 μg por 100 μL).
- Tso̲kwa continuación, ar sobrenadante ar incuba aún mi mäs ko ar mezcla cantidades iguales proteína A — agarosa (Invitrogen) ne proteína G agarosa Nxoge 1 h mäs.
- Lave ya gránulos agarosa hñu ya 'nandi ko tampón IP. Tso̲kwa continuación, extraiga ya proteínas xi Hmunts'i tampón carga SDS — PAGE calentando ya da 95 °C durante 5 minutos.
C.ndunthe inmunoprecipitación
- Tomar 200 μl de lisado celular y añadir el anticuerpo primario. Incubar con un suave balanceo durante la noche a 4°C.
- Añadir perlas de agarosa de proteína A o G (20 μl de purín al 50% de perlas). Incubar con un balanceo suave durante 1-3 horas a 4 °C.
- Microcentrífuga durante 30 segundos a 4°C. Lave el pellet cinco bes con 500 μl de tampón de lisis celular 1X. Zeti nä'ä hielo Nxoge ya lavados.
- Vuelva a suspender el gránulo con tampón de muestra 3X SDS de 20 μl. Vórtice, gem'bu̲ microcentrífuga Nxoge 30 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i.
- Calentar la muestra a 95-100 °C durante 2-5 minutos y microcentrifugar durante 1 minuto a 14.000 X g.
- Cargue la muestra (15-30 μl) en el gel SDS-PAGE (12-15%).
- Analice ar muestra ya Western blot.
Análisis ar Western Blot ko ar Sonicator UP50H
Ja ar estudio Kriebisch et jar ar. (2011) bí utilizó ar Xtí nthuts'i nkohi utilizando ar sonicador ar klase sonda UP50H:
Ar proteína Nxoge ar aisló ja ya células MC3T3 — E1 tratadas ko 1,25 (o)2D3 (10−8 M) wa ya vehículo. Ya células ar lisaron ko 'nar tampón da contenía 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma — Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% ar dodecil sulfato sodio (SDS) (Fisher Scientific); IGEPAL CA — 630 jar ar 1% (Sigma — Aldrich) ne desoxicolato sodio 0,5% (Merck). Lisado celular ar sonicó Nxoge 2 × 10 s ciclo 1 ne 'nar amplitud 80 ko ar Procesador ultrasónico UP50H (Hielscher, Tecnología ultrasonidos, Teltow, nu Alemäña). A partir de entonces, ar hñei da centrifugó Nxoge 10 ya t'olo ora bí 14.000 ar rpm ne ar sobrenadante bí utilizó pa ar transferencia occidental. Veinticinco μg de proteína se hirvieron en tampón de muestra y agente reductor (Invitrogen) y posteriormente se separaron mediante SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida al 4-12% (Invitrogen) ne da transfirieron 'nar membrana nitrocelulosa (GE health care). Ar membrana ar bloqueó Nxoge 1 h ko TBS (10 mM Tris — HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) da contenía 1% ar caseína (Sigma — Aldrich) ne 1% ar Tris (1 M). 'Me̲fa ar bloqueo, ar membrana bí incubó ko 'nar ligera agitación Nxoge nxui da 4 °C ko ar anticuerpo primario (conejo antihumano CBS 1 yá 500, desarrollado ar laboratorio ar ar Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MA, EE. UU.). Incubación ko 'nar anticuerpo secundario conjugado (Dako) ko peroxidasa rábano picante (HPR) bí realizó Nxoge 1 h ma mpat'i ambiente. Ya blots ar desarrollaron ir nge ya quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer).
'Yot'e clic nuwa pa Nepabi mäs dige ya mpädi mäs xi prácticas jar lisis ne extracción celular ya ultrasonidos, ár nt'ot'e ar lisado ne da uni mfädi mejorar ya procesos.
Xtí tabla bí xta ar 'nar indicación ya mfeni ya procesamiento aproximada ar HMUNTS'UJE ultrasonidos tamaño laboratorio:
| Dispositivos recomendados | Volumen lote | Gasto |
|---|---|---|
| UIP400MTP Sonicador ar placas 96 pocillos | Placas multipocillo yá ar microtitulación | n.d. |
| cupHorn ultrasónico | CupHorn pa viales wa ya Baso ar precipitados | n.d. |
| GDmini2 | reactor ultrasónico microflujo | n.d. |
| VialTweeter | 0.5 1.5mL | n.d. |
| UP100H | Ar 1 jar 500 ml | Ar 10 200 ml yá min |
| UP200Ht, UP200St | Ar 10 da 1000 ml | Ar 20 200 ml yá min |
| UP400St | Ar 10 da 2000 ml | Ar 20 400 ml yá min |
| Tamizadora ultrasónica | n.d. | n.d. |
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UIP400MTP sonicador placa pa ar sonicación mar hñets'i rendimiento placas 96 pocillos
Dige Western Blotting
Ya transferencias ya nt'ot'e analíticos ya da ar ADN, ar ARN ne ya proteínas ar transfieren ja 'nar portador pa ndi tsa da separar ar.
Transferencia Southern ar gi japu̲'be̲fi pa ar detección ADN, ar transferencia Northern pa ar ARN ne ar transferencia Western pa ya proteínas.
Ar Western blot 'nehe ar denomina inmunotransferencia proteínas ngetho ar gi japu̲'be̲fi 'nar anticuerpo pa detectar específicamente ár antígeno. Western Blotting ge 'na ya nt'ot'e análisis mäs mahyoni pa detectar proteínas específicas ja ar muestra. Ar Western jar blot, ya proteínas ar inmovilizan ja ya membranas da detectar ya ir nge ya anticuerpos monoclonales wa ya policlonales.
Ir nge ar electroforesis jar gel poliacrilamida SDS (SDS — PAGE), ya proteínas nativas ar separan ja 'nar estructura 3 — D wa proteínas desnaturalizadas ir nge ar longitud ar polipéptido. Tso̲kwa continuación, ya proteínas ar transfieren ja 'nar membrana (normalmente nitrocelulosa wa PVDF), ho bí tiñen ko anticuerpos específicos pa ar proteína objetivo. Ar bi thogi ar electroforesis jar gel ar mfa̲ts'i 'bu̲i jar análisis Western blot pa resolver ar hñäki reactividad cruzada ya anticuerpos.
Tso̲kwa continuación, ya proteínas separadas ar transcriben ja 'nar matriz (principalmente ja 'nar membrana nitrocelulosa wa PVDF), ho bí tiñen ko ya anticuerpos. Ya anticuerpos funcionan komongu 'nar sonda ne ar seleccionan específicamente pa ar proteína diana. Ar análisis ar ja yá 'mui ne ar intensidad ar reacción específica revela yá detalles ya hmä ya proteínas objetivo ja ar muestra dada. Ar Western blot ndi detectar ar proteína objetivo ke ar xí hñets'i'i komongu 1ng nu'bya ar mextha resolución electroforesis jar gel ne xí nze̲di especificidad ne mextha sensibilidad ar inmunoensayo. Ar nt'ot'e Western blot ar gi japu̲'be̲fi biología molecular, bioquímica, inmunogenética ne ma'ra campos nthoni molecular.
Ma 'ra ya técnicas relacionadas incluyen análisis transferencia puntos, ar inmunohistoquímica ne ar inmunocitoquímica, ya da ar utilizan anticuerpos pa detectar proteínas tejidos ne células ir nge ya inmunotinción, ne ensayo inmunoabsorción ligado enzimas (ELISA).
Bibliografía yá Referencias
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.
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