• Western blot ge 'nar nt'ot'e analítico pa ar detección proteínas específicas ja 'nar muestra tejido homogeneizado wa extracto ar célula.
• Ga OT'UJE 'nar Western blot wa da medir ar nt'ot'e enzimática, xingu ya ensayos requieren nthogi ja ya materiales (nt'udi, fragmentos ar proteínas, ADN, ar subcelular) atrapados ar celda.
• Sonicación ge 'nar nt'ot'e fiable ne hei ar 'ye̲ pa interrupción controlada celular ne ar lisis.

Interrupción ar célula ultrasónica

Extracción proteínas ya tejidos ne ya células cultivadas ge ar ndu̲i bi thogi pa dí técnicas biológicas, bioquímicas ne analíticas (PAGE, Western Blot, ELISA, espectrometría ar masas, etc.) wa purificación proteínas. Da uni 'nar rendimiento mar hñets'i hmädi proteico, ar he̲'mi ar célula ne ar tejido tsa eficientemente interrumpidos yá lisis. Nu'bu̲ dá planta tejido celular wa me̲ti, sonicación ge ár nt'ot'e pa ndi hoki ir lisado celular hei ne rápido

Ventajas ar sonicación

• Ngutha & nt'ot'e xi hño
• operación hei
• producción mar hñets'i hmädi proteico
• repetible yá reproducibles
• exacto controlada
• escalable

Nthuts'i nkohi inmunoprecipitación Immunoblotting occidental

A reactivos

Pa ar nt'ot'e ya soluciones, utilice ar dehe purificada komongu Milli — Q.

• 1 x fosfato tampón salino (PBS)
• 1 x tampón lisis celular: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Tritón X — 100, pirofosfato sodio 2,5 mM, 1 mM β — glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg yá ml Leupeptin
  Mahyoni: Añadir 1 mM PMSF ngut'a 'bu̲ 'be̲tho ga.
• Ar 15 ma μl proteína A + G proteína 15 ar μl ar xingu pa ar IP, pe tsa̲ da depender ár anticuerpo ar primario ne ar volumen ar muestra. 'Nehe ar tsa̲ da utilizar proteína premezclada A yá G ya agarosa (hne. ej. proteína A pa kwa IgG tire nu'bu abajo) ne G proteína t'u̲ngu IgG desplegable
• 3 x SDS tampón: 187,5 mM Tris — HCl (pH 6.8 ma 25 ° C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0.03% w/v ar k'angi bromofenol

B nt'ot'e Lysates ar célula

• Sofo ya células. Pa cosechar ya células jár nkohi nondenaturing, da hñäki ya nt'ot'e comunicación ne da enjuague ya células 'nar pa PBS helado.
• Pats'u̲ga̲ PBS ne añadir 0.5 ml helado 1 X tampón lisis ar célula ya mohi (10 cm) ne Incube da placas ar hielo Nxoge 5 t'olo ora.
• Da t'a̲fi ya células ya placas ne transferir tubos ar microcentrífuga. Da zeti jar hielo.
• Da t'uni jar ultrasonidos yoho ya 'nandi Nxoge 10 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i jar almacenador intermediario ar inmunoprecipitación helada (buffer IP: 50 mM Tris — HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP — 40 ne ar combinación inhibidor ar proteasa). Ar sonicación, ar VialTweeter wa 'nar ultrasonicador sonda tales Komo ar UP100H o UP200Ht ya mäs ya adecuados.
• Centrifugue ya lisados bí 15.000 ar g Nxoge 10 ya t'olo ora da 4° c.ndunthe
• Transferir ar sobrenadante ja 'nar tubo 'ra'yo. (Xähmö mahyoni, lisado to almacenar bí ma — 80 ° c.ndunthe)
• Añadir ar anticuerpo primario ja ar sobrenadante. Ar sobrenadante ar anticuerpo primario ar incuba Nxoge 1 h da 4° C jár agitación ligera. Anticuerpo primario ar agrega típicamente ja 'nar yá 'bede 10 x mäs concentrado nä'ä da gi japu̲'be̲fi pa borrar occidental. (To 'bu̲i ko 1μg ya 100μL).
• Ar sobrenadante ar incuba 'me̲fa ko ar mezcla iguales cantidades proteína A — agarosa (Invitrogen) ne agarosa G proteínas ya ma'na 1 h.
• Lave ya pelotillas ar agarosa hñu ya 'nandi ko tampón IP. Ne gem'bu̲ bí extraiga ya proteínas enlazadas ko ar tampón carga SDS — PAGE ya calentamiento 95° C Nxoge 5 t'olo ora.

C.ndunthe inmunoprecipitación ar

• 200 células μl lisado ne añadir anticuerpo primario. Incubar ko za̲tho balanceo Nxoge ar xui 4° c.ndunthe
• Agregar proteína A wa G perlas ar agarosa (20 μl ar mezcla 50% ar ar grano). Incubar ko za̲tho balanceo pa 1 — 3 ora da 4° c.ndunthe
• Microcentrífuga Nxoge 30 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i da 4° c.ndunthe Xu̲t'i ar pellet ku̲t'a ya 'nandi ko 500 μl tampón lisis célula X 1. Zeti hielo Nxoge ar lavado.
• Resuspender ar precipitado ko ar 20 μl 3 tampón SDS X. Vórtice, nu'bu̲ microcentrífuga Nxoge 30 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i.
• Se̲ki ga pat'u̲'be dá gi 'ñudi ar 95 — 100° C 2 — 5 t'olo ora ne microcentrífuga Nxoge 1 minuto da 14.000 X g.
• Carga ar muestra (15 — 30 μl) jar gel SDS — PAGE (12 — 15%).
• Análisis ar muestra ya borrar occidental.

Análisis Western Blot ko ar Sonicator UP50H

Ar Xtí nthuts'i nkohi utilizando ar sonicador ar klase sonda UP50H ar utilizó jar estudio Kriebisch et jar ar. (2011):
Proteína Nxoge bí aislada ar células MC3T3 — E1 tratadas ko 1,25 (o)₂D₃ (10⁻⁸ M) wa ya vehículo. Ya células ma sometidas ma lisis ko 'nar tampón da contiene 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma — Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA — 630 (Sigma — Aldrich) ne desoxicolato sodio 0.5% (Merck). Lisado ar celular bí sonicada 2 × 10 s ja ar ciclo 1 ne amplitud 80 ko ar Procesador ultrasónico UP50H (Hielscher, tecnología ultrasonido, Teltow, nu Alemäña). 'Me̲fa nä'ä ar hñei da centrifugó Nxoge 10 ya t'olo ora bí 14.000 ar rpm ne ar sobrenadante bí utilizó pa Western blot. 25 μg proteína bí hervido njäts'i tampón ar muestra ne ar agente reducción (Invitrogen) ne 'mefa hñe̲gi ya SDS — PAGE utilizando geles poliacrilamida 4 — 12% (Invitrogen) ne transferido 'nar membrana nitrocelulosa (Ntheti nzaki GE). Ar membrana bí bloqueada Nxoge 1 h ko TBS (10 mM Tris — HCl, pH 7.6; 150 mM NaCl) da contenga 1% caseína (Sigma — Aldrich) ne 1% Tris (1 M). 'Mefa xta bloqueo, ar membrana bí incubó ko ligera agitación Nxoge ar xui 4 ° C ko anticuerpo primario (kwa anti-humano CBS 1 yá 500, desarrollado ar laboratorio ar Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MA, USA). Incubación ko 'nar peroxidasa rábano (HPR) — anticuerpo secundario conjugado (Dako) bí realizó Nxoge 1 h ma mpat'i ambiente. Lacras ga̲tho ma desarrollados ya quimioluminescencia realzada (Perkin Elmer).
 

 
Xtí tabla bí xta ar 'nar indicación ya mfeni ya procesamiento aproximada ar HMUNTS'UJE ultrasonidos tamaño laboratorio:

Ot'a yá Referencias