Hielscher Ultrasonics
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Lisis ultrasónica pa Western Blotting

  • Western blot ge 'nar nt'ot'e analítico pa ar detección proteínas específicas ja 'nar muestra ar homogeneizado tejido wa extracto celular.
  • Pa ejecutar 'nar Western blot wa da medir ar nt'ot'e enzimática, xingu ya ensayos requieren nthogi ja ya materiales (nt'udi, proteínas, ADN, fragmentos subcelulares) atrapados ar célula.
  • Ar sonicación ge 'nar nt'ot'e fiable ne hei ar 'ye̲ pa ar disrupción ne ar lisis celular controlada.

Disrupción celular ultrasónica

Extracción proteínas tejidos ne células cultivadas ge ar ndu̲i bi thogi pa dí técnicas biológicas, bioquímicas ne analíticas (PAGE, Western blot, ELISA, espectrometría masas, etcétera) wa da purificación ar proteínas. Da uni 'nar mar hñets'i rendimiento proteico, hñei ar celular ne ar tejido tsa da alterados yá lisados ya bí nt'ot'e xi hño. Tanto nu'bu̲ t'o̲t'e células vegetales nu'u̲ tejidos animales, ar sonicación ge ár nt'ot'e pa ndi hoki ar lisado celular ya nt'ot'e hei ne ngut'a.

Ventajas ar sonicación

  • Ngutha & Xi hño
  • Hei operación
  • Mar hñets'i rendimiento proteico
  • Reproducible yá Repetible
  • Controlado ko precisión
  • escalable

Nu'bu da 'yadi ungumfädi




Pets'i ja ma Nt'eje privacidad.




Ar VialTweeter ar Hielscher xí ideal pa ar lisis múltiples muestras

Sonicador VialTweeter pa ar nt'ot'e muestras ya ultrasonidos, komongu ar disrupción ar celular ne ar aislamiento proteínas

Nthuts'i nkohi inmunoprecipitación pa ar inmunoblot occidental

A Reactivos

Pa ar nt'ot'e ya soluciones, utilice ar dehe purificada komongu Milli — Q.

  • 1 x njäts'i salina tamponada ko fosfato (PBS)
  • 1 tampón lisis celular: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% ar Triton X — 100, 2,5 mM pirofosfato sodio, 1 mM β — glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 1 μg yá ml ya leupeptina
    Mahyoni: Agregue 1 mM PMSF ngut'a 'bu̲ 'be̲tho ga.
  • 15 μl de proteína A+15 μl de proteína G son suficientes para la IP, pero puede depender del anticuerpo primario y del volumen de la muestra. 'Nehe tsa̲ da utilizar proteína A/G agarosa premezclada (nt'udi, proteína A pa ar reducción IgG kwa ne proteína G pa ar reducción ar IgG t'u̲ngu)
  • Tampón de muestra 3X SDS: 187,5 mM de Tris-HCl (pH 6,8 a 25 °C), 6 % con SDS, 30 % de glicerol, 150 mM de DTT, 0,03 % con azul de bromofenol

B nt'ot'e lisados celulares

  • Cosecha ya células. Pa recolectar células jar nkohi hingi desnaturalizantes, retire ya nt'ot'e ne enjuague ya celdas 'nar pa PBS helado.
  • Retire ar PBS ne añada 0,5 ml tampón lisis celular 1 X helado ja ya placa (10 cm) ne incube ya placas hielo Nxoge 5 t'olo ora.
  • Raspe ya células ya placas ne transferir ya da tubos ar microcentrífuga. Da zeti jar hielo.
  • Sonicar yoho ya 'nandi ja ya 10 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i jar tampón ar inmunoprecipitación helado (tampón IP: 50 mM Tris — HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% ar NP — 40 ne ar mezcla inhibidores ar proteasa). Ts'ut'ubi nu'bu ar sonicación, ar VialTweeter wa 'nar ultrasonido sonda, ngu ar UP100H o UP200Ht ya mäs ya adecuados.
  • Centrifugar los lisados a 15.000 g durante 10 minutos a 4 °C.
  • Transfiera ar sobrenadante ja 'nar tubo 'ra'yo. (Si es necesario, el lisado se puede almacenar a –80 °C).
  • Agregue ar anticuerpo primario ja ar sobrenadante. Ar sobrenadante ar anticuerpo primario ar incuba Nxoge 1 h da 4 °C jár ligera 'nar agitación. Ir 'me̲t'o general, ar anticuerpo primario ar agrega ja 'nar yá 'bede 10 ya 'nandi mäs concentrada ke ar nä'ä bí usa pa western ar blot. (Puede comenzar con 1 μg por 100 μL).
  • Tso̲kwa continuación, ar sobrenadante ar incuba aún mi mäs ko ar mezcla cantidades iguales proteína A — agarosa (Invitrogen) ne proteína G agarosa Nxoge 1 h mäs.
  • Lave ya gránulos agarosa hñu ya 'nandi ko tampón IP. Tso̲kwa continuación, extraiga ya proteínas xi Hmunts'i tampón carga SDS — PAGE calentando ya da 95 °C durante 5 minutos.

C.ndunthe inmunoprecipitación

  • Tomar 200 μl de lisado celular y añadir el anticuerpo primario. Incubar con un suave balanceo durante la noche a 4°C.
  • Añadir perlas de agarosa de proteína A o G (20 μl de purín al 50% de perlas). Incubar con un balanceo suave durante 1-3 horas a 4 °C.
  • Microcentrífuga durante 30 segundos a 4°C. Lave el pellet cinco bes con 500 μl de tampón de lisis celular 1X. Zeti nä'ä hielo Nxoge ya lavados.
  • Vuelva a suspender el gránulo con tampón de muestra 3X SDS de 20 μl. Vórtice, gem'bu̲ microcentrífuga Nxoge 30 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i.
  • Calentar la muestra a 95-100 °C durante 2-5 minutos y microcentrifugar durante 1 minuto a 14.000 X g.
  • Cargue la muestra (15-30 μl) en el gel SDS-PAGE (12-15%).
  • Analice ar muestra ya Western blot.

Análisis ar Western Blot ko ar Sonicator UP50H

Ja ar estudio Kriebisch et jar ar. (2011) bí utilizó ar Xtí nthuts'i nkohi utilizando ar sonicador ar klase sonda UP50H:
Homogeneizador ultrasónico ar klase sonda UP50H ar usa comúnmente pa ar disrupción ar celular ne ar aislamiento proteínas komongu bi thogi nt'ot'e muestras 'bu̲ 'be̲tho Western BlottingAr proteína Nxoge ar aisló ja ya células MC3T3 — E1 tratadas ko 1,25 (o)2D3 (10−8 M) wa ya vehículo. Ya células ar lisaron ko 'nar tampón da contenía 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma — Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% ar dodecil sulfato sodio (SDS) (Fisher Scientific); IGEPAL CA — 630 jar ar 1% (Sigma — Aldrich) ne desoxicolato sodio 0,5% (Merck). Lisado celular ar sonicó Nxoge 2 × 10 s ciclo 1 ne 'nar amplitud 80 ko ar Procesador ultrasónico UP50H (Hielscher, Tecnología ultrasonidos, Teltow, nu Alemäña). A partir de entonces, ar hñei da centrifugó Nxoge 10 ya t'olo ora bí 14.000 ar rpm ne ar sobrenadante bí utilizó pa ar transferencia occidental. Veinticinco μg de proteína se hirvieron en tampón de muestra y agente reductor (Invitrogen) y posteriormente se separaron mediante SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida al 4-12% (Invitrogen) ne da transfirieron 'nar membrana nitrocelulosa (GE health care). Ar membrana ar bloqueó Nxoge 1 h ko TBS (10 mM Tris — HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) da contenía 1% ar caseína (Sigma — Aldrich) ne 1% ar Tris (1 M). 'Me̲fa ar bloqueo, ar membrana bí incubó ko 'nar ligera agitación Nxoge nxui da 4 °C ko ar anticuerpo primario (conejo antihumano CBS 1 yá 500, desarrollado ar laboratorio ar ar Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MA, EE. UU.). Incubación ko 'nar anticuerpo secundario conjugado (Dako) ko peroxidasa rábano picante (HPR) bí realizó Nxoge 1 h ma mpat'i ambiente. Ya blots ar desarrollaron ir nge ya quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer).
 

Nuna tutorial gi mä Temu̲ ar klase ar sonicador ge ar mäs xi hño pa yá tareas ya nt'ot'e muestras, komongu ar lisis, ar disrupción celular, aislamiento proteínas, ar fragmentación ya ADN ne ya ARN jar laboratorios, análisis ne nthoni. Elija ar klase ar sonicador ideal pa ár nt'ot'e, volumen muestra, ya 'bede ya muestra ne ya rendimiento. Hielscher Ultrasonics pe̲ts'i ar homogeneizador ultrasónico ideal pa gí.

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Xtí tabla bí xta ar 'nar indicación ya mfeni ya procesamiento aproximada ar HMUNTS'UJE ultrasonidos tamaño laboratorio:

Dispositivos recomendados Volumen lote Gasto
UIP400MTP Sonicador ar placas 96 pocillos Placas multipocillo yá ar microtitulación n.d.
cupHorn ultrasónico CupHorn pa viales wa ya Baso ar precipitados n.d.
GDmini2 reactor ultrasónico microflujo n.d.
VialTweeter 0.5 1.5mL n.d.
UP100H Ar 1 jar 500 ml Ar 10 200 ml yá min
UP200Ht, UP200St Ar 10 da 1000 ml Ar 20 200 ml yá min
UP400St Ar 10 da 2000 ml Ar 20 400 ml yá min
Tamizadora ultrasónica n.d. n.d.

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Ya microplacas, ya placas pocillos múltiples, ya placas PCR ne ya placas 96 pocillos xi sonicarse ya nt'ot'e cómoda ne uniforme ga utilizando ar sonicador placas UIP400MTP

UIP400MTP sonicador placa pa ar sonicación mar hñets'i rendimiento placas 96 pocillos



Dige Western Blotting

Ya transferencias ya nt'ot'e analíticos ya da ar ADN, ar ARN ne ya proteínas ar transfieren ja 'nar portador pa ndi tsa da separar ar.
Transferencia Southern ar gi japu̲'be̲fi pa ar detección ADN, ar transferencia Northern pa ar ARN ne ar transferencia Western pa ya proteínas.
Ar Western blot 'nehe ar denomina inmunotransferencia proteínas ngetho ar gi japu̲'be̲fi 'nar anticuerpo pa detectar específicamente ár antígeno. Western Blotting ge 'na ya nt'ot'e análisis mäs mahyoni pa detectar proteínas específicas ja ar muestra. Ar Western jar blot, ya proteínas ar inmovilizan ja ya membranas da detectar ya ir nge ya anticuerpos monoclonales wa ya policlonales.
Ir nge ar electroforesis jar gel poliacrilamida SDS (SDS — PAGE), ya proteínas nativas ar separan ja 'nar estructura 3 — D wa proteínas desnaturalizadas ir nge ar longitud ar polipéptido. Tso̲kwa continuación, ya proteínas ar transfieren ja 'nar membrana (normalmente nitrocelulosa wa PVDF), ho bí tiñen ko anticuerpos específicos pa ar proteína objetivo. Ar bi thogi ar electroforesis jar gel ar mfa̲ts'i 'bu̲i jar análisis Western blot pa resolver ar hñäki reactividad cruzada ya anticuerpos.
Tso̲kwa continuación, ya proteínas separadas ar transcriben ja 'nar matriz (principalmente ja 'nar membrana nitrocelulosa wa PVDF), ho bí tiñen ko ya anticuerpos. Ya anticuerpos funcionan komongu 'nar sonda ne ar seleccionan específicamente pa ar proteína diana. Ar análisis ar ja yá 'mui ne ar intensidad ar reacción específica revela yá detalles ya hmä ya proteínas objetivo ja ar muestra dada. Ar Western blot ndi detectar ar proteína objetivo ke ar xí hñets'i'i komongu 1ng nu'bya ar mextha resolución electroforesis jar gel ne xí nze̲di especificidad ne mextha sensibilidad ar inmunoensayo. Ar nt'ot'e Western blot ar gi japu̲'be̲fi biología molecular, bioquímica, inmunogenética ne ma'ra campos nthoni molecular.
Ma 'ra ya técnicas relacionadas incluyen análisis transferencia puntos, ar inmunohistoquímica ne ar inmunocitoquímica, ya da ar utilizan anticuerpos pa detectar proteínas tejidos ne células ir nge ya inmunotinción, ne ensayo inmunoabsorción ligado enzimas (ELISA).


Bibliografía yá Referencias

Configuración nxo̲ge ar VialTweeter: Sonotrodo VialTweeter jar procesador ultrasónico UP200St

Sonicador VialTweeter pa ar nt'ot'e simultánea muestras varios viales

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UP200St ko micropunta pa ar sonicación muestras

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