Tecnología ultrasonido Hielscher

Ultrasónico ADN Ts'ut'ubi

  • ADN ne ARN da esquila, ya moléculas ADN ar dividen jar pedazos mäs t'olo. DNA yá RNA ar fragmentación ge 'na ya mahyoni pasos nt'ot'e muestra mahyoni crean bibliotecas pa ar Xtí secuencia generación (NGS).
  • Ts'ut'ubi ultrasónico ADN gi japu̲'be̲fi ya ndu cavitación acústica pa romper ar DNA wa ar RNA trozos 100 – bp 5 ar kb.
  • Ts'ut'ubi ultrasónico permite precisa fragmentación ar ADN ne ar adaptación longitud deseada ar ADN.

Ultrasónico ADN Ts'ut'ubi

Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe soluciones nthe jar ultrasonido pa ADN, ar ARN ne ar cromatina ar Ts'ut'ubi. Da 'ñets'i ja 'nar ultrasonicators ar klase sonda (hne. ej. UP100H) pa ar sonicación directa ko 'nar micropunta wa utilizar ar VialTweeeter wa ar cuphorn ultrasónico pa jar nt'ot'e indirecta ADN ndunthe ya muestras simultáneamente. Hielscher ofrece ar dispositivo ideal yá ja yá ndu: ya gi 1 wa asta 10 muestras, volúmenes microlitros volúmenes litro – Procesadores ultrasónicos Hielscher gi 'bu̲hu̲ da 'mui da tso̲ni ko ya requerimientos pa ndi hoki fragmentos ADN, ARN ne cromatina ar longitud correcta. Reproducibilidad, hei ya operación ne 'nar control preciso permiten 'nar biblioteca confiable pa secuenciación Nu'bu̲ Xtí ar generación.
Ar contraste ko ar fragmentación enzimática ar ADN, jar Ts'ut'ubi ultrasónico t'uni ndu nzafi ya esquileo mecánico ar binu hinda adición productos químicos. Ar za preciso parámetros proceso, ar Ts'ut'ubi ultrasónico produce fragmentos ADN mar hñets'i be̲xu molecular (plásmido ne ADN genómico).
Ácidos nucleicos purificados xi da amplificados nu'bu̲ wa 'mefa xta 'nar bi thogi ar fragmentación.
Parámetros sonicación (nts'edi, ciclo pulso yá estalla, ar pa ne ar mpat'i) tsa̲ da controlar ar ko ntsuni ir nge ar configuración software.

Ventajas:

  • control preciso
  • ciclos sonicación ne pa precisamente adaptable ma tamaño deseado ar DNA
  • fragmentos ADN mar hñets'i be̲xu molecular
  • control mpat'i
  • Ngutha
  • resultados reproducibles
  • esterilizable jar autoclave
  • ndunthe ya soluciones: Ar klase sonda, VialTweeter ne CupHorn

Protocolos pa ar Ts'ut'ubi ADN ultrasónico

Pa ensayo inmunoprecipitación cromatina

Nsa̲di, ya células ma plateadas jar platos 60mm diámetro (400.000 ya mohi) ne transfected ko RhoA siRNA (Honja descrito); 'mefa xta 72 h, bí incubaron formaldehído (concentración final ar 1%) ko ya 10 min ma 37 ° C pa entrecruzar proteínas ar ADN. Ar reacción ar entrecruzamiento bí saciada ya adición 'nar décimo volumen 1.25 glicina mol yá L, da concentración final 125 mmol yá L. Ya células ma lavadas yoho ya 'nandi ko PBS helado, suspendidas tampón ensayo radioinmunoprecipitación [150 mmol yá L ya NaCl, 1% NP40, desoxicolato 0.5%, 0.1% SDS, 5 mmol yá L ya EDTA, 50 mmol yá L ya Tris — HCl (pH 8,0)] da contienen fluoruro phenylmethylsulfonyl mmol yá L 1, Ag 1 yá mL aprotinina ne 1 Ag yá mL pepstatin A ne mantenido jar hielo Nxoge 30 t'olo ora. Ne gem'bu̲ bí ma sonicados lysates ar célula ar hielo ko 'nar Hielscher UP200S sonicador ultrasonido (3 x 40 s, amplitud 40%, ciclo 1;) Hielscher Ultrasonics GmbH) asta chromatins reticulados ma esquiladas pa da fragmentos ADN de entre 200 ne 1.000 PB. 'Nar 'betho xeni ga̲tho lisado bí utilizado da cuantificar yá 'bede ya ADN 'mui ja ya 'na'ño muestras ne considerado komongu “ADN entrada Nxoge”. Sobrenadantes ar incuban ko esperma salmón mezcla ar agarosa — 50% ar ADN yá proteínas pa reducir ts'o̲e hingi específico. Inmunoprecipitación gem'bu̲ bí hecha Nxoge ar xui 4° C ko 5 ar Ag p65 NF — anti — nB (Upstate) wa hinda anticuerpos (control negativo). Nuya sobrenadantes ma suplementados 5 mol yá L NaCl ne calefacción Nxoge nxui 65° C da revertir ya enlaces cruzados proteína-DNA. Ya immunocomplexes ma nä'ä tratados ko mpe̲fi DNasa ne Rnasa proteinasa ë, ne ar ADN bí purificado ya precipitación extracción ne etanol fenol yá cloroformo. Ar realizó PCR ko iniciadores específicos ja ma 'nar secuencia mbo jar hnini promotor ar gene ar iNOS ya jä'i (ndu̲i ar p1: 5¶ — GAGGGCTTTCCCA — GAACCAAG — 3¶; ndu̲i ar p2: GCTGGGCTACTGACCCAG — CAGTTCCAG — 3¶). (Doublier et jar el., 2008)

Nsadi ya hmä EGFP

Pa nsadi ya hmä, ar cepa recombinante ar L. tarentolae p10:F9Begfp1. 4dBsat #12 (Biociencia ar Jena, nu Alemäña) ko gen EGFP (dätä proteína xí fluorescente), cromosómica ssu mfaxte, bí cultivada ja ya yá nt'ot'e comunicación Komo ar pede ma 'met'o mi ne 'nehe complementado ko 100 mg l— 1 Nourseothricin (Biociencia ar Jena, nu Alemäña). Nxoge ar cultivo, muestras 1 ml ma nju, centrifugada (2000 × g, 20° C, 10 ya t'olo ora) ne xu̲t'i ko njäts'i NaCl ma 0,9%. Pellet resuspendió jar buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM TDT) ne desintegró ya sonificación ko ar procesador ultrasónico UP400S (nt'ot'e ar energía ∼ 400 Ws). Restos celulares ma removidos ya centrifugación (6000 × g, 4° C, 5 min) ne analizados ya dodecil sulfato sodio — poliacrilamida gel electroforesis (SDS — PAGE) jár reducción ar nkohi ir nge ar nt'ot'e Laemmli (1970) ko 12,5% polyacralamide geles. Hmä ar EGFP bí examinado jar cultivo agitado. (Fritsche et jar el., 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Análisis electroforéticos DNA genómico Escherichia coli EDL933 sometidos ultrasonidos 0 — ar 15 ya t'olo ora. L indica 'rede ADN. (Basselet et jar el., 2008)

Nu'bu da 'yadi ungumfädi




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Inmunoprecipitación cromatina

Disruptor celular ultrasónico UP100H (100W) ya lisis, alteración ar célula ne ar ADN ar Ts'ut'ubi.Ensayo inmunoprecipitación cromatina ar realizó ir nge ar ChIP — ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) nä'ä mä ya instrucciones ar fabricante ra nyokwi. Nsa̲di, podocitos humanos diferenciados ma reticuladas ko formaldehído 1% Nxoge 10 min jar mpat'i ambiente. Ya células ar lavaron ko PBS helado ne ar reacción fijación ar detuvo ya adición glicina 0,125 M Nxoge 5 t'olo ora da mpat'i ambiente. Células ar lavaron ma 'nagi ko PBS helado ne raspadas ar mohi. Ya células ma peleteadas ya centrifugación ne resuspendió tampón lisis. 'Mefa xta centrifugación, núcleos sedimentados ar resuspendió jar búfer esquila, ne bí incubó jar hielo Nxoge 30 ar min ne ar cromatina bí esquilada ya sonicación, hne. ej. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, nu Alemäña) ja ar 25% ar energía ar 5 pulsos ar 20 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i ja ar hielo fragmentos aproximadamente 200 — 600 ar bp. Ar cromatina esquilada 'me̲fa ar centrifugó ne ar sobrenadante ar recogió. Pa immunoprecipitations, 60 μl cromatina ar incubó ko 1 μg Sp1 (biotecnología ar pa Cruz, pa Cruz, CA, USA), NF — κB p65 (Abcam, Cambridge, ndä mfats'i) wa p50 ar NF — κB (Abcam) anticuerpos wa ko kwa IgG (Zymed Laboratories, South Nsan Fransisko, CA, USA), Honja 'nar control negativo, Nxoge ar xui 4° C ko rotación za̲tho. Immunocomplexes granos magnéticos ar recopilaron utilizando 'nar soporte magnético, lavado exhaustivamente ne da revirtieron ya reticulaciones proteína yá ADN ne ADN eluyen pa análisis PCR jar pa real. (Ristola et jar el. 2009)

Nt'ot'e EHEC ADN pa ar análisis ar matriz chip

Thoki ar lysates ar célula ne ar ADN extraído
Balines bacterianas suspendidas jar PBS ja ar concentración final deseada ma tratados ko disruptor ultrasonido UP100H (Hielscher GmbH, nu Alemäña) equipado ko 'nar micropunta MS1 (1mm ar diámetro). Frecuencia operación 30 ar kHz ne nts'edi salida xi hño 100 ar w ar. Nxoge ar operación, ar enfría ja 'nar nsaha ar dehe helada, mezclada ne ar centrifugada. Ya muestras ar utilizaron pa ya nsadi citometría flujo, Mente mi pa manejo 'mefa ár njäts'i Tange'u, ya muestras ar sometieron ja 'nar nt'ot'e térmico (95° C, 5 min). Ya lysates ar célula ar crudo ma procesados ko 'nar mezcla alkol fenol: cloroformo: isoamílico (25:24:1). 'Nar volumen ngu nuna ar mezcla bí añaden ja ar muestra lisada, ár njäts'i ma dá agitó vigorosamente Nxoge 15 s ne centrifugada 15.000 x g Nxoge 2 min jar mpat'i ambiente (RT) mi 'be̲ni 22 ° c.ndunthe Ar fase acuosa mäs xi ngu da contiene ar ADN genómico bí cuidadosamente separada ne recopilada 'nar 'ra'yo tubo Eppendorf estéril.
'Mefa, ya muestras ma sonicadas pa fragmentar ar ADN. Bi thogi ar ar sonicación bí realizado jar da ehese̲ ya nkohi Komo ar pede ma 'met'o mi. Pa evaluar ya efectos ar fragmentación ar ADN genómico, ya muestras ma analizadas ir nge njapu'befi ya electroforesis jar gel ar agarosa.
(…) Ya muestras mpakuthuu sonicadas Nxoge 2,5 min ma sometidas ja 'nar bi thogi extracción 'mefa xta nt'ot'e térmico ne centrifugación. DNA liberado bí extraída yoho ya 'nandi ko 'nar mezcla alkol fenol: cloroformo: isoamílico ne xu̲ki 'na jar segundo sonicación pa 0 — 15 ya t'olo ora ar agarosa ar electroforesis bí utilizaron pa ar tsa da jäts'i NTHEGE tamaño ADN 'mefa xta ar extracción fragmentación ultrasónica (Fig. ja ar xeni mäs xi ngu derecha). ADN altamente fragmentado mar evidente ar 'bu̲i 'nar borrón transferencia ADN en lugar de bandas be̲xu molecular mar hñets'i ne bi eliminados ja ya muestras sonicación Nxoge 2,5 min wa nä'ä. Sonicación mäs gradualmente mi reducido fragmento longitudes ma aproximadamente 150 — 600 bp ne sonicación Nxoge 15 min mäs degradados nuya fragmentos, nu'u̲ to ga ar ga̲tho ya xeni mäs xi ngu ya frotis. Bí nja'bu̲ bí tamaño ar made fragmento ADN disminuyó gradualmente ar pa ultrasonidos ne ár nt'ot'e ya 5 t'olo ora permitido da tamaños ar ADN fragmentos mäs adecuados pa ya ensayos array chip. Ir último, bí estableció ar nt'ot'e nt'ot'e DNA analito da comprende ya primeros 2 t'olo ora ar nt'ot'e ir nge ya ultrasonido, extracción ADN (2 ×) ne 'mefa ár njäts'i Tange'u 5 min sonicación. (Basselet et jar el., 2008)

Inmunoprecipitación cromatina (ChIP)

Procesador ultrasónico UP100H pa CIS, ARN ne cizallamiento cromatina. ('Yot'e clic pa ntu̲ngi!)Ya células HEK293 ma cultivadas Komo ar pede ma 'met'o mi ne ko 2 mM disuccinimidyl — glutarato ya 45 min jar mpat'i ambiente. 'Mefa, ya células ar lavaron yoho ya 'nandi ko PBS. Cromatina entrelazada ya 10 min jar mpat'i ambiente ko ya formaldehído jar 1% (v/v) ne xu̲t'i yoho ya 'nandi ko PBS helado. Ar reacción ar cross — linking ar detuvo ir nge ar incubación ko glicina ja 'nar concentración final 0,125 M Nxoge 5 ya t'olo ora da mpat'i ambiente. Ir ar incubación ko ya tripsina, ya células mi raspadas ar placa cultivo celular ne da lavaron yoho ya 'nandi ko PBS. Ar precipitado ar células bí resuspendió jar buffer lisis (tubos 5 mM, pH 8.0, 85 mM KCl ne 0.5% (v/v) Nonidet hne — 40), bí incubó jar hielo Nxoge 10 min ne homogeneizado ko 'nar homogeneizador Dounce. 'Mefa, ya núcleos ma peleteados ya centrifugación (3500 x g, 5 ar min, 4 ° C) ne resuspendió buffer núcleos (50 mM Tris — HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA ne 1% (p/v) ar SDS). Ya núcleos ma interrumpidos ya sonicación ko hñu pulsos ar 20 s ja 'nar UP50H sonicador (Hielscher Ultraschall Technologie) jar 'nar entorno ciclo 0.5 ne amplitud 30%, obtención ADN genómico fragmentos ko tamaño 'nar dätä 200-1000 bp. Pa ChIP, 50g DNA bí buffer diluido inmunoprecipitación jar 4 ya 'nandi (16,7 mM Tris — HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X — 100 ne 0.01% (p/v) ar SDS). (Weiske et jar el. 2006)

Análisis nyokwi nthoki ya histonas ya inmunoprecipitación cromatina (ChIP)

Nsa̲di, 6 x 106 ya células ma lavadas yoho ya 'nandi ko PBS ne reticuladas jar placa cultivo Nxoge 15 min jar mpat'i ambiente jar 'bu̲i Kwä formaldehído 0,5%. Reacción ar cross — linking da detuvo ya adición glicina 0,125 M. Ga̲tho ya pasos posteriores bí duts'i da t'ot'e xi hño ja ya 48° c.ndunthe Ga̲tho ya memorias intermedias ma mpakuthuu enfriadas ne contienen inhibidores ar proteasa (Mini nxo̲ge, Roche). Células ar lavaron ya yoho ya 'nandi ko PBS ne gem'bu̲ raspó. Recogidos disolvieron jar 1 ml tampón lisis (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ne da sonicó ja 'nar nsaha etanol ar tse̲ pa 10 ciclos ma 100% amplitud utilizando 'nar UP50H sonicador (Hielscher, Teltow, nu Alemäña). Fragmentación ar cromatina bí visualizó jár gel ar agarosa da 1%. Fragmentos obtenidos bi ma ja ar rango 200 — 500pb. Cromatina soluble da obtuvo ya centrifugación ya muestras sonicadas 14.000 ar g ya 10 min ma 48° c.ndunthe Ar fracción ar soluble bí buffer diluido 1 yá 10 jar dilución (1% Tritón X — 100, 2 mM EDTA, pH ar Tris 20 mM 8, 150 mM NaCl) 'me̲fa alícuotas ne almacenado ma 80 ° C asta ár njapu'befi. (Rodríguez et jar el., 2008)

Dispositivo ar Nts'edi [W] Ar klase Volumen [mL]
VialTweeter 200 Ndäse̲ 0.5 1.5
UP50H 50 'ye̲ wa 'nehe 0.01 250
UP100H 100 'ye̲ wa 'nehe 0.01 500
UP200Ht 200 'ye̲ wa 'nehe 01. 1000
UP200St 200 'nehe 01. 1000
UP400St 400 'nehe 5.0 2000
CupHorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 celda flujo dí contaminación

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Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

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Ot'a yá referencias

  • Basselet hne., G. Wegrzyn, Enfors S.-O., M. Gabig — Ciminska (2008): procesamiento chip basado ar nkohi análisis DNA enterohemorrágica Escherichia coli (EHEC) ja ar muestra. Fábricas células microbianas 7:29. 2008.
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  • E Fredlund, Gidlund A., M. Olsen, Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Evaluación ar ar nt'ot'e extracción ADN Fusarium micelio ne trigo pa cuantificación PCR jar pa real rio abajo ne correlación niveles micotoxinas. He̲'mi hyax'bu̲pa 2008 ya nt'ot'e microbiológicos.
  • Fritsche c.ndunthe, M. thuhni, Weiland N., R. Breitling, Pohl H.-D. (2007): caracterización comportamiento crecimiento Leishmania tarentolae, 'nar 'ra'yo ko ya hmä proteínas recombinantes. He̲'mi hyax'bu̲pa ar microbiología básica 47, 2007. 384 — 393.
  • RISTOLA M. S. Arpiainen, Saleem M. A., Mathieson hne. W., I. G. Galés, S. Lehtonen, Holthöfer H. (2009): Reglamento ar Neph3 gene jar podocytes — ndu'mi 'befi ar transcripción factores NF — kB ne Sp1. BMC Molecular biología 10:83, 2009.
  • J Rodriguez L. ir ndo̲'mi, Jorda M., Morales c.ndunthe, Munoz M., Vendrell, E., Peinado M. A. (2008): Seguimiento nga̲tho ar genoma unmethylated DNA Alu ar repeats jar células normales ne cancerígenas. Nthoni ar ácidos nucleicos Vol. 36, Nº 3, 2008. 770 — 784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): ar tríada histidina proteína Hint1 desencadena Apoptosis Ndäse̲ ár nt'ot'e enzimática. Ar he̲'mi hyax'bu̲pa Biological chemistry. Vol. 281, hi'nä. 37, 2006. 27356 27366.


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Ts'ut'ubi ultrasónico ar ADN bí basa ar cavitación acústica ne yá ndu cizallamiento hidrodinámico