Cizallamiento ultrasónico ar ADN

• Nxoge ar cizallamiento ar ADN ne ar ARN, ya moléculas ADN ar rompen jar pedazos mäs t'olo. Fragmentación ADN yá ARN ge 'na ya pasos nsu nt'ot'e muestras mahyoni pa da t'ot'e ya bibliotecas pa ar secuenciación Nu'bu̲ Xtí generación (NGS).
• Cizallamiento ultrasónico ar ADN gi japu̲'be̲fi ya ndu nzafi ar cavitación acústica pa romper ar ADN wa ar ARN pedazos 100 – 5 kb bp.
• Ar cizallamiento ultrasónico permite 'nar fragmentación precisa jar ADN ne ár adaptación ar longitud ar ADN deseada.

Cizallamiento ADN ir nge ya ultrasonidos

Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe soluciones nthe jar ultrasonidos pa ar cizallamiento ar ADN, ar ARN ne ar cromatina. Elija ja 'nar ultrasonido ar klase sonda (nt'udi, UP100H) pa ar sonicación directa ir nge 'nar microtip, wa utilice ar VialTweeeter wa ar cuphorn ultrasónico pa jar nt'ot'e indirecta ADN ndunthe ya muestras simultáneamente. Hielscher ofrece ar dispositivo ideal yá ja yá ndu: ya nä'ä da pets'i 1 wa asta 10 muestras, volúmenes microlitros litros – Ya procesadores ultrasónicos Hielscher gi 'bu̲hu̲ da 'mui da satisfacer yá ndu nt'ot'e fragmentos ADN, ARN ne cromatina ko ar longitud adecuada. Ar reproducibilidad, ar facilidad ar manejo ne ar control preciso permiten 'yo̲t'e ya 'nar biblioteca fiable pa ar secuenciación ar ngäts'i ar generación.
Bí diferencia ar fragmentación enzimática ar ADN, ar cizallamiento ultrasónico t'uni ndu cizallamiento mecánicas puras hinda añadir ningún producto químico. Ir nge ar za preciso ya parámetros ar proceso, ar cizallamiento ultrasónico produce fragmentos ADN mar hñets'i be̲xu molecular (plásmido ne ADN genómico).
Ya ácidos nucleicos purificados xi amplificar ar nu'bu̲ wa 'mefa xta 'nar etapa fragmentación.
Ya parámetros sonicación (nts'edi, ciclo pulso yá ze̲di, ar pa ne ar mpat'i) bí xi controlar ya nt'ot'e segura a través de ar configuración ar software.

Protocolos pa ar cizallamiento ultrasónico ar ADN

pa ensayo inmunoprecipitación cromatina

Nsa̲di, ya células colocaron jar placas 60 mm diámetro (400.000 ya placa) ne da transfectaron ko siRNA RhoA (Komo ar pede); 'mefa xta 72 h, bí incubaron ko formaldehído (concentración final, 1%) Nxoge 10 min ma 37 °C para entrecruzar las proteínas con el ADN. Ar reacción ar reticulación bí apagó ir nge ar adición 'nar 'betho 'nar xe̲ni ar volumen glicina 1,25 mol yá L, nä'ä umbi 'nar concentración final 125 mmol yá L. Ya células da lavaron ya yoho ya 'nandi ko PBS helado, resuspendieron jar tampón ensayo radioinmunoprecipitación [150 mmol yá L ya NaCl, 1% ar NP40, 0,5% ar desoxicolato, 0,1% ar SDS, 5 mmol yá L ya EDTA, 50 mmol yá L ya Tris — HCl (pH 8,0)] da contenían 1 mmol yá L ya fluoruro fenilmetilsulfonilo, 1 Ag yá mL ya aprotinina ne 1 Ag yá mL ya pepstatina A, i bí mantuvieron jar hielo Nxoge 30 ar min. Tso̲kwa continuación, lisados ya celulares ar sonicaron jar hielo ko 'nar Hielscher UP200S ultrasonido (3 x 40 s, amplitud 40%, ciclo 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) Asta ke ya cromatinas reticuladas ar the̲kwi pa producir fragmentos ADN ja ya 200 ne ya 1.000 pb. Bí utilizó 'nar 'betho 'nar xe̲ni ar lisado entero da cuantificar yá 'bede ya ADN 'mui ja ya 'na'ño muestras ne da consideró komongu “ADN Nxoge ar entrada”. Ya sobrenadantes ar incubaron ko esperma salmón ko ADN yá proteína ya agarosa — 50% ar suspensión pa reducir ts'o̲e inespecífico. Tso̲kwa continuación, ar inmunoprecipitación bí realizó durante la noche a 4 °C con 5 Ag de anti-NF-nB p65 (Upstate) o hinda anticuerpos (control negativo). Estos sobrenadantes se suplementaron con NaCl 5 mol/L y se calentaron durante la noche a 65 °C para revertir los enlaces cruzados proteína-ADN. Ya inmunocomplejos ar trataron 'mefa ko proteinasa ë mpe̲fi DNasa ne RNasa, ne ar ADN bí purificó ir nge ya extracción fenol yá cloroformo ne precipitación etanol. La PCR se realizó con cebadores específicos correspondientes a una secuencia dentro de la región promotora del gen iNOS humano (cebador p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; cebador p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et jar el., 2008)

Nsadi ya hmä EGFP

Pa ya nsadi ya hmä, bí cultivó ar cepa recombinante L. tarentolae p10:F9Begfp1. 4dBsat#12 (Jena Bioscience, nu Alemäña) ko gen EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ssu cromosómica 'mui, ja ya yá nt'ot'e descritos ma 'met'o mi ne adicionalmente ar suplementó ko 100 mg l^-1 Nourseotricina (Jena Bioscience, nu Alemäña). Nxoge ar cultivo, ar tomaron muestras 1 ar ml, ar centrifugaron (2000 × g, 20 °C, 10 min) ne lavaron ko 'nar solución NaCl ma 0,9%. Ar pellet resuspendió jar tampón (20 mM ar HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM TDT) ne desintegró ya sonificación ko ar procesador ultrasónico UP400S (aplicación de energía ∼ 400 Ws). Ya restos celulares eliminaron ya centrifugación (6000 × g, 4°C, 5 min) ne da analizaron ir nge ya electroforesis ya electroforesis jar gel dodecilo sulfato sodio ne poliacrilamida (SDS — PAGE) jar nkohi reductoras nä'ä mä jar nt'ot'e Laemmli (1970) ko geles poliacralamida 12,5%. Ar examinó ar hmä EGFP jar jár 'mui agitada. (Fritsche et jar el. 2007)

inmunoprecipitación cromatina

Ensayo inmunoprecipitación cromatina ar realizó utilizando ar ChIP — IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, EE. UU.) ir nge ya instrucciones ar fabricante ra nyokwi. Nsa̲di, ya podocitos humanos diferenciados ar reticularon ko ya formaldehído jar ar 1% Nxoge 10 min jar mpat'i ambiente. Ya células ar lavaron ko PBS helado ne ar reacción fijación ar detuvo añadiendo glicina 0,125 M Nxoge 5 ar min da mpat'i ambiente. Ya celdas lavaban ar nuevo ko PBS helado ne raspaban ar mohi. Ya células peletizaron ya centrifugación ne resuspendieron jar tampón lisis. 'Mefa xta centrifugación, ya núcleos granulados resuspendieron jar tampón cizallamiento, bí incubaron jar hielo Nxoge 30 ar min ne ar cromatina bí cortó ya sonicación, hne. ej. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, nu Alemäña) ja ar 25% ar nts'edi 5 pulsos ar 20 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i kadu 'na dige ya hielo jar fragmentos aproximadamente 200 — 600 pb. Tso̲kwa continuación, bí centrifugaba ar cromatina cortada ne bí recogía ar sobrenadante. Para las inmunoprecipitaciones, se incubaron 60 μl de cromatina con 1 μg de anticuerpos Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) o NF-κB p50 (Abcam) o con IgG de conejo (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), como control negativo, durante la noche a 4°C con rotación suave. Ya inmunocomplejos unidos ya perlas magnéticas ar recolectaron utilizando 'nar soporte magnético, ar lavaron extensamente, ne ya enlaces cruzados proteína yá ADN ar invirtieron ne ar ADN bí eluyó pa ar análisis PCR jar pa real. (Ristola et jar el. 2009)

Nt'ot'e ADN EHEC análisis matrices chips

'Na ar nt'ot'e lisados ar celulares ne ar ADNs extraídos
Ya gránulos bacterianos suspendidos jar PBS asta ar concentración final deseada ar trataron ko disruptor ultrasonidos UP100H (Hielscher GmbH, nu Alemäña) equipado ko 'nar micropunta MS1 (1 mm ar diámetro). Frecuencia funcionamiento mar 30 ar kHz ne ár nts'edi salida efectiva mar 100 ar W. Nxoge ar operación ya muestras enfriaron ja 'nar nsaha ar dehe helada, ar mezclaron ne ar centrifugaron. Ya muestras ar utilizaron pa nsadi citometría flujo, Mente mi pa ár 'mefa ár njäts'i Tange'u manipulación, ya muestras ar sometieron ja 'nar nt'ot'e térmico (95°C, 5 min). Ya lisados celulares crudos ar procesaron ko 'nar mezcla fenol: cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). Bí añadió 'nar volumen igual xí mezcla ja ar muestra ar lisado, ár njäts'i nu'u da agitó jar vórtice vigorosamente Nxoge 15 s ne centrifugó ma 15.000 x g durante 2 min jar mpat'i ambiente (RT) mi 'be̲ni 22 °C. Ar fase acuosa mäs xi ngu da contenía ar ADN genómico bí separó ar cuidadosamente ne ar recogió ja 'nar 'ra'yo tubo Eppendorf estéril.
'Mefa, ya muestras ar sometieron da sonicación pa fragmentar ar ADN. Ar etapa ar sonicación bí realizó jar da ehese̲ ya nkohi da ya descritas ma 'met'o mi. Pa evaluar ya efectos fragmentación dige ar ADN genómico, ya muestras ar analizaron ir nge ya electroforesis jar gel ar agarosa.
(…) Ya muestras sonicadas mpakuthuu Nxoge 2,5 ar min bí sometieron ja 'nar fase extracción ir 'nar nt'ot'e térmico ne 'nar centrifugación. Ar ADN ar liberado bí extrajo yoho ya 'nandi ko 'nar mezcla fenol: cloroformo:alcohol isoamílico, ne 'mefa da sometió ja 'nar ñoho sonicación Nxoge 0 — 15 ma min. Ar utilizó electroforesis jar gel ya agarosa pa ar tsa da jäts'i NTHEGE tamaño ar ADN 'na jar fragmentación ultrasónica 'mefa ár njäts'i Tange'u ja ar extracción (Fig. jar ar xeni mäs xi ngu derecha). Ar ADN altamente fragmentado mar evidente ya 'bu̲i 'nar frotis ADN en lugar de ya bandas mar hñets'i be̲xu molecular ne da eliminaron ja ya muestras sonicadas Nxoge 2,5 t'olo ora wa mäs. 'Nar sonicación mäs xi maki redujo gradualmente ar longitud ya fragmentos asta aproximadamente 150 — 600 pb, ne sonicación Nxoge 15 ya t'olo ora degradó aún mi mäs nuya fragmentos, ngu ar tsa̲ da ga ga̲tho jar xeni mäs xi ngu ar frotis. Bí nja'bu̲ bí tamaño ar made ya fragmentos ADN disminuyó gradualmente ko ar pa ultrasonicación ne ár nt'ot'e ya 5 t'olo ora permitió da tamaños ar fragmentos ar ADN xí adecuados pa ya ensayos matrices chips. Ar ngäts'i, ar estableció ar nt'ot'e nt'ot'e ar analito ADN, da comprendía ya primeros 2 t'olo ora ar nt'ot'e ultrasónico, ar extracción ADN (2×) ne ar 'mefa ár njäts'i Tange'u sonicación 5 t'olo ora. (Basselet et jar el. 2008)

Inmunoprecipitación cromatina (ChIP)

Ya células HEK293 cultivaron nu'u̲ bí describió ma 'met'o mi ne da fijaron ko 2 mM disuccinimidil — glutarato Nxoge 45 min jar mpat'i ambiente. 'Mefa, ya células ar lavaron yoho ya 'nandi ko PBS. Ar cromatina ar reticuló Nxoge 10 min jar mpat'i ambiente utilizando formaldehído jar 1% (v/v) ne 'Beni yoho ya 'nandi ko PBS helado. Ar reacción ar reticulación bí detuvo ir nge ya incubación ko glicina ja 'nar concentración final 0,125 M Nxoge 5 min jar mpat'i ambiente. 'Me̲fa ar incubación ko ya tripsina, ya células rasparon ar placa cultivo celular ne da lavaron yoho ya 'nandi ko PBS. Ar pellet ar celular bí resuspendió jar tampón lisis (5 mM tuberías, pH 8.0, 85 mM KCl ne 0.5% (v/v) ar Nonidet hne — 40), bí incubó jar hielo Nxoge 10 ar min ne ar homogeneizó ko 'nar homogeneizador Dounce. Posteriormente, ya núcleos da peletizaron ya centrifugación (3500 x g, 5 min, 4 °C) ne se resuspendieron en tampón de núcleos (50 mM de Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM de EDTA y 1% (p/v) de SDS). Ya núcleos ma interrumpidos ya sonicación ko hñu pulsos ar 20 — s ja 'nar Sonicar UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) jar 'nar za ciclo 0,5 ne amplitud ar 30%, produciendo fragmentos ADN genómico ko 'nar tamaño aparente 200 ma 1000 pb. Pa ChIP, 50 g ADN ar diluyeron 4 bes jar tampón inmunoprecipitación (16,7 mM Tris — HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) ar Triton X — 100 ne 0,01% (p/v) ar SDS). (Weiske et jar el. 2006)

Análisis nyokwi nthoki histonas ya inmunoprecipitación cromatina (ChIP)

Nsa̲di, 6 x 10⁶ Ya células ar lavaron yoho ya 'nandi ko PBS ne da reticularon jar placa cultivo Nxoge 15 min jar mpat'i ambiente jar 'bu̲i Kwä formaldehído ma 0,5%. Ar reacción ar reticulación bí detuvo ir nge ar adición glicina 0,125 M. Ga̲tho ya pasos posteriores bí duts'i da t'ot'e xi hño ja ya 48 °c.ndunthe Ya tampones ma preenfriados ne contenían inhibidores proteasa (Complete Mini, Roche). Ya células da lavaron ya yoho ya 'nandi ko PBS ne gem'bu̲ bí rasparon. Ya gránulos recogidos disolvieron jar 1 ml tampón lisis (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ne da sonicaron ja 'nar nsaha etanol ar tse̲ Nxoge 10 ciclos ja ar 100% ar amplitud utilizando 'nar Sonicar UP50H (Hielscher, Teltow, nu Alemäña). Ar fragmentación ar cromatina bí visualizó jar gel ya agarosa jar 1%. Ya fragmentos obtenidos mi 'bu̲i ar rango 200 ma 500 pb. La cromatina soluble se obtuvo centrifugando las muestras sonicadas a 14.000 g durante 10 minutos a 48 °C. Ar fracción soluble da diluyó ya 1 yá 10 jar tampón dilución (1% Triton X — 100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) xu̲ki ar alícuota ne ar almacenó da 80 °C asta ár njapu'befi. (Rodríguez et jar el. 2008)