Nt'ot'e plásmidos ir nge ya ultrasonidos

Ar ultrasonicación ge 'nar técnica fiable pa fragmentar ar ADN plasmídico. Ar amplitud, ar modo ar pulsación ne ar control ar mpat'i controlables ko ya precisión ya ya características mäs mahyoni 'nar ultrasonido pa fragmentación hingi dañina plásmidos. 'Nehe, njapu'befi ya ciertos agentes ayuda ma proteger kontra ar degradación plásmidos. Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe soluciones pa fragmentación controlada plásmidos a partir de viales Nthuts'i, ar sonicación simultánea numerosas ar muestras ne ar placas pocillos múltiples. Obtenga mäs ungumfädi dige ar éxito ar fragmentación plásmidos ultrasónicos.

Cizallamiento plásmidos ir nge ya ultrasonidos

Nu'bu̲ ya muestras ADN ar someten da ondas ya ultrasónicas, ya vibraciones generadas ya ultrasonidos crean cavitación acústica ja ar líquido da tseki wa 'wagi ya moléculas ADN mar hñets'i be̲xu molecular a través de ndu mecánicas. Ar sonicación ge ár nt'ot'e mäs utilizado pa ya experimentos ar cizallamiento masivo ADN, incluidas aplicaciones, komongu ar inmunoprecipitación cromatina (ChIP), pa dá nuna ya tamaños fragmentos t'olo ya absolutamente cruciales da uni 'na mextha resolución. (cf. Tseng et jar el., 2012)
Ar ADN plasmídico (ADNp) ge 'nar dets'e específica ADN, caracteriza ir nge ár dets'e anillo ne o 'mu̲i jar bacterias ne 'ra ya eucariotas.
Ar ADNp ar superenrollado ar dets'e deseada ADN plasmídico, ya da gi 'ñudi ya mpädi mäs xi resultados jar procesos ya posteriores, komongu ar secuenciación ne ar transfección automatizadas. Ar ultrasonicación ar adecuada pa fragmentar éxito ko ar ADNp, incluido ar ADNp superenrollado.
Thompson et jar ar. (2008) demostraron da sonicación plásmidos, nä'ä da mfädi da fragmenta ar ADN superenrollado, ge 'nar dets'e xi hño mejorar ya longitudes da ar secuencia phred20 asta punto nä'ä hingi 'bu̲hu̲ significativamente 'na'ño ar plantilla ar control Beckman Coulter wa ya plásmidos linealizados enzimáticamente.

Ya vectores plásmidos ndu

Ya plásmidos ar utilizan tso̲kwa menudo komongu ya bo̲jä nu'u̲ pa clonar, transferir ne manipular genes. Nu'bu̲ ya plásmidos ar utilizan experimentalmente pa nuya ngäts'i, ar denominan vectores. Fragmentos ADN wa genes ar xi insertar ja 'nar vector plásmido, creando ar llamado plásmido recombinante. Vectores ya plásmidos ar utilizan komongu vehículos pa da t'ot'e ar ADN recombinante 'nar célula huésped ne ge 'nar componente clave ar clonación molecular.
“Ya vectores hingi virales gi 'bu̲hu̲ komongu ampliamente estudiados ir nge ár tsa̲ njapu'befi ja ar terapia génica pa japi 'na'ño enfermedades complicadas. Ya vectores hingi virales protegen ar ADN plasmídico kontra ar degradación física, química ne enzimática ne entregan ar molécula ADN bí sitio ar objetivo. Ngu, ya liposomas catiónicos, ar quitosano ne ma'ra nanopartículas cargadas positivamente o̲t'e complejos ko ar ADN plasmídico a través de interacciones electrostáticas. Wat'i, ya complejos liposomas catiónicos yá ADN plasmídico mi o̲t'e hingi hembi da ya relativamente dätä (es decir, 300 — 400 nm) ne ar 'mui heterogénea, nä'ä mi dificulta ár njapu'befi aplicaciones farmacéuticas. Ya complejos dätä ne heterogéneos ADN yá liposomas, ADN plasmídico yá aerosoles ne ADN plasmídico yá péptidos xi reducir bí ma partículas mäs t'olo ne homogéneas ir nge ya ultrasonidos.” (Sarker et jar el., 2019)
'Nar ejemplo destacado njapu'befi ya vectores plásmidos ar CRISPR — Cas9. Ko ya CRISPR — Cas9 nu'bu̲ da nthe̲hu̲ 'ra bí administra ja ya células komongu 'nar Honto plásmido dätä wa varios plásmidos mäs t'olo da codifican 'nar secuencia objetivo, 'nar guía CRISPR ne ar Cas9.

Nt'ot'e ultrasónica nanopartículas ar PLGA cargadas ar ADN ir nge ya nanoprecipitación

Jo et jar ar. (2020) utilizaron ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) pa formar 'nar portador nanopartículas pa ar nts'ogi 'nar plásmido modelo CRISPR — Cas9 jar macrófagos primarios derivados ar médula ósea. Pa ar nanoprecipitación nanopartículas PLGA, ar utilizaron PLGA ko yoho Hmunts'i finales 'na'ño (Hmunts'i éster ne aminas) ko ar objetivo ke ya tapas ar amina cargadas positivamente aumenten dätä nt'ot'e encapsulación ne ar carga debido ja ya interacciones carga entre nuna ne ar columna vertebral cargada negativamente ar ar ADN. Ja 'nar tubo centrífugo cónico ar polipropileno 50 ar mL, ar disolvieron 100 mg Pluronic F127 jar 20 mL ar dehe desionizada esterilizada autoclave ir nge ya mezcla jar vórtice, seguida ar 30 ar min sonicación za̲tho ir nge 'nar nsaha ultrasónico ()ga CupHorn). Bí añadió 'nar barra xí agitadora magnética esterilizada jar autoclave ne ár njäts'i bí mezcló bí 600 ar RPM Nxoge 30 ar min Mente ar elaboraban 'ra ya soluciones. Ar utilizó he̲'mi laboratorio plástico en lugar de xito pa minimizar adsorción inespecífica ADN. Ya soluciones ar PLGA disueltas DMF (44,48 mg yá ml) ne TIPS pentaceno disuelto THF (0,667 mg yá ml) elaboraron ya hñe̲gi. Ar PLGA ar bí zogi inactivo jar DMF Nxoge 30 t'olo ora 'be̲tho da sonicado Nxoge 30 ar min. (ar Nthuts'i nkohi completo, pa ga ar Jo et jar el., 2020)

'Ba̲ts'i ar ADN plasmídico Nxoge ar sonicación

Ar ADN, incluidos ya plásmidos ne ya plásmidos superenrollados, ar altamente sensible 'na jar degradación. Ngatho ya nt'ot'e ar fragmentación da 'mui ya conocidos ja yá desventajas. Fragmentación ultrasónica ar ADN ge 'na ya nt'ot'e preferidos, ya da sonicación controlada combinación ko ya t'eni jar 'ba̲ts'i permite reducir ngi ya hebras ADN inducido ir nge ar cizallamiento ne ar pa.
'Nehe ar ajustes xí hñets'i'i amplitud, modo pulsación ne ar control ar mpat'i Nxoge ar cizallamiento ultrasónico ar ADN, njapu'befi ya ciertos agentes mostró 'nar ntsoni protector significativo kontra ar degradación ar ADN. Ngu, varios polímeros, péptidos ne lípidos protegen ar ADN plasmídico Nxoge ar ultrasonicación.

Nzäm'bu ar ADN plasmídico ne ya nanocomplejos ADN yá IL plásmidos hä esfuerzo cizallamiento ultrasónico ar investigó ir nge 'nar ensayo electroforesis jar gel ar agarosa. Tanto ar ADN plasmídico ngu ya nanocomplejos ADN plasmídico yá IL plásmidos ar sometieron ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge ya 'na'ño puntos tse̲t'i. Ar ADN plasmídico ar expuso ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30 ne bi 40 t'olo ora. Wat'i, ya nanocomplejos ADN yá IL ya ar plásmido bí expusieron ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ne ar 120 ya t'olo ora.
(estudio ne ya tsita: ©Sarker et jar el., 2019)

Sarker et jar ar. (2019) demostraron da nu'bu̲ ya nanoestructuras ADN plasmídico yá líquido iónico (pDNA yá IL) bí sometieron ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ne 120 min ne complejaron ko ar agente entrega genes catiónicos disponible comercialmente lipofectamina, porcentaje células fluorescentes positivas bí ar 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65% 65% ne 50%, respectivamente (ga ar ar gráfico da ku̲hu̲). Porcentaje células fluorescentes positivas bi hñuts'i nu'bu̲ ya nanoestructuras ar sometieron ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 10 ne 20 min, ne 'mefa disminuyó lentamente.

Influencia ar líquido iónico [Bmim] [PF6] jar entrega ADN plasmídico ya células COS7. Ya nanocomplejos ADN plasmídico yá IL (líquido iónico) bí sometieron 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 'nar máximo 120 t'olo ora ne da complejaron ko ar 'be̲tho da̲ ya ya células COS7. Ya datos muestran ar 'bede promedio (%) ar células HeLa positivas pa GFP contadas 10 campos microscópicos 'na'ño ne ar experimento bí realizó xingu ya bes jar hñu ya pa 'na'ño. (Estudio ne gráfico: ©Sarker et jar el., 2019)

Nt'ot'e lisado ultrasónico

Nthuts'i nkohi lisis celular ultrasónica
Comience ko 'nar muestra enriquecida células da hyoki ir nge 'nar nt'ot'e separación celular (nt'udi, separación celular inmunomagnética, clasificación celular activada ya fluorescencia (FACS), centrifugación jar gradiente densidad, aislamiento celular ya inmunodensidad).
Ya muestras células tsa mostrar 'nar volumen tampón lisis ne da apropiado pa ar objetivo ar experimental ne ar ultrasonido ar klase sonda.
Ar prefieren ya tampones hipotónicos, ya da mejoran ar lisis celular ultrasónica. Ar mahyoni da ya aditivos ne ar concentración sal ar utilicen ar bí adecuada.
Seleccione ár dispositivo lisis ultrasónica: pa ar sonicación indirecta viales, recomiendan ar VialTweeter wa ar CupHorn. Pa ya placas pocillos múltiples, ar UIP400MTP ge ar ultrasonido ideal. Ne ar sonicación clásica ar klase sonda, 'nar homogeneizador ultrasónico Komo ar UP100H wa ar UP200Ht micropunta ya mäs ya adecuados.
Nthuts'i nkohi pa ar sonicación ar klase sonda: Introduzca ar sonda ultrasonicadora jar volumen muestra 'nar tubo ya microcentrífuga ne ya sonique Nxoge 'ra 10 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i. Dependiendo de ar muestra ADN, ar sonicación to japi ar 'nar wa yoho ya 'nandi mäs. Entrada energía ultrasónica requerida (Ws yá mL) bi jagu̲ju̲ viscosidad ar muestra ne ar klase ar ADN. Enfriamiento ir nge nsaha hielo ne ar modo pulsación ar ultrasonido ayudan jar nu'bu da ar muestra ar degrade térmicamente.
'Me̲fa ar lisis ultrasónica, ar muestra ar centrifuga da separar ya restos gránulos (da contienen células hingi lisadas, ar núcleos ne ar orgánulos hingi lisados)
Nu'bu̲ ar muestra hingi ar procesa ngut'a, ar tsa̲ da almacenar ja 'nar mpat'i adecuada da jwati ár viabilidad.

Ultrasonidos pa ar fragmentación ar ADN

Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe plataformas nthe jar ultrasonidos pa ar fragmentación ar ADN, ar ARN ne ar cromatina. Gi Bu̲i plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones sonicación indirecta pa jar nt'ot'e simultánea muestras múltiples tubos wa placas varios pocillos (nt'udi, placas ar 96 pocillos, placas microtitulación), sonorreactores ne cuphornes ultrasónicos. Ga̲tho ya plataformas pa ar cizallamiento ar ADN gi impulsadas ya procesadores ultrasónicos mar hñets'i ar rendimiento ne ar frecuencia ajustada, ar xi controlar ko ya precisión ne ofrecen resultados reproducibles.

Procesadores ultrasónicos pa 'na ya 'bede ne tamaño muestra

Ko ya ultrasonidos multimuestra Hielscher VialTweeter (pa ga 10 tubos ar ensayo) ne UIP400MTP (da microplacas yá placas multipocillos), ar tsa̲ ga reducir hingi hembi da ar pa procesamiento muestras jamädi 'nar ultrasonicación intensa ne controlable ko ar precisión, da ar pa da obtiene jar Nthege ar tamaño ne ar rendimiento deseados ya fragmentos ADN. Fragmentación ultrasónica ar ADN xí da pasos ya nt'ot'e plásmidos 'bu̲hu̲ eficientes, fiables ne ar escalables. Ya protocolos ar xi escalar linealmente ar 'na jar ndunthe muestras ir nge ar nt'ot'e parámetros ar ultrasonido constantes.
Ya ultrasonidos sonda 'na jar ku̲t'a dedos ya ideales pa jar nt'ot'e muestras mäs t'olo. Ya ultrasonidos laboratorio Hielscher gi 'bu̲hu̲ da 'mui ko 'na'ño niveles nts'edi pa da tsa da 'ñets'i ar disruptor ultrasónico ideal pa ár nt'ot'e relacionada ko ar ADN.