Ar ultrasonicación ge 'nar técnica confiable pa fragmentar ar ADN plásmido. Amplitud controlable ko ar precisión, ar modo ar pulsación ne ar control mpat'i ya ya características mäs mahyoni 'nar ultrasonido pa ar fragmentación plásmidos hingi dañinos. 'Nehe, njapu'befi ya ciertos agentes ayuda ma proteger kontra ya degradación ya plásmidos. Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe soluciones pa fragmentación controlada plásmidos a partir de viales Nthuts'i, ar sonicación simultánea numerosas muestras, nja'bu komongu placas múltiples ar pocillos. Obtenga mäs ungumfädi dige ar fragmentación exitosa plásmidos ultrasónicos!

Cizallamiento plásmidos ir nge ya ultrasonicación

Nu'bu̲ ya muestras ADN ar someten da ondas ya ultrasónicas, ya vibraciones generadas ya ultrasonidos crean cavitación acústica ja ar líquido da tseki wa 'wagi moléculas ADN mar hñets'i be̲xu molecular a través de ya ndu nzafi mecánicas. Ar sonicación ge ár nt'ot'e mäs utilizado pa experimentos ar cizallamiento ADN granel, incluidas aplicaciones, komongu ar inmunoprecipitación cromatina (ChIP), pa dá nuna ya tamaños fragmentos t'olo ya absolutamente cruciales da uni 'nar alta resolución. (cf. Tseng et jar el., 2012)
Ar ADN plásmido (pDNA) ge 'nar dets'e específica ADN, caracterizada ir nge ár dets'e anillo ne o 'mu̲i jar bacterias ne 'ra ya eucariotas.
Ar PDNA ar superenrollado ar dets'e deseada ADN plásmido, ya da gi 'ñudi ya mpädi mäs xi resultados jar procesos posteriores, komongu ar secuenciación ar automatizada ne ar transfección. Ar ultrasonicación ar adecuada da fragmentar ar PDNA, incluido ar pDNA superenrollado, ko ya éxito.
Thompson et jar ar. (2008) demostraron da sonicación plásmidos, nä'ä da mfädi da fragmenta ar ADN superenrollado, ge 'nar dets'e efectiva mejorar ya longitudes da ar secuencia phred20 asta punto nä'ä hingi ya significativamente 'na'ño ar plantilla ar control Beckman Coulter wa ya plásmidos enzimáticamente linealizados.

Ya vectores plásmidos ndu

Ya plásmidos ar utilizan tso̲kwa menudo komongu ya bo̲jä nu'u̲ pa clonar, transferir ne manipular genes. Nu'bu̲ ya plásmidos ar utilizan experimentalmente pa nuya ngäts'i, ar llaman vectores. Ya fragmentos wa genes ADN ar xi insertar ja 'nar vector plásmido, creando 'nar llamado plásmido recombinante. Ya vectores plásmidos ar utilizan komongu vehículos pa da t'ot'e ADN recombinante 'nar célula huésped ne ge 'nar componente clave ar clonación molecular.
“Ya vectores hingi virales gi 'bu̲hu̲ komongu ampliamente estudiados ir nge ár njapu'befi potencial ja ar terapia génica pa japi 'na'ño enfermedades complicadas. Ya vectores hingi virales protegen ar ADN plásmido kontra ar degradación física, química ne enzimática ne entregan ar molécula ADN bí sitio ar objetivo. Ngu, ya liposomas catiónicos, ar quitosano ne ma'ra nanopartículas cargadas positivamente o̲t'e complejos ko ADN plásmido a través de interacciones electrostáticas. 'Ñotho ar embargo, ya complejos ADN catiónico yá adn plásmido liposomas catiónicos hingi hembi da formados ya relativamente dätä (es decir, 300 — 400 nm) ne ar 'mui heterogénea, nä'ä ya xí difíciles ar zu̲di aplicaciones farmacéuticas. Ya complejos ADN yá liposomas ya plásmidos dätä ne heterogéneos, ADN yá aerosoles ya plásmidos ne ya complejos ADN yá péptidos ya plásmidos ar xi reducir jar partículas mäs t'olo ne homogéneas ir nge ya ultrasonidos.” (Sarker et jar el., 2019)
Ejemplo destacado da njapu'befi ya vectores plásmidos ar CRISPR — Cas9. Ko ya CRISPR — Cas9 nu'bu̲ da nthe̲hu̲ 'ra bí entrega ja ya células komongu 'nar Honto plásmido dätä wa múltiples plásmidos mäs t'olo da codifican 'nar secuencia objetivo, 'nar guía CRISPR ne ar Cas9.

Nt'ot'e ultrasónica nanopartículas ar PLGA cargadas ar ADN ya nanoprecipitación

Jo et jar ar. (2020) utilizaron ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) pa formar 'nar portador nanopartículas pa ar entrega 'nar plásmido modelo CRISPR — Cas9 jar macrófagos primarios derivados ar médula ósea. Pa ar nanoprecipitación nanopartículas PLGA, ar utilizó PLGA ko yoho Hmunts'i finales 'na'ño (Hmunts'i éster ne amina) ko ar objetivo ke ya tapas finales ar amina cargadas positivamente aumenten dätä nt'ot'e encapsulación ne ar carga debido ja ya interacciones carga entre Nunu̲ ne ar columna vertebral cargada negativamente ar ar ADN. Ja 'nar tubo centrífugo cónico ar polipropileno 50 ml, 100 mg Pluronic F127 ar disolvieron jar dehe DI autoclave ar 20 ml ir nge ya mezcla vórtice seguida ar 30 ar min sonicación za̲tho utilizando 'nar nsaha ultrasónico ()ga CupHorn). Bí agregó 'nar barra xí agitación magnética jar autoclave ne ár njäts'i bí mezcló bí 600 ar RPM Nxoge 30 t'olo ora Mente ar do̲'mu̲te mi 'be̲pi nda ya ma'ra soluciones. Ar utilizó he̲'mi laboratorio plástico en lugar de cristalería pa minimizar adsorción inespecífica ar ADN. Ya soluciones ar PLGA disueltas DMF (44,48 mg yá ml) ne TIPS pentaceno disueltas THF (0,667 mg yá ml) bí Xká 'yot'u̲hu̲ ir 'be̲fi 'bu̲ hñe̲gi. Ar PLGA ar bí zogi inactivo jar nxa jar DMF Nxoge 30 t'olo ora 'be̲tho da sonicado Nxoge 30 t'olo ora.(para el protocolo completo ver Jo et al., 2020)

'Ba̲ts'i ar ADN plásmido Nxoge ar sonicación

Ar ADN, incluidos ya plásmidos ne ya plásmidos superenrollados, ge 'nar degradación altamente sensible. Ngatho ya nt'ot'e ar fragmentación da 'mui ya conocidos ya ciertas desventajas. Fragmentación ultrasónica ar ADN ge 'na ya nt'ot'e preferidos, ya da sonicación controlada combinación ko ya t'eni jar 'ba̲ts'i permite reducir ár ngi inducido ir nge ar cizallamiento ne ar pa ya hebras ADN.
'Nehe ar ajustes xí hñets'i'i amplitud, modo pulsación ne ar control ar mpat'i Nxoge ar cizallamiento ultrasónico ar ADN, njapu'befi ya ciertos agentes mostró 'nar ntsoni protector significativo kontra ar degradación ar ADN. Ngu, varios polímeros, péptidos ne lípidos protegen ar ADN plásmido Nxoge ar ultrasonicación.

Ar nzäm'bu jar ADN plásmido ne ya nanocomplejos ADN yá IL ya plásmidos kontra ar estrés cortante ultrasónico ar investigó utilizando ensayo electroforesis jar gel ar agarosa. Tanto ar ADN plásmido komongu ya nanocomplejos ADN yá IL ya plásmido ar sometieron da tensión Ts'ut'ubi ultrasónico Nxoge ya 'na'ño puntos ya pa. Ar ADN plásmido bí expuesto bí tensión Ts'ut'ubi ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30 ne 40 ya t'olo ora. Wat'i, ya nanocomplejos ADN yá IL ya ar plásmido bí expusieron ja 'nar esfuerzo Ts'ut'ubi ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ne ar 120 ya t'olo ora.
(estudio ne ya tsita: ©Sarker et jar el., 2019)

Sarker et jar ar. (2019) demostraron da nu'bu̲ ya nanoestructuras ADN plásmido yá líquido iónico (pDNA yá IL) bí sometieron bí estrés ar cizallamiento ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ne 120 min ne complejaron ko ar agente nt'uni genes catiónicos disponible comercialmente lipofectamina, porcentaje células fluorescentes positivas bí ar 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% ne 50%, respectivamente (ga ar ar cuadro da ku̲hu̲). Porcentaje células fluorescentes positivas bi hñuts'i nu'bu̲ ya nanoestructuras ar sometieron da tensión Ts'ut'ubi ultrasónico Nxoge 10 ne 20 t'olo ora, ne gem'bu̲ disminuyó lentamente.

Influencia ar líquido iónico [Bmim] [PF6] jar entrega ADN plásmido ya células COS7. Ya nanocomplejos ADN yá IL plásmido (líquido iónico) bí sometieron bí tensión ar cizallamiento ultrasónico Nxoge 'nar máximo 120 t'olo ora ne da complejaron ko ar 'be̲tho da̲ ar ya células COS7. Ya datos muestran ar 'bede promedio (%) ar células HeLa GFP positivas contadas 10 campos microscópicos 'na'ño ne ar experimento bí realizó xingu ya bes jar hñu ya pa 'na'ño. (Estudio ne gráfico: ©Sarker et jar el., 2019)

Nt'ot'e ultrasónica lisado

Nthuts'i nkohi lisis celular ultrasónica
Comience ko 'nar muestra enriquecida células da hyoki a través de 'nar nt'ot'e separación celular (nt'udi, separación celular inmunomagnética, clasificación celular activada ya fluorescencia (FACS), centrifugación ya gradiente densidad, aislamiento celular ar inmunodensidad).
Ya muestras celulares tsa mostrar 'nar volumen 'nar tampón lisis ne da apropiado pa ar objetivo ar experimental ne ar ultrasonido ar klase sonda.
Ar prefieren ya tampones hipotónicos, ya da mejoran ar lisis celular ultrasónica. Ar mahyoni da ya aditivos ne ar concentración sal ar utilicen ar bí adecuada.
Seleccione ár dispositivo lisis ultrasónica: pa ar sonicación indirecta viales, recomiendan ar VialTweeter wa ya cupHorn. Pa placas multipozo, ar UIP400MTP ar ultrasonido ar ideal. Ne ar sonicación clásica ar klase sonda, 'nar homogeneizador ultrasónico Komo ar UP100H wa UP200Ht ko 'nar micrococha ya mäs ya adecuados.
Nthuts'i nkohi pa ar sonicación ar klase sonda: Coloque ar sonda ar ultrasonido ar volumen ar muestra 'nar tubo ya microcentrífuga ne sonice Nxoge aprox. 10 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i. Dependiendo de ar muestra ADN, ar sonicación to japi ar 'nar wa yoho ya 'nandi mäs. Entrada energía ultrasónica requerida (Ws yá mL) bi jagu̲ju̲ viscosidad ar muestra ne ar klase ar ADN. Enfriamiento a través de nsaha hielo ne ar modo pulsación ar ultrasonido ayuda jar nu'bu da ar muestra ar degrade térmicamente.
'Me̲fa ar lisis ultrasónica, ar muestra ar centrifuga da separar ya restos gránulos (da contienen células, ar núcleos ne ar orgánulos hingi lisados)
Nu'bu̲ ar muestra hingi ar procesa ngut'a, ar tsa̲ da almacenar ja 'nar mpat'i adecuada da jwati ár viabilidad.

Ultrasonidos pa ar fragmentación ar ADN

Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe plataformas nthe jar ultrasonido pa ar fragmentación ar ADN, ar ARN ne ar cromatina. Gi Bu̲i plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones sonicación indirecta pa jar nt'ot'e simultánea muestras múltiples tubos wa placas múltiples pomos (nt'udi, placas ar 96 pomos, placas microtituladores), sonoreactores ne cuphorns ultrasónicos. Ga̲tho ya plataformas pa ar Ts'ut'ubi ADN gi alimentadas ya procesadores ultrasónicos mar hñets'i rendimiento ne ajustados jar frecuencia, ya controlables ko ya precisión ne ofrecen resultados reproducibles.

Procesadores ultrasónicos pa 'na ya 'bede ne tamaño muestra

Ko ya ultrasonidos multimuestra Hielscher VialTweeter (pa ga 10 tubos ar ensayo) ne UIP400MTP (da microplacas yá placas multipozo) xähmä hingi hembi da reducir ar pa procesamiento muestras nu'bya ar ultrasonicación intensa ne controlable ko precisión Mente obtiene jar Nthege ne ar rendimiento deseados tamaño fragmento ADN. Fragmentación ultrasónica ar ADN xí da pasos ya nt'ot'e ar plásmido 'bu̲hu̲ eficientes, confiables ne ar escalables. Ya protocolos ar xi escalar linealmente ar 'na jar numerosas muestras ir nge ar nt'ot'e parámetros ar ultrasonido constantes.
Ya ultrasonidos sonda ko 'na jar ku̲t'a dedos ya ideales pa jar nt'ot'e 'bede ya muestra mäs t'olo. Ya ultrasonidos laboratorio Hielscher gi 'bu̲hu̲ da 'mui ko 'na'ño niveles nts'edi pa da tsa da 'ñets'i ar disruptor ultrasónico ideal pa ár nt'ot'e relacionada ko ar ADN.