Nt'ot'e plásmidos ir nge ya ultrasonidos
Ar ultrasonicación ge 'nar técnica fiable pa fragmentar ar ADN plasmídico. Ar amplitud, ar modo ar pulsación ne ar control ar mpat'i controlables ko ya precisión ya ya características mäs mahyoni 'nar ultrasonido pa fragmentación hingi dañina plásmidos. 'Nehe, njapu'befi ya ciertos agentes ayuda ma proteger kontra ar degradación plásmidos. Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe soluciones pa fragmentación controlada plásmidos a partir de viales Nthuts'i, ar sonicación simultánea numerosas ar muestras ne ar placas pocillos múltiples. Obtenga mäs ungumfädi dige ar éxito ar fragmentación plásmidos ultrasónicos.

Ar UIP400MTP Permite ultrasonicación controlada ko precisión placas pocillos múltiples. 'Na ya aplicaciones ar UIP400MTP ar fragmentación ar ADN plasmídico jar 'mui da fragmentos 'nar longitud específica.
Cizallamiento plásmidos ir nge ya ultrasonidos
Nu'bu̲ ya muestras ADN ar someten da ondas ya ultrasónicas, ya vibraciones generadas ya ultrasonidos crean cavitación acústica ja ar líquido da tseki wa 'wagi ya moléculas ADN mar hñets'i be̲xu molecular a través de ndu mecánicas. Ar sonicación ge ár nt'ot'e mäs utilizado pa ya experimentos ar cizallamiento masivo ADN, incluidas aplicaciones, komongu ar inmunoprecipitación cromatina (ChIP), pa dá nuna ya tamaños fragmentos t'olo ya absolutamente cruciales da uni 'na mextha resolución. (cf. Tseng et jar el., 2012)
Ar ADN plasmídico (ADNp) ge 'nar dets'e específica ADN, caracteriza ir nge ár dets'e anillo ne o 'mu̲i jar bacterias ne 'ra ya eucariotas.
Ar ADNp ar superenrollado ar dets'e deseada ADN plasmídico, ya da gi 'ñudi ya mpädi mäs xi resultados jar procesos ya posteriores, komongu ar secuenciación ne ar transfección automatizadas. Ar ultrasonicación ar adecuada pa fragmentar éxito ko ar ADNp, incluido ar ADNp superenrollado.
Thompson et jar ar. (2008) demostraron da sonicación plásmidos, nä'ä da mfädi da fragmenta ar ADN superenrollado, ge 'nar dets'e xi hño mejorar ya longitudes da ar secuencia phred20 asta punto nä'ä hingi 'bu̲hu̲ significativamente 'na'ño ar plantilla ar control Beckman Coulter wa ya plásmidos linealizados enzimáticamente.
- Controlable ko precisión
- Resultados reproducibles
- Ajustable ja ya longitudes ya fragmentos ADN objetivo
- Control mpat'i
- Escalable ma 'na tamaño muestra
Ya vectores plásmidos ndu
Ya plásmidos ar utilizan tso̲kwa menudo komongu ya bo̲jä nu'u̲ pa clonar, transferir ne manipular genes. Nu'bu̲ ya plásmidos ar utilizan experimentalmente pa nuya ngäts'i, ar denominan vectores. Fragmentos ADN wa genes ar xi insertar ja 'nar vector plásmido, creando ar llamado plásmido recombinante. Vectores ya plásmidos ar utilizan komongu vehículos pa da t'ot'e ar ADN recombinante 'nar célula huésped ne ge 'nar componente clave ar clonación molecular.
“Ya vectores hingi virales gi 'bu̲hu̲ komongu ampliamente estudiados ir nge ár tsa̲ njapu'befi ja ar terapia génica pa japi 'na'ño enfermedades complicadas. Ya vectores hingi virales protegen ar ADN plasmídico kontra ar degradación física, química ne enzimática ne entregan ar molécula ADN bí sitio ar objetivo. Ngu, ya liposomas catiónicos, ar quitosano ne ma'ra nanopartículas cargadas positivamente o̲t'e complejos ko ar ADN plasmídico a través de interacciones electrostáticas. Wat'i, ya complejos liposomas catiónicos yá ADN plasmídico mi o̲t'e hingi hembi da ya relativamente dätä (es decir, 300 — 400 nm) ne ar 'mui heterogénea, nä'ä mi dificulta ár njapu'befi aplicaciones farmacéuticas. Ya complejos dätä ne heterogéneos ADN yá liposomas, ADN plasmídico yá aerosoles ne ADN plasmídico yá péptidos xi reducir bí ma partículas mäs t'olo ne homogéneas ir nge ya ultrasonidos.” (Sarker et jar el., 2019)
'Nar ejemplo destacado njapu'befi ya vectores plásmidos ar CRISPR — Cas9. Ko ya CRISPR — Cas9 nu'bu̲ da nthe̲hu̲ 'ra bí administra ja ya células komongu 'nar Honto plásmido dätä wa varios plásmidos mäs t'olo da codifican 'nar secuencia objetivo, 'nar guía CRISPR ne ar Cas9.
Nt'ot'e ultrasónica nanopartículas ar PLGA cargadas ar ADN ir nge ya nanoprecipitación
Jo et jar ar. (2020) utilizaron ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) pa formar 'nar portador nanopartículas pa ar nts'ogi 'nar plásmido modelo CRISPR — Cas9 jar macrófagos primarios derivados ar médula ósea. Pa ar nanoprecipitación nanopartículas PLGA, ar utilizaron PLGA ko yoho Hmunts'i finales 'na'ño (Hmunts'i éster ne aminas) ko ar objetivo ke ya tapas ar amina cargadas positivamente aumenten dätä nt'ot'e encapsulación ne ar carga debido ja ya interacciones carga entre nuna ne ar columna vertebral cargada negativamente ar ar ADN. Ja 'nar tubo centrífugo cónico ar polipropileno 50 ar mL, ar disolvieron 100 mg Pluronic F127 jar 20 mL ar dehe desionizada esterilizada autoclave ir nge ya mezcla jar vórtice, seguida ar 30 ar min sonicación za̲tho ir nge 'nar nsaha ultrasónico ()ga CupHorn). Bí añadió 'nar barra xí agitadora magnética esterilizada jar autoclave ne ár njäts'i bí mezcló bí 600 ar RPM Nxoge 30 ar min Mente ar elaboraban 'ra ya soluciones. Ar utilizó he̲'mi laboratorio plástico en lugar de xito pa minimizar adsorción inespecífica ADN. Ya soluciones ar PLGA disueltas DMF (44,48 mg yá ml) ne TIPS pentaceno disuelto THF (0,667 mg yá ml) elaboraron ya hñe̲gi. Ar PLGA ar bí zogi inactivo jar DMF Nxoge 30 t'olo ora 'be̲tho da sonicado Nxoge 30 ar min. (ar Nthuts'i nkohi completo, pa ga ar Jo et jar el., 2020)
- Extracción de ADN
- Encapsulación ar ADN
- Dispersión ADN recubierto ar nanopartículas
- Entrega ADN plasmídico ya células
'Ba̲ts'i ar ADN plasmídico Nxoge ar sonicación
Ar ADN, incluidos ya plásmidos ne ya plásmidos superenrollados, ar altamente sensible 'na jar degradación. Ngatho ya nt'ot'e ar fragmentación da 'mui ya conocidos ja yá desventajas. Fragmentación ultrasónica ar ADN ge 'na ya nt'ot'e preferidos, ya da sonicación controlada combinación ko ya t'eni jar 'ba̲ts'i permite reducir ngi ya hebras ADN inducido ir nge ar cizallamiento ne ar pa.
'Nehe ar ajustes xí hñets'i'i amplitud, modo pulsación ne ar control ar mpat'i Nxoge ar cizallamiento ultrasónico ar ADN, njapu'befi ya ciertos agentes mostró 'nar ntsoni protector significativo kontra ar degradación ar ADN. Ngu, varios polímeros, péptidos ne lípidos protegen ar ADN plasmídico Nxoge ar ultrasonicación.

Nzäm'bu ar ADN plasmídico ne ya nanocomplejos ADN yá IL plásmidos hä esfuerzo cizallamiento ultrasónico ar investigó ir nge 'nar ensayo electroforesis jar gel ar agarosa. Tanto ar ADN plasmídico ngu ya nanocomplejos ADN plasmídico yá IL plásmidos ar sometieron ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge ya 'na'ño puntos tse̲t'i. Ar ADN plasmídico ar expuso ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30 ne bi 40 t'olo ora. Wat'i, ya nanocomplejos ADN yá IL ya ar plásmido bí expusieron ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ne ar 120 ya t'olo ora.
(estudio ne ya tsita: ©Sarker et jar el., 2019)
Sarker et jar ar. (2019) demostraron da nu'bu̲ ya nanoestructuras ADN plasmídico yá líquido iónico (pDNA yá IL) bí sometieron ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ne 120 min ne complejaron ko ar agente entrega genes catiónicos disponible comercialmente lipofectamina, porcentaje células fluorescentes positivas bí ar 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65% 65% ne 50%, respectivamente (ga ar ar gráfico da ku̲hu̲). Porcentaje células fluorescentes positivas bi hñuts'i nu'bu̲ ya nanoestructuras ar sometieron ja 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 10 ne 20 min, ne 'mefa disminuyó lentamente.

Influencia ar líquido iónico [Bmim] [PF6] jar entrega ADN plasmídico ya células COS7. Ya nanocomplejos ADN plasmídico yá IL (líquido iónico) bí sometieron 'nar esfuerzo cizallamiento ultrasónico Nxoge 'nar máximo 120 t'olo ora ne da complejaron ko ar 'be̲tho da̲ ya ya células COS7. Ya datos muestran ar 'bede promedio (%) ar células HeLa positivas pa GFP contadas 10 campos microscópicos 'na'ño ne ar experimento bí realizó xingu ya bes jar hñu ya pa 'na'ño. (Estudio ne gráfico: ©Sarker et jar el., 2019)

Ar ADN plasmídico to proteger bí añadiendo 'nar agente 'bu̲ 'be̲tho ar fragmentación ultrasónica: degradación inducida ya sonicación ar ADNp desnudo (A) ne ar ADNp formulado ko 1,5 mM CaCl2 ne 20% (v/v) ar t-butanol (B)
Ya muestras ar sonicaron ko 'nar sonda ar 20 ar W Nxoge 'nar máximo 120 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i, ngu indica jar xeni mäs xi ngu ya carril. Carril H bi nthe marcador ar Hiperescalera I ™️. Ya bandas plásmidos OC ne SC gi indicadas.
(estudio ne imágenes: ©Wu et jar el., 2009)
Nt'ot'e lisado ultrasónico
Nthuts'i nkohi lisis celular ultrasónica
Comience ko 'nar muestra enriquecida células da hyoki ir nge 'nar nt'ot'e separación celular (nt'udi, separación celular inmunomagnética, clasificación celular activada ya fluorescencia (FACS), centrifugación jar gradiente densidad, aislamiento celular ya inmunodensidad).
Ya muestras células tsa mostrar 'nar volumen tampón lisis ne da apropiado pa ar objetivo ar experimental ne ar ultrasonido ar klase sonda.
Ar prefieren ya tampones hipotónicos, ya da mejoran ar lisis celular ultrasónica. Ar mahyoni da ya aditivos ne ar concentración sal ar utilicen ar bí adecuada.
Seleccione ár dispositivo lisis ultrasónica: pa ar sonicación indirecta viales, recomiendan ar VialTweeter wa ar CupHorn. Pa ya placas pocillos múltiples, ar UIP400MTP ge ar ultrasonido ideal. Ne ar sonicación clásica ar klase sonda, 'nar homogeneizador ultrasónico Komo ar UP100H wa ar UP200Ht micropunta ya mäs ya adecuados.
Nthuts'i nkohi pa ar sonicación ar klase sonda: Introduzca ar sonda ultrasonicadora jar volumen muestra 'nar tubo ya microcentrífuga ne ya sonique Nxoge 'ra 10 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i. Dependiendo de ar muestra ADN, ar sonicación to japi ar 'nar wa yoho ya 'nandi mäs. Entrada energía ultrasónica requerida (Ws yá mL) bi jagu̲ju̲ viscosidad ar muestra ne ar klase ar ADN. Enfriamiento ir nge nsaha hielo ne ar modo pulsación ar ultrasonido ayudan jar nu'bu da ar muestra ar degrade térmicamente.
'Me̲fa ar lisis ultrasónica, ar muestra ar centrifuga da separar ya restos gránulos (da contienen células hingi lisadas, ar núcleos ne ar orgánulos hingi lisados)
Nu'bu̲ ar muestra hingi ar procesa ngut'a, ar tsa̲ da almacenar ja 'nar mpat'i adecuada da jwati ár viabilidad.
Ultrasonidos pa ar fragmentación ar ADN
Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe plataformas nthe jar ultrasonidos pa ar fragmentación ar ADN, ar ARN ne ar cromatina. Gi Bu̲i plataformas incluyen sondas ultrasónicas (sonotrodos), soluciones sonicación indirecta pa jar nt'ot'e simultánea muestras múltiples tubos wa placas varios pocillos (nt'udi, placas ar 96 pocillos, placas microtitulación), sonorreactores ne cuphornes ultrasónicos. Ga̲tho ya plataformas pa ar cizallamiento ar ADN gi impulsadas ya procesadores ultrasónicos mar hñets'i ar rendimiento ne ar frecuencia ajustada, ar xi controlar ko ya precisión ne ofrecen resultados reproducibles.
Procesadores ultrasónicos pa 'na ya 'bede ne tamaño muestra
Ko ya ultrasonidos multimuestra Hielscher VialTweeter (pa ga 10 tubos ar ensayo) ne UIP400MTP (da microplacas yá placas multipocillos), ar tsa̲ ga reducir hingi hembi da ar pa procesamiento muestras jamädi 'nar ultrasonicación intensa ne controlable ko ar precisión, da ar pa da obtiene jar Nthege ar tamaño ne ar rendimiento deseados ya fragmentos ADN. Fragmentación ultrasónica ar ADN xí da pasos ya nt'ot'e plásmidos 'bu̲hu̲ eficientes, fiables ne ar escalables. Ya protocolos ar xi escalar linealmente ar 'na jar ndunthe muestras ir nge ar nt'ot'e parámetros ar ultrasonido constantes.
Ya ultrasonidos sonda 'na jar ku̲t'a dedos ya ideales pa jar nt'ot'e muestras mäs t'olo. Ya ultrasonidos laboratorio Hielscher gi 'bu̲hu̲ da 'mui ko 'na'ño niveles nts'edi pa da tsa da 'ñets'i ar disruptor ultrasónico ideal pa ár nt'ot'e relacionada ko ar ADN.

Ar xe̲ni nt'ot'e ultrasónica muestras múltiples VialTweeter Permite sonicación simultánea asta 10 viales. Ko ar dispositivo pinza VialPress, ar xi presionar asta 4 tubos Nthuts'i jar xeni delantera pa 'nar sonicación intensa.
Control preciso ar proceso
Ya ajustes ar sonicación controlables ko ya precisión ya cruciales, ya da sonificación 'nar exhaustiva to destruir ar ADN, ar ARN ne ar cromatina, pe 'nar cizallamiento ultrasónico inadecuado xta lugar da fragmentos ya ADN ne ya cromatina xki largos. Ya ultrasonidos digitales Hielscher xi ajustar ar hingi hembi da bí parámetros ar sonicación precisos. Ya ajustes específicos sonicación 'nehe xi guardar ar komongu ajustes programados pa 'nar repetición ngut'a xkagentho ar nt'ot'e.
Ga̲tho ya sonicaciones bí protocolizan ar automáticamente ne ar almacenan komongu archivo CSV 'na jar tarheta SD incorporada. 'Me̲hna permite 'nar documentación precisa ya ensayos realizados ne permite da hingi hembi da hnu ya tiradas sonicación.
A través de ar control remoto ar navegador, nga̲tho ya ultrasonidos digitales xi 'ye̲ ar ne supervisar ar a través de 'na navegador estándar. Hingar mahyoni ar instalación software adicional, ya ke ar conexión LAN ge 'nar configuración plug — n — play xi sencilla.
Máxima facilidad njapu'befi Nxoge jar nt'ot'e ultrasónica ar ADN
Ga̲tho ya ultrasonidos Hielscher gi 'bu̲hu̲ diseñados pa proporcionar ultrasonidos mar hñets'i rendimiento, komongu ar xkagentho pa xi fáciles zu̲di ne ya 'ye̲. Ya ajustes gi 'bu̲hu̲ xi hño estructurados ja 'nar menú xí nzi, nä'ä ar tsa̲ da acceder hingi hembi da a través de 'nar pantalla táctil ya njät'i wa 'nar mando ya mbi ar navegador. Software inteligente ajustes programables ne registro automático datos garantiza 'ra ajustes ar sonicación óptimos pa da resultados fiables ne reproducibles. Interfaz menú, limpia ne hei ar zu̲di, bi pa̲ti ja ya ultrasonidos Hielscher jar dispositivos fáciles ar zu̲di ne eficientes.
Xtí tabla bí xta ar 'nar indicación ya mfeni ya procesamiento aproximada ar HMUNTS'UJE ultrasonidos laboratorio pa ar lisis ar celular ne ar fragmentación ar ADN:
Volumen lote | Gasto | Dispositivos recomendados |
---|---|---|
Placas pocillos múltiples | N/A | UIP400MTP |
viales, Baso ar precipitados pequeño | N/A | cupHorn ultrasónico |
Ga 10 ar viales | N/A | VialTweeter |
Ar 1 jar 500 ml | Ar 10 200 ml yá min | UP100H |
Ar 10 da 2000 ml | Ar 20 400 ml yá min | UP200Ht, UP400St |
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Bibliografía yá Referencias
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Datos da Bale ar penä ga pädi
¿Temu̲ ya ya plásmidos?
'Nar plásmido ge 'nar t'olo molécula circular ar ADN xí tx'u̲tho separada ar ADN ar cromosómico ne replica dets'e Ndäse̲. Ya plásmidos tso̲kwa menudo ar asocian ko genes da contribuyen ar supervivencia 'nar organismo ne imparten ventajas específicas, ngu, resistencia ja ya antibióticos. Ya plásmidos 'bu̲i mäs comúnmente komongu ya t'olo moléculas circulares ar ADN doble cadena jar ya bacterias; Wat'i, ya plásmidos ya 'nandi gi 'bu̲hu̲ 'bui jar arqueas ne ya eucariotas. Ya plásmidos ya bo̲jä nu'u̲ mahyoni biología molecular, genética, bioquímica ne ciencias ar nzaki. Conocidos komongu vectores jar ingeniería genética, ya plásmidos ar utilizan pa replicar xingu ya ciertos genes. Alteración dirigida 'nar vector bí denomina ar diseño vectorial.
Análisis GFP jar ár nthoni celular
Ar proteína xí fluorescente (GFP) ge 'nar marcador biológico versátil pa monitorear procesos fisiológicos, visualizar ar localización proteínas ne detectar jar hmä transgénica in vivo. Ár 'ñu láser 488 nm to excitar jar GFP ne detecta dets'e óptima bí 510 ar nm.

Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrasónicos mar hñets'i rendimiento ma partir ar laboratorio Pa tamaño industrial.