Lisis ultrasónica muestras Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster ar ampliamente utilizada jar laboratorios komongu organismo modelo. Ir pasos mfädi preanalítica komongu ar lisis, ar disrupción celular, ar extracción ar proteínas ne ar cizallamiento ar ADN ya muestras Drosophila melanogaster tsa da da t'ot'e xi hño frecuencia. Ya desmembradores ultrasónicos ya fiables ne ya eficientes ne xi utilizar ar pa ga OT'UJE ya 'na'ño tareas, komongu ar lisis, ar extracción proteínas wa ar fragmentación ar ADN ko ho̲ntho ajustar ya parámetros ar proceso ultrasónico. Ir homogeneizadores yá ultrasónicos ya bo̲jä nu'u̲ flexibles ko 'nar nt'ot'e ho 'bui ndunthe gama aplicaciones.

Lisis ultrasónica ne extracción proteínas

Ar lisis, ar solubilización celular, ar homogeneización ar tejidos ne ar extracción proteínas ya tareas típicas ya desmembradores ultrasónicos ja ya laboratorios biológicos. Desmembradores ya ultrasónicos ne ya disruptores celulares ya na adecuados pa homogeneizar tejidos animales, insectos (nt'udi, Drosophila melanogaster, c.ndunthe elegans) wa especímenes do̲ni. Ya aplicaciones posteriores ar ultrasonicación ya lisis suspensiones celulares ne pellets, nja'bu Komo ar extracción proteínas intracelulares.
Ar lisis ar ultrasónica ne ar extracción proteínas ya procesos altamente fiables ne reproducibles, nä'ä xi ga OT'UJE ar dige ar base protocolos establecidos. Dado da intensidad ar proceso ultrasónico to ajustar ar exactamente a través de parámetros sonicación komongu ar amplitud, ar modo ciclo yá pulso, ar mpat'i ne volumen ar muestra ya protocolos 'nar pa probados xi 'yo̲t'e ar ko xkagentho ar nt'uni una y otra xähmä.

Fragmentación ultrasónica ADN ne ARN

'Mefa xta lisis ar celular ne ar extracción proteínas, ne bi thogi hne ngatho requerido ar nt'ot'e muestras ge ar cizallamiento ne ar fragmentación ar ADN, ar ARN ne ar cromatina, ngu, 'be̲tho ar inmunoprecipitación cromatina (ChIP). Ar fragmentación ar ADN ne ar ARN ar tsa̲ da dähä ar bí confiable rompiendo ya enlaces covalentes da mantienen unido ADN ir nge ya ndu nzafi físicas. Ir nge ar cizallamiento físico, komongu ar sonicación, ar ndui ar rompen ya hebras ADN, xu̲ki ar ADN bí fragmenta jar trozos mäs t'olo.
Fragmentación ultrasónica ar ADN ar fiable ne xi hño pa da cizallar ar ADN asta 'nar longitud específica, ngu, 500 pb (pares ar bases). Ya ndu'mi ventajas fragmentación ultrasónica ar ADN incluyen ar control preciso ya parámetros ne ar intensidad ar proceso ultrasónico. Ya parámetros ar proceso ultrasónico xi ajustar ar ajustando ko precisión ar intensidad ar sonicación, ya ciclos ne ya pa. 'Me̲hna permite da t'ot'e ya tamaños ar ADN deseados ne ar longitud ADN objetivo to da producir ne reproducir ar ar nt'ot'e fiable. Cizallamiento ultrasónico ar ADN 'nehe ar ideal pa da t'ot'e ya fragmentos ADN mar hñets'i be̲xu molecular.

Protocolos pa lisis ultrasónica Drosophila melanogaster

Tso̲kwa continuación to tingigi mbo varios protocolos pa lisis asistida ya ultrasonidos, ar extracción ar proteínas ne ar fragmentación ar ADN wa ar cromatina muestras Drosophila.

Lisis ultrasónica pa ar ensayo inmunoprecipitación reticulante (CLIP)

Ensayo CLIP ar realizó nu'u̲ bí informó ma 'met'o mi ko ra nyokwi. Aproximadamente 20 mg ar ovarios hembras klase salvaje ar 0 da 1 pa bätsitho ma reticulados ko UV (3 × 2000 μJ yá cm2), homogeneizados hielo jar 1 mL tampón RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% ar Triton X — 100, 250 mM sacarosa, 1 mM DTT, 1× inhibidores Nxoge ar proteasa xi hño ar EDTA, 1 mM PMSF) suplementados ko 300 wa ya RNAseOUT ne ya ot'e jar hielo Nxoge 30 ar min. Ar homogeneizado ar sonicó jar hielo, da ar 80% ar nts'edi, ku̲t'a ya 'nandi ja ze̲di 20 s ko 'nar ntsa̲ya̲ 60 s entre medias utilizando ar procesador ultrasónico Hielscher UP100H (100 W, 30 ar kHz) y centrifugada (16000 × g durante 5 min a 4°C). El extracto soluble se aclaró previamente con 20 μl de dynabeads de proteína-G durante 20 min a 4 °C. 'Me̲fa ar extracción muestras pa inmunotransferencia ne ar cuantificación ar entrada ARN (1%), HP1 se inmunoprecipitó con el anticuerpo anti-HP1 9A9 a partir de 450 μl de extracto preaclarado mediante incubación durante 4 h con 50 μl de dinaperlas de proteína-G. Ya inmunoprecipitados bí lavaron ar 4 bes ko RCB. Para eluir los ARN inmunoprecipitados, las perlas granuladas se hirvieron en 100 μL de agua tratada con DEPC UltraPure durante 5 min. Se añadieron 900 μL de reactivo Qiazol al sobrenadante recuperado para la preparación del ARN. Ar ARN ar purificado bí utilizó komongu molde pa sintetizar ADNc utilizando oligo dT, hexámeros aleatorios ne transcriptasa inversa SuperScript III ir nge ar Nthuts'i nkohi ar fabricante.
(Cassale et jar el. 2019)

Lisis ultrasónica pa ensayo inmunoprecipitación cromatina

Inmunoprecipitación cromatina ar realizó nä'ä mä jar nt'ot'e descrito ya Menet ko ya t'olo nyokwi. Aproximadamente 20 mg ar ovarios hembras klase salvaje ar 0 da 1 pa bätsitho bí homogeneizaron jar 1 mL tampón NEB (10 mM ar HEPES — Na da pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA — Na da pH 8, 0.5 mM EDTA — Na da pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP — 40, 0.5 mM espermidina, 0.15 mM espermina, 1× inhibidores Nxoge ar proteasa xi hño ar EDTA) ko 'nar homogeneizador yá dispersor ya inmersión 1 min (ma 3000 rpm). Ar homogeneizado ar transfirió ja 'nar Baso preenfriado ne da aplicaron ar 15 ma golpes Nxoge ko 'nar mortero apretado. Tso̲kwa continuación, ya núcleos libres ar centrifugaron a 6000xg durante 10 min a 4°C. Ya gránulos da contenían núcleos resuspendieron jar 1 mL ar NEB ne ar centrifugaron da 20000 × g Nxoge 20 min jar gradiente sacarosa (0,65 mL sacarosa 1,6 M jar NEB, 0,35 mL sacarosa 0,8 M jar NEB). Ar pellet ar resuspendió jar 1 mL NEB ne formaldehído asta 'nar concentración final 1%. Ya núcleos reticularon Nxoge 10 min jar mpat'i ambiente ne enfriaron ir nge ar adición 1 yá 10 vol glicina 1.375 M. Ya núcleos da recolectaron ya centrifugación 6000 × g Nxoge 5 ar min. Ya núcleos ar lavaron yoho ya 'nandi ja 1 mL NEB ne resuspendieron jar 1 mL tampón lisis (15 ma mM ar HEPES — Na da pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM ar EDTA bí pH ar 8, 1% ar Triton X — 100, 0,5 mM DTT, 0,1% ar Na desoxicolato, 0,1% ar SDS, 0,5% ar N — lauroylsarcosina ne 1× inhibidores Nxoge ar proteasa xi hño ar EDTA). Ya núcleos ar sonicaron utilizando 'nar procesador ultrasónico Hielscher UP100H (100 W, 30 ar kHz) 'rato ya 'nandi ja 20 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i ne 1 ya t'olo ora dige ar hielo. Los núcleos sonicados se centrifugaron a 13000 × g durante 4 min a 4°C. Kasu̲ nga̲tho ar cromatina sonicada mi 'nar longitud 500 ma 1000 pares ar bases (pb). Para cada inmunoprecipitación, se incubaron 15 μg de cromatina en presencia de 10 μg de anticuerpo monoclonal HP1 9A9 (3 h a 4 °C en una rueda giratoria). Tso̲kwa continuación, ar añadieron 50 μl de proteína G ne ar continuó la incubación durante la noche a 4 °c. Ya sobrenadantes ar desecharon ne ya muestras da lavaron ya yoho ya 'nandi ja ya tampón lisis (kadu̲ 'nar lavado 15 min a 4 °C) ne dos bes jar tampón DI (1 mM de EDTA, 10 mM de TrisHCl a pH 8). Ar cromatina ar eluyó ja ya perlas yoho ya pasos; 'naha en 100 μl de tampón Eluition 1 (10 mM de EDTA, 1% de SDS, 50 mM de TrisHCl a pH 8) a 65 °C durante 15 min, seguido de centrifugación y recuperación del sobrenadante. Ar he̲'mi de ya perlas bí mengi bí extraer jar 100 μl de TE + 0,67% de SDS. El eluido combinado (200 μl) se incubó durante la noche a 65 °C para revertir los enlaces cruzados y se trató con 50 μg/ml de RNasa durante 15 min a 65 °C y con 500 μg/ml de proteinasa K durante 3 h a 65 °C. Ya muestras extrajeron ko ya fenol-cloroformo ne precipitaron ko ya etanol. El ADN se resuspendió en 25 μl de agua. Pa maximizar ya análisis moleculares ko ADN inmunoprecipitado, ya genes candidatos ar amplificaron jar pares a través de 'nar nthuts'i nkohi optimizado ar PCR dúplex ir nge njapu'befi ya yoho ya conjuntos 'na'ño cebadores ko temperaturas ar fusión similares jar 'na sola reacción.
(Casale et jar el. 2019)
 

Ya disruptores celulares ar ultrasónicos ar mar hñets'i rendimiento pa muestras biológicas

Hielscher Ultrasonics ge ár socio ko ndunthe ya mfeni jar nä'ä ir nge ya ultrasonidos mar hñets'i rendimiento pa ar disrupción celular, ar lisis, ar extracción proteínas, ar fragmentación ar ADN, ar ARN ne ar cromatina, nja'bu komongu pa ma 'ra ya pasos mfädi ar muestras preanalíticas. Ya ar ofrecer 'nar nt'ot'e ho 'bui ndunthe gama homogeneizadores ultrasónicos laboratorio ne unidades nt'ot'e muestras, Hielscher pe̲ts'i ar dispositivo ultrasónico ideal pa ár nt'ot'e ne requisitos biológicos.
Ultrasonidos clásicos ar klase sonda ko micropunta Komo ar UP200St (200 w; ga tsita ar izquierda) wa 'na ya unidades nt'ot'e muestras ya ultrasonidos VialTweeter o UP200St_TD_CupHorn VialHolder ko ya ya modelos favoritos ja ya laboratorios nthoni ne ya análisis. Ar sonda ultrasónica clásica ar ideal, nu'bu̲ ar preparan menos muestras da tsa da lisadas, extraídas wa fragmentadas. Ya unidades nt'ot'e muestras VialTweeter ne UP200St_TD_CupHorn permiten sonicación simultánea asta 10 wa 5 viales, respectivamente.
Nu'bu̲ ar da procesar 'nar 'bede elevado ya muestras (nt'udi, placas ar 96 ar pocillos, placas ar microtitulación, etcétera), ar UIP400MTP ar configuración ar sonicación ideal. Ar UIP400MTP funciona komongu 'nar cucharno mäs dätä, xi lleno ar dehe ne pe̲ts'i xingu ya espacio pa contener placas micropocillos. Alimentado ir nge 'nar potente procesador ultrasónico ar 400 ar vatios, ar UIP400MTP ofrece 'nar sonicación xi uniforme ne intensa placas pocillos múltiples pa interrumpir células, lisar muestras, solubilizar gránulos, extraer proteínas wa tu̲ki ar ADN.

Control preciso a través de software inteligente

Ga̲tho ya soluciones sonicación Hielscher a partir de 200 vatios gi equipadas ko 'nar pantalla táctil 'bede njät'i ne 'nar software inteligente. A través de ar Nthuts'i nkohi ar datos inteligente, nga̲tho ya parámetros ar proceso ultrasónico ar guardan automáticamente nu'u̲ archivo CSV 'na jar tarheta SD incorporada ngut'ä ngut'ä nu'u̲ bí enciende ar ultrasonido. 'Me̲hna thogi ke ár nthoni ne ar protocolizado 'bu̲hu̲ xingu mäs convenientes. 'Me̲fa ya pruebas sonicación wa jar nt'ot'e ar muestra, pe simplemente da hnu ya parámetros sonicación nu'bu̲ nt'eni ja ya sonicación ne ya comparar.
A través de menú intuitivo, ar xi preajustar numerosos parámetros 'bu̲ 'be̲tho ar sonicación: nt'udi, pa controlar ar mpat'i jar muestra ne nu'bu ár degradación ar térmica, ar to da t'ot'e 'nar límite mäs xi ngu ar mpat'i ar muestra. 'Nar sensor mpat'i enchufable, da ku̲hu̲ ko ar xe̲ni ultrasonidos, proporciona jar procesador ultrasonidos ungumfädi dige ar mpat'i real sonicación. Nu'bu̲ bí alcanza ar límite mäs xi ngu mpat'i, ar dispositivo ultrasónico ar detiene Asta ke bí alcanza ar límite inferior ar ∆ T establecido ne pengi sonar automáticamente.
Nu'bu̲ bí requiere 'nar sonicación ko 'nar entrada energía específica, pe preajustar ar energía ultrasónica final ar nt'eni ja ya sonicación. Hä, ar pulsación ar ultrasónica ne ar modo ciclo 'nehe ar xi ajustar individualmente.
Pa reutilizar yá parámetros ya sonicación mäs exitosos, pe guardar varios modos sonicación (nt'udi, pa ar sonicación, intensidad, modo ar ciclo, etcétera) komongu modos preestablecidos, ja modo da tsa da volver ya da du'mi bí hei ne rápidamente.
Pa ar dätä comodidad operativa, ga̲tho ya unidades ultrasónicas digitales xi 'ye̲ bí a través de ar mando mbi jar 'na navegador hne ngatho (nt'udi, InternetExplorer, Safari, Chrome, etcétera). Ar conexión LAN ge 'nar sencilla configuración plug — n — play ne hingi requiere ar instalación software adicional.
Hielscher jar sabemos da éxito ar sonicación muestras biológicas requiere precisión ne ar repetibilidad. Ir di diseñado HMUNTS'UJE ultrasonidos komongu dispositivos inteligentes ko ga̲tho ya características da permiten 'nar nt'ot'e muestras nt'ot'e xi hño, ar fiable, ya reproducible ne ya cómoda.

Xtí tabla bí xta 'nar indicación ya mfeni ya procesamiento aproximada ar HMUNTS'UJE sistemas ultrasónicos, micropuntas ultrasónicas ne ya homogeneizadores ultrasónicos ar clásicos asta ultrasonidos MultiSample pa jar nt'ot'e cómoda ne fiable ndezu̲ ar numerosas muestras: