Drosophila melanogaster ar ampliamente utilizado jar laboratorios komongu organismo modelo. Ir ar tsa da t'ot'e xi hño frecuencia ya t'eni jar nt'ot'e preanálisis komongu ar lisis, alteración celular, extracción proteínas ne cizallamiento ADN muestras Drosophila melanogaster. Ya desmembradores ultrasónicos ya fiables ne ya eficientes ne bí xi utilizar pa ga OT'UJE 'na'ño tareas komongu ar lisis, extracción proteínas wa fragmentación ar ADN johya ajustando únicamente ya parámetros proceso ultrasónico. Ir homogeneizadores yá ultrasónicos ya bo̲jä nu'u̲ flexibles ko 'nar nt'ot'e ho 'bui ndunthe gama aplicaciones.

Lysis Ultrasónica ne Extracción Proteínas

Ar lísis, ar solubilización celular, ar homogeneización ar tejidos ne ar extracción proteínas ya tareas típicas pa ya desmembradores ultrasónicos jar laboratorios biológicos. Dismembradores ya ultrasónicos ne ya disruptores celulares ya adecuados pa homogeneizar tejidos animales, insectos (nt'udi, Drosophila melanogaster, c.ndunthe elegans) wa especímenes do̲ni. Ya aplicaciones posteriores ultrasonidos ya lysis suspensiones celulares ne pellets, nja'bu Komo ar extracción proteínas intracelulares.
Ar lysis ar ultrasónica ne ar extracción proteínas ya procesos altamente fiables ne reproducibles, nä'ä xi ga OT'UJE ar dige ar base protocolos establecidos. Dado da intensidad ar proceso ultrasónico ar tsa̲ da ajustar exactamente a través de parámetros sonicación komongu ar amplitud, ciclo yá modo ya pulso, mpat'i ne volumen muestra, mbi ya protocolos probados ar xi yokwi ko xkagentho ar nt'uni una y otra xähmä.

Fragmentación ADN ultrasónico ne ARN

'Mefa xta lisis ar celular ne ar extracción proteínas, ne bi thogi hne ngatho requerido ar nt'ot'e muestras ge ar cizallamiento ne ar fragmentación ar ADN, arnes ne cromatina, ngu, 'be̲tho ar inmunoprecipitación cromatina (ChIP). Ar fragmentación ar ADN ne ar ARN ar tsa̲ da dähä ar nt'ot'e fiable rompiendo ya lazos covalentes da mantienen unido ar ADN ja ya ndu nzafi físicas. Usando cizallamiento físico komongu ar sonicación, ar ndui ya hebras ADN ar rompen, xu̲ki ar ADN bí fragmenta jar trozos mäs t'olo.
Ar fragmentación ar ADN ultrasónico ar fiable ne ya nt'ot'e xi hño ja ar cizallamiento ADN ja 'nar longitud específica, ngu, 500bp (pares base). Ya ndu'mi ventajas ar fragmentación ar ADN ultrasónico incluyen ar control preciso ya parámetros ar proceso ar ultrasónico ne ar intensidad. Ya parámetros ar proceso ultrasónico ar xi ajustar ajustando ar intensidad ar sonicación, ya ciclos ne ar pa precisión. 'Me̲hna permite da t'ot'e ya tamaños ar ADN deseados ne ar longitud ar ADN dirigida ar tsa̲ da producir ne reproducir ya nt'ot'e fiable. Cizallamiento ultrasónico ar ADN 'nehe ar ideal pa da t'ot'e ya fragmentos ADN mar hñets'i be̲xu molecular.

Protocolos pa lísis ultrasónica Drosophila melanogaster

Tso̲kwa continuación to tingigi mbo varios protocolos pa lysis asistida ya ultrasonidos, extracción proteínas, ne ar fragmentación ADN wa cromatina ya muestras Drosophila.

Lysis Ultrasónica pa El Ensayo ar Inmunoprecipitación ar Reticulación (CLIP)

Ensayo CLIP ar realizó nu'u̲ bí informó ma 'met'o mi ko ra nyokwi. Aproximadamente 20 mg ar ovarios hembras klase salvaje ar 0 da 1 pa bätsitho ma reticulados UV (3 × 2000 μJ yá cm2), homogeneizados jar hielo jar tampón RCB ar 1 ml (50 mM HEPES pH 7.4,) 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Tritón X — 100, 250 mM ar sacarosa, 1 mM TDT, 1× Inhibidores Nxoge ar proteasa hinda EDTA, 1 mM PMSF) complementado ko 300 wa ya RNAseOUT ne ya colocado jar hielo Nxoge 30 t'olo ora. Ar homogeneizado bí sonicado jar hielo, ma ar 80% ar nts'edi, ku̲t'a ya 'nandi ja ze̲di 20 s ko 'nar ntsa̲ya̲ 60 s ja nt'uni usando ar Procesador Ultrasónico Hielscher UP100H (100 W, 30 ar kHz) ne centrifugado (16000 × g Nxoge 5 min ma 4oC). Ar extracto ar soluble bí preclearizó ko ar 20 ar l dinar — G ar proteína-G Nxoge 20 min da 4oC. 'Me̲fa ar eliminación muestras pa inmunoblotting ne ar cuantificación ar entrada ARN (1%), HP1 bí inmunoprecipitado ko anticuerpos anti — HP1 9A9 a partir de 450 l extracto precleared ya incubación Nxoge 4 h ko 50 l proteína-G dinesas. Ya inmunoprecipitados bí lavaron ar 4 bes ko RCB. Pa eluir ya ARN inmunoprecipitados, ya perlas peletadas ar hervieron jar 100 l ar dehe tratada ko DEPC UltraPure Nxoge 5 ar min. 900 l reactivo ar Qiazol bí añadió bí sobrenadante recuperado pa jar nt'ot'e ARN. Ar ARN ar purificado bí utilizó nu'u̲ plantilla pa sintetizar cDNA utilizando oligo dT, hexámeros aleatorios ne SuperScript rever ar transcriptase III nä'ä mä jar Nthuts'i nkohi ar fabricante.
(Cassale et jar ar. 2019)

Lysis Ultrasónica pa Ensayo ar Inmunoprecipitación ar Cromatina

Ar inmunoprecipitación ar cromatina bí realizó ir nge ar nt'ot'e descrito ya Menet ko nyokwi menores. Aproximadamente 20 mg ar ovarios hembras klase salvaje ar 0 da 1 pa bätsitho ma homogeneizados jar 1 mL tampón NEB (10 mM HEPES — Na da pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA — Na da pH 8, 0.5 mM EDTA — Na da pH 8, 1 mM TDT, 0.5% NP — 40, 0.5 mM Espermidina, 0.15 mM Espermatozoides, 1× Inhibidores Nxoge ar Proteasa xi hño ar EDTA) ko 'nar homogeneizador yá dispersor ya inmersión 1 min (ma 3000 rpm). Ar homogeneizado ar transfirió ja 'nar dounce ar vidrio pre-enfriada ne da aplicaron ar 15 ma golpes Nxoge ko 'nar mortero apretado. Los núcleos libres se centrifugaron a 6000xg durante 10 min a 4°C. Ya gránulos da contenían núcleos resuspendieron jar 1 ml ar NEB ne ar centrifugaron da 20000 × g Nxoge 20 min jar gradiente sacarosa (0,65 ml ar sacarosa 1,6 M jar NEB, 0,35 ml sacarosa 0,8 M jar NEB). Ar pellet ar resuspendió jar 1 ml NEB ne formaldehído 'nar concentración final 1%. Ya núcleos reticularon Nxoge 10 min jar mpat'i ambiente ne ar apagaron agregando 1 yá 10 vol glicina 1.375 M. Ya núcleos da recogieron ya centrifugación 6000 × g Nxoge 5 ar min. Ya núcleos ar lavaron yoho ya 'nandi ja 1 mL NEB ne resuspendieron jar 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES — Na da pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA ma pH 8, 1% Triton X — 100, 0,5 mM TDT, 0,1% Na Desoxicolato, 0,1% SDS, 0,5% N — lauroilsarcosina ne 1× Inhibidores Nxoge ar proteasa xi hño ar EDTA). Ya núcleos ar sonicaron utilizando 'nar procesador ultrasónico Hielscher UP100H (100 W, 30 ar kHz) 'rato ya 'nandi ja 20 s encendido ne 1 min jar hielo. Ya núcleos sonicados ar centrifugaron da 13000 × g Nxoge 4 min da 4oC. Kasu̲ nga̲tho ar cromatina sonicada bí 500 bí 1000 pares ar bases (bp) ar longitud. Pa kadu̲ 'nar inmunoprecipitación, bí incubaron ar 15 ma g cromatina jar 'bu̲i Kwä 10 g anticuerpo monoclonal HP1 9A9 (3 h da 4oC ja 'nar rueda giratoria). Ne gem'bu̲ bí ar añadieron 50 l proteína dinabeads G ne bí continuó ar incubación Nxoge nxui jar 4oC. Ya sobrenadantes ar desecharon ne ya muestras da lavaron ya yoho ya 'nandi ja ya Lysis Buffer (kadu̲ 'nar lavado 15 min ma 4oC) ne yoho ya 'nandi ja DI Buffer (EDTA ar 1 mM, 10 mM TrisHCl ma pH 8). Ar cromatina ar eluía ja ya cuentas yoho ya pasos; Ar ndu̲i jar 100 l tampón elución 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl ma pH 8) jar 65oC Nxoge 15 ma min, seguido ya centrifugación ne ya recuperación ar sobrenadante. Ar he̲'mi ya perlas ar xi vuelto jar extraer 100 l DI + 0,67% SDS. Ar eluido combinado (200 l) bí incuba Nxoge ar xui 65oC da invertir ya enlaces cruzados ne bí bí za̲pi bí hñut'u̲wi ko RNaseA Nxoge 15oG yá ml Nxoge 15 min jar 65oC ne 500 g yá ml ya Proteinasa ë Nxoge 3 h jar 65oC. Ya muestras da extrajeron ya fenol-cloroformo ne ar precipitó etanol. Ar ADN ar resuspendió jar 25 l ar dehe. Pa maximizar ya análisis moleculares ko ADN inmunoprecipitado, ya genes candidatos ar amplificaron jar pares a través de 'nar nthuts'i nkohi dúplex — PCR optimizado ir nge njapu'befi ya yoho ya conjuntos 'na'ño imprimaciones ko temperaturas ar fusión similares jar 'na sola reacción.
(Casale et jar ar. 2019)
 

Ya disruptores celulares ar ultrasónicos ar mar hñets'i rendimiento pa muestras biológicas

Hielscher Ultrasonidos ge ár socio ko mfeni Nxoge xingu ya ora nu'bu̲ t'o̲t'e ultrasonicadores mar hñets'i rendimiento pa ar interrupción celular, lelisis, extracción ar proteínas, ADN, ARN ne fragmentación cromatina, nja'bu ngu ya pasos mfädi ar muestras previas. Hielscher ofrece 'nar cartera nxo̲ge homogeneizadores ar laboratorio ultrasónicos ne unidades nt'ot'e muestras, ne pe̲ts'i ar dispositivo ultrasónico ideal pa ár nt'ot'e ar biológica ne ar requisitos.
Ultrasonicador clásico ar klase sonda ko micro-punta Komo ar UP200St (200W; ga tsita ar izquierda) wa 'na ya unidades nt'ot'e muestras ultrasónicas VialTweeter o UP200St_TD_CupHorn VialHolder ko ya modelos favoritos jar laboratorios ya nthoni ne ya análisis. Ar sonda ultrasónica clásica ar ideal, nu'bu̲ ar preparan menos muestras tsa da asanadas, extraídas wa fragmentadas. Ya unidades nt'ot'e muestras VialTweeter UP200St_TD_CupHorn permiten sonicación simultánea asta 10 wa 5 viales, respectivamente.
Nu'bu̲ ar tsa procesar 'bede ar muestras ar dätä (nt'udi, placas ar 96 ar me̲he̲, placas ar microtíter, etc.), ar UIP400MTP ar configuración ar sonicación ideal. Ar UIP400MTP funciona komongu 'nar ndäni copa mäs dätä, xi lleno ar dehe ne pe̲ts'i xingu ya espacio pa contener placas micro-pozo. Alimentado ir nge 'nar potente procesador ultrasónico ar 400 ar vatios, ar UIP400MTP ofrece 'nar sonicación xi uniforme ne intensa placas multi-pozo jar 'mui interrumpir ya células, muestras lese, solubilizar pellets, extraer proteínas wa ADN cizallamiento.

Control preciso a través de Smart Software

Ga̲tho ya soluciones sonicación Hielscher ar 200 vatios ma'bu̲ gi equipadas ko 'nar pantalla táctil 'bede njät'i ne 'nar software inteligente. A través de ya datos inteligentes protocolling ga̲tho ya parámetros ar proceso ultrasónico ar guardan automáticamente komongu archivo CSV 'na jar tarheta SD incorporada ngut'ä ngut'ä Komo ar gi du̲i ar ultrasonicador. 'Me̲hna thogi ke ár nthoni ne ar Nthuts'i nkohi 'bu̲hu̲ xingu mäs convenientes. 'Me̲fa ya ensayos sonicación wa jar nt'ot'e ar muestra, simplemente to da hnu ya parámetros sonicación ya sonicación ne ya comparar.
A través de menú intuitivo, numerosos ar parámetros ar xi preajustar 'bu̲ 'be̲tho ar sonicación: nt'udi, pa controlar ar mpat'i jar muestra ne nu'bu ár degradación ar térmica, ar to da t'ot'e 'nar límite mäs xi ngu mpat'i ar muestra. 'Nar sensor mpat'i enchufable, da ku̲hu̲ ko ar ar xe̲ni ultrasónica, xta ja ar procesador ultrasónico retroalimentación dige ar mpat'i real ar sonicación. Nu'bu̲ bí alcanza ar límite mpat'i mäs xi ngu, ar dispositivo ultrasónico ar detiene Asta ke bí alcanza ar límite inferior conjunto ∆T ne comienza ma sonicar automáticamente ar nuevo.
Nu'bu̲ ar requiere sonicación ko 'nar entrada energía específica, pe preestablecer ar energía ultrasónica final ar nt'eni ja ya sonicación. Hä, ar pulsación ar ultrasónica ne ar modo ciclo 'nehe ar xi configurar individualmente.
Pa volver da utilizar ya parámetros ar sonicación xí exitosos, pe guardar varios modos sonicación (nt'udi, pa ar sonicación, intensidad, modo ar ciclo, etc.) komongu modos predefinidos, pa ndi tsa da da fáciles ne rápidamente iniciados ar 'ra'yo.
'Nar dätä comodidad operativa, pa ga̲tho ya unidades ultrasónicas digitales ar xi operar a través de ar control remoto ar navegador 'na navegador hne ngatho (nt'udi, InternetExplorer, Safari, Chrome, etc.). Ar conexión LAN ge 'nar configuración simple plug — n — play ne hingi requiere instalación software adicional.
Hielscher jar sabemos ne ar sonicación exitosa muestras biológicas requiere precisión ne ar repetibilidad. Ir diseñamos HMUNTS'UJE ultrasonicadores komongu dispositivos inteligentes ko ga̲tho ya características da permiten 'nar nt'ot'e muestras nt'ot'e xi hño, ar confiable, ya reproducible ne ya mahyoni.

Xtí tabla bí xta ya 'nar indicación ya mfeni ya procesamiento aproximada ar HMUNTS'UJE sistemas ultrasónicos, micro-puntas ultrasónicas ne ya homogeneizadores ultrasónicos ar clásicos asta ultrasonicadores MultiSample pa jar nt'ot'e mahyoni ne confiable ndezu̲ ar numerosas muestras: