Lisis celular células BL21 ya ultrasonidos
Ya células BL21 ge 'nar cepa ar E. coli nä'ä da gi japu̲'be̲fi ampliamente jar laboratorios nthoni, biotecnología ne producción industrial nu'bya ár mfeni pa xingu ya proteínas mextha dätä nt'ot'e. Ar disrupción celular ultrasónica, ar lisis ne ar extracción proteínas ge ár nt'ot'e hne ngatho pa aislar ne recoger ya proteínas objetivo ar interior celular ya células BL21. Ar ultrasonicación altera ar célula ya completo ne libera ga̲tho ya proteínas atrapadas, o̲t'e ke ar 100% ar proteína ar ntsuni disponible.
Células BL21 pa ar hmä proteínas
Ar célula BL21 ge 'nar cepa bacteriana ar E. coli químicamente competente adecuada pa ar transformación ne ar hmä proteínas mar hñets'i za̲ ár nthe̲ utilizando 'nar ko inducción ARN polimerasa T7 — IPTG. Ya células BL21 permiten jar hmä proteica mextha ya dätä nt'ot'e ar 'na gen nu'u jár control 'nar promotor T7. Ar cepa ar E. coli BL21 (DE3) ge 'nar cepa producción ar proteínas basada ARN polimerasa T7 combinada ko ya vectores ya hmä basados promotores T7 ne da t'uni ampliamente jar laboratorios ne industria pa producir proteínas recombinantes. Jar BL21 (DE3), ar hmä ar gen da codifica ar proteína recombinante ar transcrita ir nge ar ARN polimerasa T7 codificada cromosómicamente (T7 RNAP), da transcribe hñäto ya 'nandi mäs rápido da ARNP convencional ar E. coli. 'Me̲hna thogi ne cepa BL21 (DE3) da altamente nt'ot'e xi hño ne dá bi pa̲ti jar 'na ya sistemas celulares ya hmä proteínas preferidos.
Nthuts'i nkohi pa ar lisis ar ultrasónica ne ar extracción proteínas células BL21
Lisis celular ya células BL21 ar realiza principalmente ir nge ya ultrasonidos jar combinación ko lauroil sarcosinato sodio ('nehe conocido komongu sarkosyl) komongu tampón lisis. Ya ventajas ar disrupción celular ultrasónica ne ar extracción proteínas radican ar fiabilidad, ar reproducibilidad ne ar funcionamiento sencillo, pädi xi hño ne ya rápido ya ultrasonidos. Ar Xtí nthuts'i nkohi proporciona 'nar 'mui paso a paso pa ar lisis celular ultrasónica BL21:
- Pa da hñäki ya proteínas chaperonas, ya gránulos bacterianos BL21 ar resuspendieron jar 50 ml tampón Tris — EDTA sódico (STE) helado (xi t'o̲t'e ya 10 mM Tris — HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl suplementado ko 100 mM PMSF).
- Ar añaden 500 ul lisozima (10 mg yá ml) ne ya células ar incuban jar hielo Nxoge 15 ma min.
- Tso̲kwa continuación, ar añaden 500 ul TDT ne 7 ml sarkosyl (10% (p/v) xi t'o̲t'e ya tampón STE).
- Ar esencial da zeti ga̲tho ya tampones ar purificación helados ne da zeti ya muestras jar hielo nga̲tho ar pa. Ga̲tho ya pasos purificación tsa da da t'ot'e ja ar cámara frigorífica nu'bu̲ xähmä.
- Pa ar lisis ar ultrasónica ne ar extracción proteínas, ya muestras ar sonican jar ar Ultrasonido VialTweeter MultiSample Nxoge 4 x 30 ya 'na̲te ya mfe̲ts'i ja ar 100% ar amplitud ko 'nar intervalo 2 t'olo ora ja ya sonicación. Alternativamente, 'nar homogeneizador ultrasónico ar klase sonda ko ar micropunta, hne. ej., UP200Ht ko S26d2 (3 x 30 ar seg, 2 min. pausa ja ya ciclos ultrasónicos, 80% ar amplitud).
- Para los siguientes pasos de purificación, las muestras deben mantener_se en hielo o, alternativamente, almacenar_se a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
Lisis ultrasónica jár control ar mpat'i presión
Ar control preciso ne fiable ar mpat'i ar crucial nu'bu̲ ar manipulan muestras biológicas. Altas ya temperaturas inician ar degradación ar proteínas inducida térmicamente ja ya muestras.
Ga̲tho ya técnicas mecánicas nt'ot'e muestras, komongu ar sonicación genera pa. Wat'i, ar mpat'i ya muestras ar tsa̲ da controlar xi hño nu'bu̲ ar gi japu̲'be̲fi ar VialTweeter. Bí presentamos ndunthe ya opciones pa monitorizar ne controlar ar mpat'i yá muestras Mente ya gi hoki ar VialTweeter ne ar VialPress pa ár análisis.
- Monitorización ar mpat'i ar muestra: ar procesador ultrasónico UP200St, da acciona ar VialTweeter xí equipado 'nar software inteligente ne 'nar sensor mpat'i enchufable. Conecte sensor mpat'i 'na jar UP200St ne inserte ár nts'ä sensor mpat'i jar 'na ya tubos muestra. A través de 'nar pantalla táctil 'bede ya njät'i, to da t'ot'e jar menú ar UP200St 'nar rango ar mpat'i específico da sonicación ár muestra. Ar ultrasonido ar detendrá automáticamente nu'bu̲ ar alcance ar mpat'i máxima ne detendrá asta ar mpat'i ar muestra baje ár hmädi mäs hñets'i'i ar mpat'i establecida ∆. Tso̲kwa continuación, ar sonicación pengi 'bu̲i automáticamente. Nuna ar función inteligente evita degradación inducida ir nge ar pa.
- Bloque VialTweeter ar tsa̲ da preenfriar. Coloque bloque VialTweeter (ho̲ntho ar sonotrodo hinda transductor!) jar ar refrigerador wa congelador pa preenfriar bloque titanio ayuda bí posponer ar aumento mpat'i ja ar muestra. Nu'bu̲ xähmä, ar muestra 'nehe ar tsa̲ da preenfriar.
- Utilice hielo seco pa enfriar Nxoge ar sonicación. Use 'nar bandeja tx'u̲tho profunda ár ñut'i ko xingu ya hielo seco ne coloque VialTweeter dige ar hielo pa ndi ar pa ar disipe rápidamente.
Clientes nga̲tho utilizan ar VialTweeter ne ar VialPress pa ár 'be̲fi diario nt'ot'e muestras jar laboratorios biológicos, ar bioquímicos, ya médicos ne ya clínicos. Ar software ar inteligente ne ar control mpat'i procesador ar UP200St, ar mpat'i controla dets'e fiable ne bí evita ar degradación ar muestra inducida ir nge ar pa. Ar nt'ot'e ultrasónica muestras ar VialTweeter ne ar VialPress ofrece resultados altamente fiables ne reproducibles.
'Bui ar disruptor ultrasónico óptimo pa ár nt'ot'e lisis
Hielscher Ultrasonics ge 'nar fabricante ko ndunthe ya mfeni jar fabricación ya disruptores ne ya homogeneizadores celulares ar ultrasónicos ar mar hñets'i rendimiento pa laboratorios, sistemas sobremesa ne da escala industrial. Tamaño ár cultivo células bacterianas, ár objetivo nthoni wa ar producción ne ar volumen células da procesar ya ora wa pa ya factores esenciales pa tingigi mbo jar disruptor celular ultrasónico mfädi pa ár nt'ot'e.
Hielscher Ultrasonics ofrece ndunthe soluciones pa sonicación simultánea muestras múltiples (asta 10 viales ko ar VialTweeter) ne muestras masivas (es decir, placas ar microtitulación yá placas ELISA ko ar UIP400MTP), nja'bu̲ komongu ar clásico ultrasonido laboratorio ar klase sonda ko 'na'ño niveles ar nts'edi ar 50 da 400 vatios asta ya procesadores ultrasónicos ar totalmente industriales ko asta 16.000 vatios ir nge ar xe̲ni pa ar disrupción celular yá 'ma ne ar extracción proteínas jar dätä ar producciones. Ga̲tho ya ultrasonidos Hielscher gi 'bu̲hu̲ construidos da funcionar ya 24 ora ar pa, 7 ya pa ar su̲mänä, ya 365 pa ar je̲ya plena ar carga. Ar robustez ne ar fiabilidad ya características du̲i HMUNTS'UJE dispositivos ultrasónicos.
Ga̲tho ya homogeneizadores ultrasónicos digitales gi 'bu̲hu̲ equipados ko 'nar software inteligente, 'nar pantalla táctil ya njät'i ne 'nar protocolizado automático datos, nä'ä bi pa̲ti bí dispositivo ar ultrasónico ja 'nar cómoda herramienta ar 'be̲fi jar jar laboratorio ne ya instalaciones producción.
Da ga ga pädi Temu̲ ar klase ar células, Temu̲ volumen, ko Temu̲ frecuencia ne ko Temu̲ objetivo pe̲ts'i da procesar yá muestras ya biológicas. Bí recomendaremos ar disruptor ar células ultrasónico mäs adecuado pa ya requisitos ár proceso.
Xtí tabla bí ofrece 'nar indicación ya mfeni ya procesamiento aproximada HMUNTS'UJE sistemas ultrasonidos, ndezu̲ homogeneizadores portátiles compactos ne ultrasonidos MultiSample asta ya procesadores ultrasónicos ar industriales pa aplicaciones comerciales:
Volumen lote | Gasto | Dispositivos recomendados |
---|---|---|
Placas 96 pocillos yá microtitulación | n.d. | UIP400MTP |
10 viales 0,5 ma 1,5 ml | n.d. | VialTweeter jar UP200St |
0.01 jar 250 ya ml | Ar 5 100 ml yá min | UP50H |
0.01 jar 500 ya ml | Ar 10 200 ml yá min | UP100H |
Ar 10 da 2000 ml | Ar 20 400 ml yá min | UP200Ht, UP400St |
0.1 da 20L | 0.2 4 L yá min | UIP2000hdT |
Ar 10 da 100L | Ar 2 10 l yá min | UIP4000hdT |
n.d. | Ar 10 100 L yá min | UIP16000 |
n.d. | Mar dätä | Racimo ar UIP16000 |
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Mäs ungumfädi dige Honja tsa̲ da utilizar ár homogeneizador ar tejidos ultrasónico pa jar nt'ot'e xi hño ne ya fiable soluciones tampón.
Datos da Bale ar penä ga pädi
Escherichia Coli Bacteria
Escherichia coli ge 'nar klase ar bacteria, hingi ngetho ge ar esporas, Gram — negativas ne caracteriza ir nge ár dets'e bastón recto. Bacteria E. coli xi 'mui ar nt'uni mbo jar ximha̲i, ya nts'i ne ya intestinos ya jä'i ne me̲ti. Ar E. coli suele da móvil ir nge njapu'befi ya flagelos peritricos, pe 'nehe 'bu̲i xingu ya inmóviles. Ya E. coli ge ya llamados Hmunts'i quimioorganótrofos anaerobios facultativos, nä'ä ir bo̲ni ke ya mar tsa̲ ndi ga OT'UJE metabolismos respiratorios ne fermentativos. Kasu̲ nga̲tho ya xingu ya E. coli ya benignos ne cumplen 'befi útiles komongu, ngu, suprimir crecimiento especies bacterianas dañinas, sintetizar vitaminas, etcétera.
Ya células ar bacteria Escherichia coli ar llamado ar klase B ge 'nar categoría hontho cepas ar E. coli, nä'ä da utilizan ampliamente jar ár nthoni da hyoni mecanismos komongu ar sensibilidad ja ya bacteriófagos wa ya sistemas restricción-modificación. 'Nehe, ya bacterias E. coli ya valoradas komongu 'nar fani hñäki fiable pa ar hmä proteínas laboratorios biotecnología ne ciencias ar nzaki. Ngu, ar E. coli ar gi japu̲'be̲fi pa sintetizar compuestos komongu proteínas ne oligosacáridos escala industrial. Nu'bya características específicas komongu ar deficiencia proteasa, ar xí hñets'i'i producción acetato 'nar mar hñets'i za̲ ár nthe̲ glucosa ne ar permeabilidad mejorada, ya células B ar E. coli ge ya células huésped mäs utilizadas pa ar producción proteínas modificadas genéticamente.
Proteína recombinante
Ya proteínas recombinantes (rProt) gi 'bu̲hu̲ adquiriendo 'nar mahyoni da significativa jar múltiples ramas, incluidas ya industrias ar producción química, farmacéutica, cosmética, 'ñithi jä'i ne me̲ti, agricultura, nts'i ne ya nt'ot'e ya residuos.
Producción proteína recombinante requiere njapu'befi ya jä'i pede ko ya hmä. Ngu ya sistemas celulares ar expresivos pa ar producción ADN recombinante, ar xi utilizar tanto células procariotas komongu ar eucariotas. Nu'bu̲ bien ya células bacterianas ge ya mäs utilizadas pa ar hmä proteínas nu'bya factores komongu hñets'i'i costo, hei jar escalabilidad ne ya nkohi simples ar nt'uni, ya sistemas xi hño ya células ne mamíferos, levaduras, algas, insectos ne células ya alternativas establecidas. Ar klase ar proteína, ar nt'ot'e funcional, nja'bu Komo ar rendimiento requerido ar proteína expresada influyen jar selección ko ya celular utilizado pa ar hmä proteínas.
Jar 'mui xingu ar proteína recombinante, 'nar célula particular da da transfectada ko 'nar vector ADN da contenga ar plantilla ADN recombinante. Tso̲kwa continuación, bí cultivan ya células transfectadas ko ar plantilla. Komongu ar consecuencia ar nt'ot'e mbo celular, ya células transcriben ne traducen proteína 'befi, produciendo nja'bu̲ bí proteína ar objetivo.
Medida da proteínas ya expresadas da atrapadas jar matriz ar celular, ar célula da da lisada (interrumpida ne rota) da liberar ya proteínas. 'Nar bi thogi ar purificación 'mefa ár njäts'i Tange'u, ar proteína bí separa ne purifica.
Ar ndui proteína recombinante utilizada ar nt'ot'e bí ar insulina jä'i recombinante jar 1982. Nu'bya da xtä, bí producen mäs ar 170 xingu ya proteínas recombinantes jar nga̲tho ar ximha̲i da tratamientos médicos. Ya proteínas recombinantes comúnmente utilizadas jar 'ñithi ya, ya ejemplo, ya hormonas recombinantes, ya interferones, ya interleucinas, ya factores crecimiento, ya factores necrosis tumoral, ya factores coagulación ar ya ji, ya fármacos trombolíticos ne ya enzimas pa japi enfermedades nsu komongu ar diabetes, ar enanismo, ar infarto miocardio, ar insuficiencia cardíaca congestiva, ar apoplejía cerebral, ar esclerosis múltiple, ar neutropenia, ar trombocitopenia, ar anemia, ar hepatitis, ar artritis reumatoide, ar asma, ar enfermedad Crohn ne ya terapias kontra ar cáncer. (cf. Phuc V. Pham, ja ya Omics Technologies and Bio — Engineering, 2018)
Bibliografía yá Referencias
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.