Hielscher ultralydteknologi

Ultralydproteinekstraksjon fra væv og cellekulturer

  • Proteinekstraksjon er et viktig prøveprepareringstrinn i proteomforskning.
  • Proteiner kan ekstraheres fra planter og dyr vev, gjær og mikroorganismer.
  • Sonikering er en pålitelig, effektiv proteinekstraksjon metode som gir høy protein utbytter i løpet av kort ekstraksjonstid.

 

Protein ekstraksjon fra vev og celler

Protein ekstraksjon fra vev og dyrkede celler er en viktig prøveprepareringstrinn som blir utført i løpet av mange biokjemiske og analytiske teknikker, slik som ELISA, PAGE, Vestlig blotting, Massespektrometri, eller proteinrensing. ultralyd celle avbrudd, lyse og ekstraksjon er en nøyaktig kontrollerbar teknikk for å sikre høye utbytter av proteiner.

Proteinekstraksjon fra animalsk vev

For fremstilling av helformet vev (f.eks. Nyre, hjerte, lunge, muskel etc.), skal vevet dissekeres i svært små biter med rene verktøy, på is og helst så raskt som mulig for å forhindre nedbrytning av proteaser (f.eks. lysisbuffer som RIPA eller hypotonisk lysisbuffer inneholdende protease- og fosfataseinhibitor-cocktail). Etter disseksjonen blir prøven nedsenket i flytende nitrogen for snapfrysning. Prøven kan oppbevares ved -80 ° C til senere bruk eller være opptatt på is for umiddelbar homogenisering. Umiddelbart før ultralydsekstraksjon, blir iskald lysisbuffer (med proteasehemmere DTT, leupeptin og aprotinin) raskt tilsatt i prøverøret (per 10 mg vev ca 600 mikroliter buffer anbefales). Ca. 20-60 mg vev anbefales per prøverør.
Ultrasonic homogenisering, lyse og ekstraksjon blir utført med en ultrasonisk homogenisator for eksempel Uf200 ः t eller UP200St, Utstyrt med en mikro-spiss sonotrode. Ultralydbehandling varighet er 60-90 sek. ved en ultrasonisk syklusmodus på 15 sek. ultralydbehandling og 10 sek. hviletid. Prøven skal oppbevares i is hele tiden.
Etter ultralyd homogenisering / ekstraksjonen blir lysatet sentrifugert ved 27,000g i ca. 20 min. Deretter ble supernatanten samlet opp, slik at proteinkonsentrasjonen kan bestemmes ved hjelp av en proteinanalyse, for eksempel Pierce BCA-proteinanalyse.

Protein sonikering er en viktig metode for utarbeidelse av prøver

Ultralyd protein ekstraksjon fra celler med UP200St

Informasjonsforespørsel




Merk våre Personvernregler.


Protein utvinning fra blod serum

For en homogen blanding av serumet og fosfatbufferen virveles prøven først før ultralydcellelys. For ultralydslysen blir prøven sonikert med en ultralyd lab-homogenisator som f.eks UP100H etter 8 sykluser ved 20% amplitude, for cykler, hver på 5 sekunder på og 15 sekunder av. Sonocation utføres ved sonicationg i sykluser, og ved å plassere prøven på is slik at det unngås en overopphetning og termiske nedbrytning av prøven. Siden serum inneholder en stor mengde av vekt proteiner høy molekylvekt (slik som albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, immunoglobulin G og immunoglobulin A), som interfererer med separasjon av lavmolekylære proteiner under IEF, er det anbefalt å tømme dem fra serum ved hjelp av en utarming kolonne.

Proteinekstraksjon fra plantevev

Frisk, myk plantevev, f.eks mose etc., kan lett brytes ved ganske enkelt å plassere hakket prøvematerialet i lyseringsbuffer for ultralydbehandling. Seige, ligenous plantevev, såsom frø, gran nåler etc., bør males tørt. Noen harde, treaktige plantematerialer må være frosset og oppmalt i flytende nitrogen før ekstrahert ved ultralydbehandling. For plantecellekultursuspensjoner, er for det meste tilstrekkelig for en ultralydbehandling mellom 30 og 150 sekunder i en lyseringsbuffer. Seigere materiale slik som gresskarfrø krever en mer intens ultralydbehandling som beskrevet nedenfor.

Protokoll for ultralyd ekstraksjon av albumin fra gresskarfrø

Ultrasonisk vevshomogenisator UP400St med S24d40 - for proteinekstraksjon fra vegetabilsk og animalsk vev (Trykk for større!)For ultralyd protein utvinning av albumin fra finmalt gresskar kim-pulver, 10 g avfettet gresskar kim-pulver og 100 ml av deionisert vann som oppløsningsmiddel tilsatt i et 250 ml begerglass. Proteinet utvinning består i to trinn: Først blir prøven sonikert med en sonde-type ultralyd UP400St (400 W, 24 kHz) med montert sonotrode S24d7. Den begerglass ble plassert i et kaldt vannbad under ultralyd homogenisering. Den innstillingen av ultralyd UP400St med den tilkoblede temperaturføleren sørget for at prøvetemperaturen alltid holdes under 30 ° C. Ved den nøyaktige temperaturkontrollen under sonikering unngås en denaturering av albumin. For det andre ble ekstraksjonen utført med en mikser ved 200 omdr./min. Hastighet og ved 30 ° C. Etterpå overføres begeret til en termostatisk rister. Globulin fjernes via dialyse med destillert vann. Etter globulinfjerningen kan proteinekstrakten samples for bestemmelse av albuminprofilen og justeres deretter til pI = 3,0 ved anvendelse av 0,1 M HC1 for albumin-koagulasjon. Den faste fase separeres ved sentrifugering ved 5000g, 20 ° C og gjenoppløses i avionisert vann. Albumin koagulasjon utføres to ganger for å øke proteinforholdet i albuminkonsentratet.

Ultrasonisk alkaliske protein ekstraksjon for fremstilling av proteinkonsentrat fra riskli viser at ultralydbehandlingen resulterer i høyere proteinutbytte i en betydelig kortere tid ekstraksjon – sammenlignet med konvensjonelle ekstraksjonsmetoder.

Ultralyd apparat VialTweeter for proteinekstraksjon fra vevsprøver (Trykk for å forstørre!)

VialTweeter for indirekte sonication.

Fordeler

  • rask
  • høye utbytter
  • svært effektiv
  • Nøyaktig kontroll over parametere
  • reproduserbare resultater
  • lineær skalerbarhet

Prøvepreparering protokoll for funksjonell iNOS-enzym

For å oppnå fullt ut funksjonell iNOS-enzym (for eksempel for legemiddelscreening), blir den følgende protokoll anbefalt: Cellesuspensjonen bør plasseres på is og ultralydbehandlet med en UP100H ved 10 um amplitude ved syklusmodus av 5 sek. ultralydbehandling og 25 sek. hvile på is. Prosedyren bør gjentas ca.. 3 ganger. Den hvilende tid mellom sonikering sykluser reduserer temperaturen stige og vil derfor redusere risikoen for denaturering.

Ultralyd Protein Oppløsning

Ultralydbehandling kan akselerere proteinet oppløseliggjøringen prosessen, noe som vanligvis krever flere timer. For ikke å overopphete prøven og forhindre proteinnedbrytning og modifikasjoner i oppløsninger inneholdende urea, bør ultralyd-bursts ikke vare lenger enn noen få sekunder.

Generelle instruksjoner

Temperatur kontroll: For å sikre et høyt proteinutbytte uten termisk denaturering, må temperaturen under utvinning reguleres. Hielscher state-of-art ultralyd homogenisatorer – også kalt ultrasonisk desintegrator eller sonificator – er nøyaktig kontrollerbare. De kommer med en pluggbar temperatursensor. I de innstillingsmuligheter for den ultralydhomogenisator, kan en maksimumstemperatur angis. Når denne temperatur max er nådd, stopper ultralyd automatisk inntil prøven er avkjølt.
Buffer: Ønsker av en egnet buffer, og den riktige buffervolum varierer fra vev til vev og må bli regnet ut ved prøving og feiling testing.
Isolering / rensing: Protein lysatet kan inneholde et overskudd av biomolekyler, slik som DNA eller karbohydrater, som kan fjernes ved proteinutfelling (deoksycholat-trikloreddiksyre) eller bufferutveksling.

Chittapalo og Noomhorm (2009) rapporterte at proteinutbyttet økes ved å bruke ultralydbehandling, og at den ultrasoniske vev homogenisering og lysis prosessen kan forbedre eksisterende utvinning prosesser betydelig – muliggjør for nye kommersielle utvinningsmuligheter.

Lyd beskyttelse med Hielscher lyd kabinett SPB-L og ultralyd enhet UP200St. (Klikk for å forstørre!)

Ultralyd vevshomogenisator UP200St for effektiv proteinekstraksjon

Nøyaktig kontroll av ultralydbehandling (Klikk for å forstørre!)

Browser kontroll for nøyaktig overvåking og drift av sonikasjonsprosessen

Ultralyd utstyr til Protein Extraction

Hielscher Ultrasonics tilbyr et bredt spekter av ultralyd homogenisatorer for nedbrytning av celler, vev, mikroorganismer, bakterier, gjær og sporer.
Hielscher lab ultrasonicators er kraftig og enkel å betjene. Bygget for 24/7 drift er de utformet som robuste og effektive lab og benk-topp-enheter. For alle enheter, kan den energiproduksjon og amplituden kontrolleres nøyaktig. Det brede spekter av Tilbehør åpner ytterligere oppsettalternativene. De digitale enheter som VialTweeter, Uf200 ः t, UP200Stog UP400St ha en integrert temperaturkontroll og en innebygd SD-kort for automatisk registrering av data.
For den indirekte, krysskontaminering-fri og samtidig lydbehandling av flere prøver, kan vi tilby VialTweeter eller Ultralyd cuphorn.
Avhengig av programmet, materiale og prøvevolum, vil vi anbefale deg den mest passende oppsett for prøven prep. Kontakt oss i dag!

Kontakt oss! / Spør oss!

Vennligst bruk skjemaet nedenfor hvis du ønsker å be om ytterligere informasjon om ultralyd homogenisering. Vi vil gjerne tilby deg en ultralyd system møte dine behov.









Vær oppmerksom på at Personvernregler.


Litteratur / Referanser

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultralyd assistert alkali ekstraksjon av protein fra avfettet riskli og egenskapene til de proteinkonsentratene. Int J Food Sei Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joan.; Nunes, Ana M.; Gomes, Sofia E.; Roberts, Peter M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J., Thibodeau, Stephen C.; Borralho, Peter M.; Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): Effektiv utvinning av proteiner fra flere kilde prøver etter Trizol eller Trizol LS RNA-ekstraksjon og langtidslagring. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Fakta Verdt å vite

proteomikk

Proteomikk er forskningsfeltet som undersøker proteiner og proteomet. Proteiner fullfil en lang rekke livsviktige funksjoner i organismer. Den proteom- er hele settet av proteinene uttrykt av et genom, celle, vev eller organisme på et bestemt tidspunkt. Den proteom- varierer med tiden og distinkte krav, eller påkjenninger, som en celle eller organisme gjennomgår. Mer spesifikt, er det sett av uttrykte proteiner i en gitt celletype eller organisme, ved en gitt tid, under definerte betingelser. Begrepet er en blanding av proteiner og genom. Proteomikk er studiet av proteomet.

Protein

Proteiner er er store biomolekyler, såkalte makromolekyler – som er sammensatt av en eller flere lange kjeder av aminosyrerester. Proteiner er tilstede i alle organismer av vegetabilsk og animalsk opprinnelse, og de er avgjørende for de fleste biologiske funksjoner. Siden proteiner inneholder mye biologisk informasjon, blir de ekstrahert for analytisk formål, for eksempel for proteomisk forskning. Den viktigste funksjonen som utføres av proteiner, omfatter katalyse av metabolske reaksjoner, DNA-replikasjon, respons på stimuli og transport av molekyler fra ett sted til et annet. Proteiner er forskjellig fra hverandre, hovedsakelig i sin sekvens av aminosyrer, som dikteres av nukleotidsekvensen av deres gener, og som vanligvis resulterer i at protein foldes inn i en bestemt tredimensjonal struktur som bestemmer dens aktivitet. Proteiner er – foruten peptider – en av de viktigste komponentene i mat. Derfor proteomikk er et kraftig verktøy i mat vitenskap å optimalisere prosesser, matsikkerhet og ernæringsmessig vurdering.

gel elektroforese

Gel elektroforese er det viktig metode for separasjon og analyse av makromolekyler, slik som DNA, RNA og proteiner samt deres fragmenter, basert på deres størrelse og ladning. Den brukes i klinisk kjemi for å separere proteiner ved ladning og / eller størrelse (IEF agarose, i alt vesentlig størrelse uavhengig) og i biokjemi, molekylær biologi og proteomforskning å separere en blandet populasjon av DNA og RNA-fragmenter med lengde, for å anslå størrelsen av DNA og RNA-fragmenter eller til å separere proteiner ved ladning.

cellekulturer

Cellekultur er den regulerte vekstprosessen ved hvilke celler dyrkes under kontrollerte betingelser. Cellekulturbetingelser variere for hver celletype. Generelt er det miljø av en cellekultur består av et egnet fartøy (f.eks petriskål) med substratet eller medium som leverer de essensielle næringsstoffer (aminosyrer, karbohydrater, vitaminer, mineraler), vekstfaktorer, hormoner, og gasser (CO2, The2), Og regulerer fysio-kjemiske miljøet (pH buffer, osmotisk trykk, temperatur). De fleste cellene trenger en overflate eller kunstig substrat, mens andre cellekulturer kan dyrkes frittflytende i dyrkningsmedium (suspensjonskultur, cellesuspensjon).
Massekulturer av animalske cellelinjer blir anvendt i industriell produksjon av virusvaksiner og andre bioteknologiske avledede produkter. Humane stamceller blir dyrket for å utvide antallet av celler og differensiere cellene til forskjellige somatiske celletyper for transplantasjonsformål.

vevsprøver

Begrepet vev omtaler et mobilmellomprodukt, hvor cellematerialet er på et systemnivå mellom celler og en fullstendig organ. I vev, tilsvarende celler, fra den samme opprinnelsen som sammen utføre en bestemt funksjon, er montert. Ved funksjonell gruppering av flere vev, blir de komplekse strukturer av organer dannes.
Vevet blir samplet for forskning i biologi, histologi / histopatologi, parasitologi, biokjemi, immunohistokjemi, så vel som for å dyrke og ekstrahere DNA. Det kan skilles mellom dyr (for oppdeling: pattedyr vev) og plantevev. Dyrevev er gruppert i fire grunnleggende typer av binde, muskel, nervøs, og epitelvev. Plantevev er delt i følgende tre vev systemer: epidermis, i første vev, og vaskulært vev.
Vevsprøver kan fremstilles fra dyre- eller plantedeler, f.eks bein, muskler, blader, etc.

Kroppsvæsker

Blod, serum, plasma, cerebrospinalvæske, spytt og synovial væske er kroppsvæsker, som tilbyr en stor kilde til diagnostisk relevant informasjon. Derfor er en sofistikert fremstillingen av kroppsvæskeprøver for analyse viktig. Den første vanskelighet er forbundet med det brede dynamiske område av komponenter som er tilstede i kroppsvæsker.

Bestemmelse av proteinkonsentrasjon

Bradford assay, Lowry-analyse og bicinchoninic syre (BCA-analyse) er vanlige undersøkelser for å bestemme konsentrasjonen av proteiner. Bovint serumalbumin (BSA) er et av de mest brukte proteinstandard.

lysis Buffer

Lyseringsbuffer må velges i henhold til den cellemateriale eller vev (vevskultur, plante, bakterier, sopp, etc.), og uavhengig av om cellene er i en struktur og den type struktur. Et bredt spekter av lyseringsbuffere for utvinning av proteiner, membraner, og organeller er formulert med en eller flere detergenter. Vaskemiddelet velges vanligvis via prøving og feiling tester eller – hvis tilgjengelig – i henhold til en eksisterende proteinekstraksjon protokoll. Rengjøringsmiddelet må være kompatibelt med vev kilden og proteinene. Generelt er den mildeste vaskemiddel som passer for en spesifikk vev / protein, er valgt for å opprettholde den maksimale funksjonaliteten av ekstraktet. Videre, i tilfelle av en ekstraksjon av membraner og organeller, holder et mildt vaskemiddel membranen intakt. Vanlig anvendte vaskemidler i lyseringsbuffere er stort sett ikke-ionisk eller zwitterionisk, f.eks CHAPS, deoxycholate, Triton ™ X-100, NP40, og Tween 20.
For eksempel, vev, slik som hjerne, lever, tarm, nyre, milt etc. kan ganske enkelt bufret med RIPA – imidlertid proteasehemmere og DTT (for eksempel for gelelektroforese) bør være inkludert.
Lyseringsbuffer for skjelettmuskelvevet (iskald): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glycerol, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitol supplert med protease inhibitor cocktail og fosfatase
Tabell vanlige buffere og deres pH-område. I alminnelighet er disse buffere som normalt anvendes i konsentrasjoner på 20 til 50 mM.

Buffer pH-området
Sitronsyre – Naoh 2,2 for alle – 6,5 for alle
Natriumsitrat – Sitronsyre 3,0 for alle – 6,2 for alle
Natriumacetat – eddiksyre 3,6 for alle – 5,6 for alle
Cacodylic-natriumsalt – Hcl 5,0 for alle – 7,4 for alle
MY – Naoh 5,6 for alle – 6,8 for alle
Natriumdihydrogenfosfat – dinatriumhydrogenfosfat 5,8 for alle – 8,0
imidazol – Hcl 6,2 for alle – 7,8 for alle
Mopper – Koh 6,6 for alle – 7,8 for alle
triethanolaminhydroklorid – Naoh 6,8 for alle – 8,8 for alle
Tris – Hcl 7,0 for alle – 9,0 for alle
HEPES – Naoh 7,2 for alle – 8,2 for alle
Tricine – Naoh 7,6 for alle – 8,6 for alle
Sodium tetra – borsyre 7,6 for alle – 9,2 for alle
Bicine – Naoh 7,7 for alle – 8,9 for alle
glysin – Naoh 8,6 for alle – 10,6 for alle

De fleste buffere viser en pH-avhengighet med temperaturen. Dette gjelder spesielt for Tris-buffere. PKa-verdien endres fra 8,06 ved 25 ° C til 8,85 ved 0 ° C.
(PH og pKa-verdien til en buffer: pH måler konsentrasjonen av hydrogenioner i en vandig oppløsning pKa (= syre dissosiasjonskonstant) er et beslektet, men mer spesifikt mål, ved at det bidrar til å forutsi hvordan et molekyl som vil opptre ved en spesifikk. PH verdi.)

TRIzol

TRIzol er en kjemisk løsning som brukes for å ekstrahere RNA / DNA / protein under guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon. Anvendelse av ultrasonisk assistert TRIzol fjerning gir høy DNA, RNA og protein-utbytter fra den samme prøven og utmerker seg derved andre ekstraksjonsmetoder.