Hielscher ultralydteknologi

Ultralyd Lysis av E. Coli

  • E. coli-bakterier er de mest brukte bakteriene i mikrobiologi og bioteknologi.
  • Ultralydcelleforstyrrelser gir pålitelige og reproducerbare resultater for lysis av E. coli.
  • Intense, men likevel nøyaktig kontrollerbare kavitasjons- og skjærkrafter resulterer i fullstendig avbrudd og høye utvinningsutbytter (f.eks. Proteiner, DNA).

Celleforstyrrelse ved kavitation

Escherichia coli-bakterier lyseres pålitelig ved bruk av ultralydvevshomogenisatorer.Ultralyd sonde-type homogenisatorer opererer med ca. 20.000 sykluser per sekund (ved 20kHz) og forårsaker kavitasjon i væsker eller supsider. Akustiske kavitasjonsmikroskopiske områder med vakuumlignende trykk og høye temperaturer som tåler celler fra hverandre. Selv om temperaturen kan nå flere tusen grader Celsius, er kavitasjonsvolumene så små at de ikke varmes opp prosessen betydelig. Ultralydgenerert akustisk kavitasjon og skjærkrafter perforerer eller bryter cellemembranen til E. coli – avhengig av enhetens innstilling av ultralydshomogenisatoren.

Fordeler med Ultralyd Lysis

  • nøyaktig kontroll av lysis (intensitet, amplitude, temperatur)
  • optimal tilpasning til bestemte prøver
  • temperatur kontroll
  • for svært små til meget store prøver (μL til liter)
  • ren mekanisk behandling
  • lineær skala opp fra lab til produksjon
Ultralydsenheten VialTweeter muliggjør samtidig prøveutarbeidelse av opptil 10 hetteglass under samme prosessbetingelser. (Klikk for å forstørre!)

VialTweeter for ultralyd lysis

Informasjonsforespørsel




Merk våre Personvernregler.


Mens kjemisk og enzymtisk lysis kan være problematisk – siden kjemisk lys kan endre proteinstrukturer og innføre rensingsproblemer, og enzymatisk lys krever lange inkubasjonstider og er ikke reproduserbar – ultralyd forstyrrelse er en sofistikert, rask celleforstyrrelsesmetode.
Ultralydlyse er basert på mekaniske krefter bare. Ingen kjemikalier tilsettes, sonikering bryter celle veggen ved skjærkrefter. Kjemisk lyse Rings kan endre protein struktur og innføre rensing problemer. enzymatisk forstyrrelse krever lang inkubasjonstid og er ikke reproduserbar.

Generelle anbefalinger

UP400St ultralydator med strømningsreaktorSonikering er den mest populære teknikken for lysing av svært små, mellomstore og store mengder cellesuspensjoner – fra pico-liter opptil 100L / hr (ved hjelp av en ultralyd-strømningscelle). Celler lyseres ved væskeskju og kavitasjon. DNA skjæres også under sonikering, så det er ikke nødvendig å legge DNase til cellesuspensjonen.
Temperatur kontroll:
Ved forhåndsavkjøling av prøven og oppbevaring av prøven under lydisolering på is, kan prøvens termiske nedbrytning av prøven lett forhindres.
Ideelt sett bør prøvene holdes iskald under lyse, men for de fleste prøver det tilstrekkelig hvis temperaturen ikke stiger over temperaturen i kulturen eller vevs kilden. Derfor anbefales det, å holde suspensjonen på isen og å sonikere med flere korte ultralyd pulser på 5-10 sek og pauser på 10-30 sek. Under pauser, kan varmen forsvinne for å reetablere en lav temperatur. For større celleprøver er forskjellige strømningscellereaktorer med kjøle jakker tilgjengelige.

Protokoller for fremstilling av E. coli lysater

Ekspresjonsanalyse og rensing av rekombinant protein

E. coli-pellet ble sonikert med et ultralydsystem UP100H (Hielscher). Til dette formål ble cellepellet resuspendert i kjølt lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) og avkjølt på is i 10 minutter. Deretter ble cellesuspensjon sonikert med 10 korte sprekker på 10 s etterfulgt av intervall på 30 s for avkjøling. Endelig ble celleavfall fjernet ved ultracentrifugering ved 4 ° C i 15 minutter ved 14000 rpm. For bekreftelse av rPR-uttrykk ble supernatanten kjørt på 12% polyakrylamidgel og analysert ved SDS-PAGE og Western blotting. Rensing av rPR ble gjort ved å bruke Ni2 +-NTA harpiks (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens veiledning. I denne fasen ble opprinnelig rensemetode benyttet. Renheten av det rensede protein ble vurdert ved hjelp av elektroforese på 12% polyakrylamidgelen og etterfølgende Coomassie blå-farging. Renset proteinkonsentrasjon ble målt ved Micro BCA protein analysesett (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al., 2016)

Ultralydcelleforstyrrelser UP100H (100W) for lysis, celleforstyrrelse og DNA-skjæring.

Ultralyd homogenisator UP100H 100W

Cellevekst, kryssbinding og fremstilling av E. coli-cellekstrakter

For SeqA- og RNA-polymerase ChIP-Chip E. coli MG1655 eller MG1655AseqA ble dyrket ved 37 ° C til en OD600 for alle på ca. 0,15 i 50 ml LB (+ 0,2% glukose) før 27 μl formaldehyd (37%) per ml medium ble tilsatt (sluttkonsentrasjon 1%). Tverrbinding ble utført ved langsom risting (100 rpm) ved romtemperatur i 20 minutter etterfulgt av quenching med 10 ml 2,5 M glycin (sluttkonsentrasjon 0,5 M). For varme-sjokkeksperimenter ble E. coli MG1655 dyrket i 65 ml LB-medium ved 30 ° C til en OD600 for alle på ca. 0,3. Deretter ble 30 ml kultur overført til en forvarmet kolbe ved 43 ° C og resten holdt ved 30 ° C. Tverrbinding og quenching var som beskrevet ovenfor, bortsett fra at celler ble holdt ved 30 eller 43 ° C i 5 minutter før ytterligere sakte risting ved romtemperatur. Celler ble samlet ved sentrifugering og vasket to ganger med kaldt TBS (pH 7,5). Etter resuspendering i 1 ml lysisbuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sukrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozym) og inkubering ved 37 ° C i 30 minutter etterfulgt av tilsetning av 4 ml IP buffer ble celler sonicated på is med 12 ganger 30 sek og 30 sek bryter ved en UP400St Ultralydprosessor (Hielscher Ultrasonics GmbH) med 100% effekt. Etter sentrifugering i 10 minutter ved 9000 g ble 800 μl alikvoter av supernatanten lagret ved -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Overproduksjon og rensing av enzymer.

For overproduksjon av decahistidin (His10) -tagne proteiner ble E. coli BL21 (DE3) transformert med pET19b-konstruksjoner. En nattlig forkultur ble høstet ved sentrifugering, og 1% ble brukt til å inokulere en ekspresjonskultur. Celler som bærer pET19mgtB ble dyrket ved 22 ° C til en optisk densitet ved 600 nm (OD600 for alle) på 0,7. Kulturen ble overført til 17 ° C og indusert av 100 μM IPTG. Etter 16 timer ble kulturen høstet ved sentrifugering ved 7.500 x g ved 4 ° C. Celler ble resuspendert i 50 mM fosfatbuffert saltvann (PBS) med 0,3 M NaCl ved pH 7,4 og forstyrret ved ultralydbehandling med en S2 mikrotips sonotrode ved UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Tyskland) ved en syklus på 0,5 og en amplitud på 75%.
Overproduksjonen av decahistidin-merket GtfC ble indusert ved 37 ° C ved en OD600 for alle på 0,6 med 100 μM IPTG. Celler ble deretter inkubert i 4 timer, høstet og lysert som angitt ovenfor for MgtB.
Råcelleekstrakter ble sentrifugert ved 15.000 x g og 4 ° C for å sedimentere celledelen. De klargjorte ekstraktene ble lastet på 1 ml HisTrap FF Crude kolonner ved bruk av et ÄKTAprime Plus-system (GE Healthcare). Enzymer ble renset i henhold til produsentens protokoll for gradienteluering av His-merkede proteiner. Elutede proteinløsninger ble dialysert to ganger mot 1000 volumer 50 mM PBS, pH 7,4, med 0,3 M NaCl ved 4 ° C. Rensingen ble analysert med 12% SDS-PAGE. Konsentrasjonen av protein ble bestemt ved Bradford-metoden ved bruk av Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Tyskland). (Rabausch et al., 2013)

Ekstraksjon av protein fra E. coli-bakterier
Et agnprotein av interesse (i dette tilfellet, MTV1 av Arabidopsis thaliana) er fusjonert til en GST-tag og uttrykt i BL21 Escherichia coli (E. coli) -celler.
1. Ta en pellet av GST-MTV1 og GST (tilsvarende 50 ml bakteriekultur) og resuspender hver i 2,5 ml iskald ekstraksjonsbuffer.
2. Bruk en ultralydator UP100H (utstyrt med MS3 mikrotip-sonotrode for små mengder (2-5 ml)) for å forstyrre bakteriecellene til de lyseres, noe som indikeres av redusert opasitet og økt viskositet. Dette må utføres på is, og det anbefales å sonikere i intervaller (f.eks. 10 sek sonicating etterfulgt av 10 sek på is og så videre). Forholdsregler må tas for ikke å sonikere med for høy intensitet. Hvis det oppdages skumdannelse eller dannelsen av et hvitt bunnfall, må intensiteten senkes.
3. Overfør den lyserte bakterieoppløsningen til 1,5 ml mikrocentrifugerør og sentrifuger ved 4 ° C, 16.000 xg i 20 minutter.

Allicin-modifiserte proteiner i E. coli

VialTweeter er en komfortabel ultralydsapparat for liten prøvehomogeniseringBestemmelse av sulfhydrylinnholdet ved 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) -analyse
En nattkultur av E. coli MG1655 ble brukt til å inokulere MOPS-minimal medium (1: 100). Kulturen ble dyrket aerobisk inntil en A600 på 0,4 ble nådd. Kulturen ble delt inn i tre 15 ml kulturer for stressbehandling. En ubehandlet kultur virket som en negativ kontroll. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) eller 1 mM diamid ble tilsatt til en av de resterende to kulturer hver. Kulturer ble inkubert i 15 minutter. 5 ml av hver kultur ble høstet ved sentrifugering (8,525 x g, 4 ° C, 10 min). Celler ble vasket to ganger med 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2Po4, pH 7,4, lagret anaerobt før bruk) og sentrifugert (13.000 x g, 4 ° C, 10 min). Celler ble resuspendert i lysebuffer (PBS med 6 mM guanidinium HC1, pH 7,4) før avbrudd ved 4 ° C ved ultralydbehandling (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Tyskland) (3 × 1 min). Cellrester ble pelletert ved sentrifugering (13 000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatanten ble overført til en 3,5 ml QS-makrokuvette (10 mm) med en magnetisk omrøringsstang og blandet med 1 ml lysisbuffer. Utryddelse av prøvene ble overvåket ved 412 nm med et Jasco V-650 spektrofotometer utstyrt med PSC-718 temperaturstyrt celleholder (Jasco) ved romtemperatur. 100 μl av en 3 mM ditiobis (2-nitrobenzoesyre) løsning ble tilsatt. Ekstinksjon ble overvåket til den nådde metning. Beregning av tiolkonsentrasjon ble utført ved bruk av utryddelseskoeffisienten e412 for alle = 13 700 M-1 Cm-1 for tio-2-nitrobenzoesyre (TNB). Cellulære tiolkonsentrasjoner ble beregnet ut fra et volum av E. coli-celler på 6,7 x 10-15 liter og en celletetthet av A600 for alle = 0,5 (ekvivalent med 1 × 108 celler ml-1 kultur). (Müller et al., 2016)

In vivo glutathionbestemmelse

E. coli MG1655 ble dyrket i MOPS minimal medium i et totalt volum på 200 ml til en A600 for alle av 0,5 ble nådd. Kulturen ble delt inn i 50 ml kulturer for stressbehandling. Etter 15 min inkubasjon med 0,79 mM allicin, 1 mM diamid eller dimetylsulfoksid (kontroll) ble høstet ved 4 000 g ved 4 ° C i 10 minutter. Celler ble vasket to ganger med KPE-buffer før resuspensjon av pellets i 700 ul KPE-buffer. For deproteinering ble 3001 av 10% (w / v) sulfosalicylsyre tilsatt før forstyrrelse av celler ved ultralydbehandling (3 x 1 min; VialTweeter ultralyd). Supernatanter ble samlet etter sentrifugering (30 min, 13 000 g, 4 ° C). Sulfosalicylsyrekonsentrasjoner ble redusert til 1% ved tilsetning av 3 volumer KPE buffer. Målinger av totalt glutation og GSSG ble utført som beskrevet ovenfor. Cellulære glutationskonsentrasjoner ble beregnet ut fra et volum av E. coli-celler på 6,7×10-15 liter og en celletetthet av A600 for alle 0.5 (ekvivalent med 1×108 celler ml-1 kultur). GSH-konsentrasjoner ble beregnet ved subtraksjon av 2 [GSSG] fra total glutation. (Müller et al., 2016)

Ultralyd forstyrrelser for cellelys og utvinning av biologisk materiale (Klikk for å forstørre!)

Sonde-type ultralydapparat UP400St

Ekspresjon av humant mAspAT i E. coli

Ultralydcelleforstyrrelser UP400St (400W) for ekstraksjon av intracellulær materiale (f.eks. Proteiner, organeller, DNA, RNA etc.)Den enkle koloni av E. coli BL21 (DE3) inneholdt ekspresjonsvektoren i 30 ml Luria-Bertani (LB) medium inneholdende 100 μg / ml ampicillin og dyrket deretter ved 37 ° C til den optiske tetthet (OD600 for alle) nådd 0,6. Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 4000 x g i 10 minutter og resuspendert i 3 l friskt LB-medium inneholdende 100 ug / ml ampicillin.
Deretter ble proteinuttrykk inducert med 1 mM isopropyl-3-l-tiogalaktopyranosid (IPTG) i 20 timer ved 16 ° C. Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 8000 x g i 15 minutter og vasket med buffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Ca. 45 g (våtvekt) celler ble oppnådd fra 3 liter kultur. Etter sentrifugering ble cellepellets resuspendert i 40 ml (i 1 1 kultur) iskold ekstraksjonsbuffer A og lysert ved ultralydbehandling ved iskald temperatur under anvendelse av en UP400St instrument (Dr. Hielscher GmbH, Tyskland). Cellelysen ble sentrifugert ved 12.000 rpm i 15 minutter for å separere oppløselige (supernatant) og utfeltede (pellet) fraksjoner. (Jiang et al. 2015)

Tabellen under gir deg en indikasjon på den omtrentlige prosesseringskapasiteten til våre ultralydapparater:

Batchvolum Strømningshastighet Anbefalte enheter
0.5 til 1,5 ml na VialTweeter
1 til 500 ml 10 til 200 ml / min UP100H
10 til 2000 ml 20 til 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
0.1 til 20L 0.2 til 4l / min UIP2000hdT
10 til 100 liter 2 til 10 l / min UIP4000
na 10 til 100 l / min UIP16000
na større klynge av UIP16000

Kontakt oss! / Spør oss!

Vennligst bruk skjemaet nedenfor hvis du ønsker å be om ytterligere informasjon om ultralyd homogenisering. Vi vil gjerne tilby deg en ultralyd system møte dine behov.









Vær oppmerksom på at Personvernregler.


Litteratur / Referanser



Fakta Verdt å vite

E coli

Escherichia coli (E. coli) er en gram-negativ, valgfritt anaerob, stavformet, coliform bakterie av slekten Escherichia som ofte finnes i nedre tarm av varmblodige organismer (endotermer). Det er et stort antall E. coli-stammer (eller undertyper) med forskjellige egenskaper. De fleste E. coli-stammer er ufarlige for mennesker, f.eks. B- og K-12-stammer som ofte brukes til forskningsapplikasjoner i laboratorier. Noen stammer er imidlertid skadelige og kan forårsake alvorlig sykdom.
E. coli spiller en viktig rolle i moderne bioteknologi og industriell mikrobiologi siden bakteriene er enkle å manipulere. Vanlige laboratorieapplikasjoner som ofte involverer bruk av E. coli, for eksempel å skape rekombinant deoksyribonukleinsyre (DNA) eller å fungere som en modellorganisme.
E. coli er en svært allsidig vert for produksjon av heterologe proteiner, og mangfoldige proteinekspresjonssystemer er tilgjengelige for å produsere av rekombinante proteiner i E. coli. Ved å bruke plasmider som tillater høyt ekspresjon av protein, kan gener innføres i bakteriene, som gjør det mulig å produsere slike proteiner i høye mengder i industrielle fermenteringsprosesser.
E. coli brukes som cellefabrikker til å produsere insulin. Ytterligere anvendelser inkluderer bruk av modifiserte E. coli-celler for å utvikle og produsere vaksiner og immobiliserte enzymer, for å produsere biodrivstoff, så vel som for bioremediering.
Stammen K-12 er en mutant form av E. coli som overtrykker enzymet Alkalisk fosfatase (ALP). Denne mutasjonen oppstår på grunn av en defekt i genet som koder for enzymet konstant. Hvis et gen produserer et produkt uten noen inhibering, er dette kjent som konstitutiv aktivitet. Denne spesifikke mutantformen brukes til isolering og rensing av ALP-enzymet.

Ultrasonisk DNA-skjæring

Ultrasoniske skjærkrafter er en vanlig metode for å skille fra cellen og bryte DNA-strengene i stykker. Akustisk kavitasjon bryter celleveggene og membranene for å ekstrahere DNA fra celler og generere fragmenter på ca. 600 – 800 bp i lengde, som er ideell for analyse.
Klikk her for å lære mer om ultralyd homogenisatorer for DNA-fragmentering!