Hielscher ultralydteknologi

Sonikering lyse: celle avbrudd & Utdrag

Celledisponering eller lysis er en vanlig del av daglig prøvepreparering i bioteknologilaboratorier. Målet med lysis er å forstyrre deler av celleveggen eller den komplette cellen for å frigjøre biologiske molekyler. Det såkalte lysatet kan bestå i f.eks. Plasmid, reseptoranalyser, proteiner, DNA, RNA etc. Følgende trinn i lysis er fraksjonering, organisk isolasjon eller / og proteinutvinning og rensing. Det ekstraherte materialet (= lysat) må skilles og er gjenstand for ytterligere undersøkelser eller anvendelser, f.eks. For proteomisk forskning. Ultralyd homogenisatorer er et vanlig verktøy for vellykket cellelyse. Da ultralydintensiteten kan utjevnes ved å justere prosessparametrene, kan den optimale sonikasjonsintensiteten fra veldig mykt til veldig hardt settes individuelt for hver substans og medium for å oppfylle det spesifikke bruksbehovet.

Cellestruktur

Cellene er beskyttet av en semi-permeabel plasmamembran som består av et fosfoplipid-dobbeltlag (også protein-lipid-dobbeltlag, dannet av hydrofobe lipider og hydrofile fosformolekyler med innebygde proteinmolekyler) og skaper en barriere mellom celleinteriøret (cytoplasma) og det ekstracellulære miljøet. Planteceller og prokaryote celler er omgitt av en cellevegg. På grunn av flere lag tykk cellevegg av cellulose er planteceller vanskeligere å lyse enn dyreceller. Celleinteriøret, slik som organeller, kjerne, mitokondrion, stabiliseres av cytoskelettet.
Ved lysering av cellene er den rettet mot å ekstrahere og separere organeller, proteiner, DNA, mRNA eller andre biomolekyler.

Sonikering brukes vanligvis for prøven utarbeidelse av celle materie.

Fig. 1: Ultralydutvinning fra celler: Den mikroskopiske tverrsnittet (TS) av apikale myntstammen (Mentha piperita) viser virkningsmekanismen under ultralydsekstraksjon fra celler (forstørrelse 2000x) [ressurs: Vilkhu et al. 2011]

metoder

Det finnes flere metoder for lysering av celler, som kan deles inn i mekaniske og kjemiske metoder, som inkluderer bruk av vaskemidler eller løsningsmidler, anvendelse av høytrykk, eller bruk av en perlemølle eller en fransk press. Den mest problematiske ulempen ved disse metodene er den vanskelige kontroll og justering av prosessparametere og derved påvirker.
De viktigste ulempene ved vanlige lysismetoder:

Ulike lysis teknikker

Tabell: Konvensjonelle metoder for cellelys har store ulemper

Tvert imot er sonication et svært effektivt og pålitelig verktøy for celleoppløsning som gir full kontroll over sonikeringsparametrene. Dette sikrer en høy selektivitet ved frigjøring av materialer og produktrenhet. [Balasundaram et al. 2009] Den passer til alle celletyper og er lett å bruke i liten og stor skala. Ultralydene er enkle å rengjøre. En ultralyd homogenisator har alltid CIP (Clean-in-place) og steriliserings-i-stedet-funksjonen (SIP). Sonotroden består av et massivt titanhorn som kan tørkes eller spyles i vann eller løsemiddel (avhengig av arbeidsmediet). Vedlikehold av ultralydmaskiner skyldes deres robusthet, nesten forsømmelig.

lyse

Lysis er en sensitiv prosess. Under lysis blir beskyttelsen av cellemembranen ødelagt, men inaktivering, denaturering og nedbrytning av de ekstraherte proteiner ved et unfysiologisk miljø (avvik fra pH-verdi) må forebygges. Derfor utføres generelt lysis i en bufferløsning. De fleste vanskeligheter oppstår ved ukontrollert celleforstyrrelse som resulterer i en ubegrenset frigivelse av alt intracellulært materiale eller / og denaturering av målproduktet.

Ultralydcellelys kan brukes til prøvepreparering i laboratoriet og for produksjon av store mengder. Klikk for å forstørre!

Fig. 1: 200 watt kraftig ultralyd homogenisator Uf200 ः t med digital kontroll og automatisk dataopptak for pålitelig og reproducerbar cellelyse.

Ultralyd Lysis

Vanligvis vil lysen av prøver i laboratoriet ta mellom 15 sekunder og 2 minutter. Siden intensiteten av sonikering er veldig enkel å justere ved amplitude innstilling av en sonikeringstid så vel som ved å velge riktig utstyr, er det mulig å forstyrre cellemembranen svært forsiktig eller veldig plutselig, avhengig av cellestrukturen og formålet med lysis ( f.eks. DNA-ekstraksjon krever mykere sonikering, komplett proteinutvinning av bakterier krever en mer intens ultralydbehandling). Temperaturen under prosessen kan overvåkes av en integrert temperatursensor og kan lett styres ved kjøling (isbad eller flytceller med kjølejakker) eller ved sonikering i pulserende modus. Under pulsmodus sonikering, tillater korte sonikasjonssprengningssykluser med 1-15 sekunder varighet for varmeavledning og avkjøling i de lengre periodiske perioder.
Alle ultralyddrevne prosesser er helt reproducerbare og lineært skalerbare.

Ultralyd homogenisator VialTweeter for samtidig prøveberedning av opptil 10 reagensrør. (Klikk for å forstørre!)

Ultralydsenheten VialTweeter muliggjør samtidig prøveutarbeidelse av opptil 10 hetteglass under samme prosessbetingelser.

Ultralyd Homonise

Ulike typer Ultralydsenheter tillate å tilpasse prøveforberedelsesmålet og for å sikre brukervennlighet og driftskomfort. Sonde-ultrasonicatorer er de vanligste enhetene i laboratoriet. De er mest egnet for fremstilling av små og mellomstore prøver med volum på 0,1 ml til 1000 ml. Ulike kraftstørrelser og sonotroder gjør det mulig å tilpasse ultralydapparatet til prøvevolumet og fartøyet for de mest effektive og effektive ultralydresultatene. Ultralydsensoren er det beste valget når enkeltprøver må utarbeides.

Hvis flere prøver må tilberedes, f.eks. 8 hetteglass med celleoppløsning, er enheter som VialTweeter eller en ultralyd cuphorn den mest egnede homogenisatoren for lysis. Flere hetteglass blir sonicated samtidig, med samme intensitet. Dette sparer ikke bare tid, men sikrer også samme behandling av alle prøver, noe som gjør resultatene blant prøvene pålitelige og sammenlignbare. Videre unngås kryssforurensning ved å senke ultralydsonotroden (også kjent som ultralydssonde, horn, spiss eller finger). Siden hetteglass brukes, blir tidskrevende opprydding og prøvetap på grunn av dekantering av fartøy utelatt.
For høyere volumer, for eksempel for kommersiell produksjon av celleekstrakter, er kontinuerlige ultralydsystemer med en strømningscellereaktor mest egnet. Den kontinuerlige og jevnstrømmen av det bearbeidede materialet sikrer en jevn lydbehandling. Alle parametere i ultralydsoppløsningen kan optimaliseres og tilpasses kravene til applikasjonen og det spesifikke cellematerialet.

Eksempler på fremgangsmåte for ultralydlyse av bakterielle celler:

  • Klargjøring av cellesuspensjon: Cellpellets må fullstendig suspenderes i en bufferløsning ved homogenisering (velg bufferoppløsningen kompatibel med følgende analyse, f.eks. Spesifikk kromatografis metode). Tilsett lysozym og / eller andre tilsetningsstoffer, om nødvendig (de må også være kompatible med separasjons / rensemiddel). Bland / homogeniser løsningen forsiktig under mild sonikasjon til fullstendig suspensjon oppnås.
  • Ultralyd lysis: Plasser prøven i et isbad. For celleforstyrrelser, sonikere suspensjonen ved 60-90 sekunders utbrudd (ved hjelp av ultrasonicatorens pulsmodus).
  • Separasjon: Sentrifuger lysatet (f.eks. 10 minutter ved 10.000 xg, ved 4degC). Separat supernatanten fra cellepellet forsiktig. Supernatanten er det totale cellelysatet. Etter filtrering av supernatanten får du en klarert væske av det løselige celleproteinet.

De vanligste bruksområder for ultralydmaskiner i biologi og bioteknologi er:

  • Fremstilling av cellekstrakt
  • avbrudd av gjær, bakterier, planteceller, myk & hardcellevev, nukleins materiale
  • Proteinekstraksjon
  • Forberedelse og isolering av enzymer
  • Produksjon av antigener
  • DNA-ekstraksjon og / eller målrettet fragmentering
  • liposompreparat
Ultralydhomogenisatorer med høy effekt, som UIP1000hd, brukes til celleforstyrrelse og -utvinning i batch- eller kontinuerlig strømnings-modus. (Klikk for å forstørre!)

Ultralydbenchtop systemer som UIP1000hd (1kW) kan behandle større mengder biologisk materiale.

De forskjellige applikasjonene til ultralyd utvider seg i sektorer av bioteknologi, bioteknologi, mikrobiologi, molekylærbiologi, biokjemi, immunologi, bakteriologi, virologi, proteomikk, genetikk, fysiologi, cellulærbiologi, hematologi og botanikk.

For evaluering og optimalisering av kundenes applikasjoner tilbyr Hielscher Ultrasonics et fullt utstyrt utstyr Ultralyd Process Laboratory. Ta kontakt for mer informasjon!

Litteratur / Referanser

  • Balasundaram, B .; Harrison, S .; Bracewell, DG (2009): Fremskritt i strategier for produktutgivelse og innvirkning på bioprosessdesign. Trender i bioteknologi 27/8, 2009. s. 477-485.
  • Vilkhu, K .; Manasse, R .; Mawson, R .; Ashokkumar, M. (2011): Ultralydgjenoppretting og modifisering av matrediensene. I: Feng / Barbosa-Cánovas / Weiss (2011): Ultralydteknologi for mat og bioprosessering. New York: Springer, 2011. s. 345-368.

Kontakt oss / be om mer informasjon

Snakk med oss ​​om dine krav til behandling. Vi vil anbefale de mest egnede oppsett- og behandlingsparametrene for prosjektet ditt.





Vær oppmerksom på at Personvernregler.