Hielscher ultralydteknologi

Ultrasonisk DNA-skjæring

  • Under DNA- og RNA-skjæring brytes DNA-molekyler i mindre stykker. DNA / RNA-fragmentering er en av de viktige prøveprep-trinnene som kreves, og oppretter biblioteker for neste generasjons sekvensering (NGS).
  • Ultrasonisk DNA-skjæring bruker kreftene til akustisk kavitasjon for å bryte DNA eller RNA i stykker på 100 – 5kb BP.
  • Ultralydskjæring muliggjør nøyaktig DNA-fragmentering og tilpasning til ønsket DNA-lengde.

 

Ultrasonisk DNA-skjæring

Hielscher Ultrasonics tilbyr ulike ultralydbaserte løsninger for DNA, RNA og chromatin skjæring. Velg mellom ultralydkondensatorer (f.eks. UP100H) for direkte sonikering ved hjelp av en mikrotip, eller bruk VialTweeeter eller ultralyd cuphorn for indirekte DNA-fremstilling av ulike prøver samtidig. Hielscher tilbyr den ideelle enheten som vurderer dine behov: om du har 1 eller opptil 10 prøver, volumer fra mikroliter til liter volumer – Hielscher ultralydprosessorer er tilgjengelige for å tilfredsstille dine krav til å forberede DNA, RNA og kromatinfragmenter på riktig lengde. Reproducerbarhet, enkel betjening og presis kontroll muliggjør et pålitelig bibliotek for neste generasjons sekvensering.
I motsetning til enzymatisk DNA-fragmentering, bruker ultralydskjæring rene mekaniske skjærkrafter uten å legge til noen kjemikalier. Ved den nøyaktige innstillingen av prosessparametere, produserer ultralydskjæringen DNA-fragmenter med høy molekylvekt (plasmid og genomisk DNA).
Rensede nukleinsyrer kan amplifiseres før eller etter et fragmenteringstrinn.
Sonikeringsparametere (effekt, puls syklus / utbrudd, tid og temperatur) kan styres trygt via programvareinnstillinger.

Fordeler:

  • presis kontroll
  • sonikasjonssykluser og tid som nettopp kan tilpasses til ønsket DNA-størrelse
  • DNA-fragmenter med høy molekylvekt
  • temperatur kontroll
  • Fort
  • reproduserbare resultater
  • autoklaverbar
  • ulike løsninger: Sonde-type, VialTweeter og Cuphorn

Protokoller for ultralyd DNA-skjæring

For kromatinimmunpresipitasjonsanalyse

Kort sagt ble celler plettet i 60 mm diameter retter (400 000 per fat) og transfektert med RhoA siRNA (som beskrevet); etter 72 timer ble de inkubert med formaldehyd (sluttkonsentrasjon, 1%) i 10 minutter ved 37 ° C til tverrbindingsproteiner til DNA. Tverrbindingsreaksjonen ble slukket ved tilsetning av en tiende volum på 1,25 mol / L glycin, hvilket ga 125 mmol / l sluttkonsentrasjon. Celler ble vasket to ganger med iskald PBS, resuspendert i radioimmunprecipitasjonsanalysebuffer [150 mmol / l NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksycholat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HC1 )] inneholdende 1 mmol / 1 fenylmetylsulfonylfluorid, 1 Ag / ml aprotinin og 1 Ag / ml pepstatin A og holdt på is i 30 minutter. Deretter ble cellelysater sonikert på is med a Hielscher UP200S ultralyds sonikator (3 x 40 s, amplitude 40%, syklus 1, Hielscher Ultrasonics GmbH) til tverrbundne kromatiner ble skåret for å gi DNA-fragmenter mellom 200 og 1000 bp. En tiende hel lysat ble brukt til å kvantifisere mengden av DNA som er tilstede i forskjellige prøver og betraktet som “totalt inngangsd DNA”. Supernatanter ble inkubert med laksesperma DNA / protein-agarose-50% oppslemming for å redusere uspesifikk bakgrunn. Immunutfelling ble deretter gjort over natten ved 4 ° C med 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) eller uten antistoff (negativ kontroll). Disse supernatanter ble tilsatt med 5 mol / l NaCl og oppvarmet over natten ved 65 ° C for å reversere protein-DNA-kryssbindinger. Immunkompleksene ble ytterligere behandlet med DNase- og RNase-fri proteinase K, og DNA ble renset ved fenol / kloroformekstraksjon og etanolutfelling. PCR ble utført med spesifikke primere svarende til en sekvens innenfor promotorområdet av det humane iNOS-genet (p1-primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-primer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-ekspresjonsstudier

For ekspresjonsstudier ble rekombinant stamme L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Tyskland) med genet for EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), kromosomalt ssu integrert, dyrket i de forskjellige media som beskrevet tidligere og I tillegg suppleres med 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Tyskland). Under dyrking ble 1 ml prøver tatt, sentrifugert (2000 x g, 20 ° C, 10 min) og vasket med 0,9% NaCl-oppløsning. Pellet ble resuspendert i buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) og disintegrert ved sonifisering med ultralydprosessoren UP400S (påføring av energi ~ 400 Ws). Cellrester ble fjernet ved sentrifugering (6000 x g, 4 ° C, 5 min) og analysert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under reduserende betingelser ifølge metoden fra Laemmli (1970) med 12,5% polyakralamidgeler . EGFP-ekspresjon ble undersøkt i omrørt kultur. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H ble brukt til å forberede EHEC DNA for chip array analyse

Elektroforetiske analyser av genomisk DNA av E. coli EDL933 utsatt for 0-15 min ultralydbehandling. L indikerer DNA-stigen. (Basselet et al., 2008)

Informasjonsforespørsel




Merk våre Personvernregler.


Kromatinimmunutfelling

Ultralydcelleforstyrrelser UP100H (100W) for lysis, celleforstyrrelse og DNA-skjæring.Kromatinimmunutfallsprøven ble utført under anvendelse av ChIP-ITTm Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner med noen endringer. Kort fortalt ble differensierte humane podocytter kryssbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket med iskald PBS og fikseringsreaksjonen ble stoppet ved å tilsette 0,125 M glycin i 5 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket igjen med iskald PBS og skrapt fra parabolen. Celler ble pelletert ved sentrifugering og resuspendert i lyseringsbufferen. Etter sentrifugering ble pelleterte kjerner resuspendert i skjæringsbufferen, inkubert på is i 30 minutter og kromatinet ble skjæret ved sonikering, f.eks. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Tyskland) ved 25% kraft 5 pulser på 20 sek hver på is i fragmenter på omtrent 200-600 bp. Den kuttet kromatin ble deretter sentrifugert og supernatanten ble oppsamlet. For immunutfelling ble 60 μl kromatin inkubert med 1 ug Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-KB p65 (Abcam, Cambridge, UK) eller NF-KB p50 (Abcam) antistoffer eller med kanin IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), som en negativ kontroll, over natten ved 4 ° C med forsiktig rotasjon. Immunokomplekser bundet til magnetiske perler ble samlet under anvendelse av et magnetisk stativ, vasket omfattende, og protein / DNA-tverrbindingene ble reversert og DNA eluert for sanntids-PCR-analyse. (Ristola et al., 2009)

EHEC DNA forberedelse for chip array analyse

Arrangement av cellelysater og ekstraherte DNAer
Bakterielle pellets suspendert i PBS til ønsket sluttkonsentrasjon ble behandlet med ultralydforstyrrelser UP100H (Hielscher GmbH, Tyskland) utstyrt med en mikrotip MS1 (1 mm i diameter). Operasjonsfrekvensen var 30 kHz og effektiv utgangseffekt var 100 W. Under operasjonen ble prøver avkjølt i et isvannbad, blandet og sentrifugert. Prøver ble benyttet for strømningscytometri-studier, mens for senere håndtering ble prøver utsatt for en varmebehandling (95 ° C, 5 min). De urene cellelysater ble behandlet med en blanding av fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1). Et likeverdig volum av denne blandingen ble tilsatt til lysatprøven, løsningen ble vortexet kraftig i 15 s og sentrifugert ved 15 000 xg i 2 min ved romtemperatur (RT) rundt 22 ° C. Den øverste vandige fase inneholdende det genomiske DNA ble forsiktig separert og oppsamlet i et nytt sterilt Eppendorf-rør.
Deretter ble prøver sonicated for å fragmentere DNA. Sonikeringstrinnet ble realisert under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. For å evaluere fragmenteringseffekter på det genomiske DNA ble prøver analysert ved anvendelse av agarosegelelektroforese.
(…) Prøver sonikert tidligere i 2,5 min ble utsatt for et ekstraksjonstrinn etter varmebehandling og sentrifugering. DNA frigjort ble ekstrahert to ganger med en fenol: kloroform: isoamylalkoholblanding, og etterpå utsatt for andre sonikering i 0-15 min. Agarose gelelektroforese ble brukt til å bestemme størrelsesfordelingen av DNA utsatt for ultralyd fragmentering etter utvinning (Fig. Øverst til høyre). Meget fragmentert DNA var tydelig ut fra nærværet av et DNA-smear i stedet for høymolekylære bånd som ble eliminert fra prøver sonicert i 2,5 minutter eller lenger. Lengre sonikering reduserte gradvis fragmentlengder til ca. 150-600 bp, og sonikering i 15 min forringet disse fragmentene ytterligere, som det ses mest av smørets øvre del. Således ble den gjennomsnittlige DNA-fragmentstørrelsen gradvis redusert med ultralydetid og 5 minutters behandling tillatt å oppnå størrelsene av DNA-fragmenter som var mest egnede for chip-array-analyser. Til slutt ble DNA-analysepreparasjonsprosedyren som innbefattet første 2 min ultralydbehandling, DNA-ekstraksjon (2 x) og etterfølgende 5 minutters sonikering, etablert. (Basselet et al., 2008)

Kromatinimmunutfelling (ChIP)

Ultralydprosessor UP100H for DNA, RNA og kromatinklipping. (Klikk for å forstørre!)HEK293-celler ble dyrket som beskrevet ovenfor og fiksert med 2 mM disuccinimidylglutarat i 45 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS. Kromatin ble kryssbundet i 10 minutter ved romtemperatur ved bruk av 1% (volum / volum) formaldehyd og vasket to ganger med iskald PBS. Tverrbindingsreaksjonen ble stoppet ved inkubering med glycin ved en sluttkonsentrasjon på 0,125 M i 5 min ved romtemperatur. Etter inkubering med trypsin ble cellene skrapt fra cellekulturretten og vasket to ganger med PBS. Cellepellet ble resuspendert i lysebuffer (5 mM rør, pH 8,0, 85 mM KCl og 0,5% (vol / vol) Nonidet P-40), inkubert på is i 10 minutter og homogenisert med en Dounce-homogenisator. Deretter ble kjerne pelletert ved sentrifugering (3500 xg, 5 min, 4 ° C) og resuspendert i nukleibuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA og 1% (vekt / volum) SDS). Nuklear ble forstyrret av sonikering med tre 20 s pulser i a UP50H sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) ved en innstilling av syklus 0,5 og amplitude 30%, hvilket gir genomiske DNA-fragmenter med en bulkstørrelse på 200-1000 bp. For ChIP ble 50 g DNA fortynnet 4 ganger i immunpresipitationsbuffer (16,7 mM Tris-HC1, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (vol / vol) Triton X-100 og 0,01% v) SDS). (Weiske et al., 2006)

Histon-modifikasjonsanalyse ved kromatinimmunutfelling (ChIP)

Kort, 6 x 106 celler ble vasket to ganger med PBS og kryssbundet på kulturplaten i 15 minutter ved romtemperatur i nærvær av 0,5% formaldehyd. Tverrbindingsreaksjonen ble stoppet ved å tilsette 0,125 M glycin. Alle etterfølgende trinn ble utført ved 48 ° C. Alle buffere ble forkjølt og inneholdt proteaseinhibitorer (Complete Mini, Roche). Celler ble vasket to ganger med PBS og deretter skrapt. Samlede pellets ble oppløst i 1 ml lysisbuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) og sonikert i et kaldt etanolbad i 10 sykluser ved 100% amplitude ved anvendelse av en UP50H sonikator (Hielscher, Teltow, Tyskland). Kromatinfragmentering ble visualisert i 1% agarosegel. Oppnådde fragmenter var i 200-500pb rekkevidde. Oppløselig kromatin ble oppnådd ved sentrifugering av de sonikerte prøver ved 14 000 g i 10 minutter ved 48 ° C. Den oppløselige fraksjon ble fortynnet 1/10 i fortynningsbuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) deretter alikvotert og lagret ved 80 ° C til bruk. (Rodriguez et al., 2008)

Enhet Strøm [W] Type Volum [ml]
VialTweeter 200 for alle frittstående 00,5 1,5 for alle
UP50H 50 for alle håndholdt eller standmontert 00,01 250 for alle
UP100H 100 for alle håndholdt eller standmontert 00,01 500 for alle
Uf200 ः t 200 for alle håndholdt eller standmontert 0.1 1000 for alle
UP200St 200 for alle standmounted 0.1 1000 for alle
UP400St 400 for alle standmounted 5,0 for alle 2000 for alle
Cuphorn 200 for alle CupHorn, sonoreactor 10 200 for alle
GDmini2 200 for alle forurensningsfri strømningscelle

Informasjonsforespørsel




Merk våre Personvernregler.


Hielscher's VialTweeter er det samme for samtidig forberedelse av flere prøver

VialTweeter for ultralydprøveprep

Kontakt oss! / Spør oss!

Be om mer informasjon

Vennligst bruk skjemaet nedenfor hvis du ønsker å be om ytterligere informasjon om ultralyd homogenisering. Vi vil gjerne tilby deg en ultralyd system møte dine behov.









Vær oppmerksom på at Personvernregler.


Litteratur / Referanser

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Prøvebehandling for DNA-chip-arraybasert analyse av enterohemoragisk Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA-silencing gjengir resistansen mot doxorubicin i humane kolonkreftceller. Molecular Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): Metode evaluering av Fusarium DNA-ekstraksjon fra mycelia og hvete for nedstrømning i sanntid PCR-kvantifisering og korrelasjon til mykotoksinnivåer . Journal of Microbiological Methods 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Karakterisering av vekstegenskapen til Leishmania tarentolae - et nytt uttrykkssystem for rekombinante proteiner. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem MA, Mathieson PW, walisisk GI, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulering av Neph3-genet i podocytter - nøkkelroller av transkripsjonsfaktorer NF-KB og Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado MA (2008): Gjennomgående sporing av ikke-metylerte DNA-Alu-gjentagelser i normale og kreftceller. Nucleic Acids Research Vol. 36, nr. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): Histidin Triad Protein Hint1 Utløser Apoptose Uavhengig av Enzymatisk Aktivitet. Journal of Biological Chemistry. Vol. 281, nr. 37, 2006. 27356-27366.


Fakta Verdt å vite

Ultralyd / akustisk kavitasjon skaper svært sterke krefter som fremmer krystalliserings- og nedbørsprosessene (Klikk for å forstørre!)

Ultrasonisk DNA-skjæring er basert på akustisk kavitasjon og dens hydrodynamiske skjærkrafter