Ultrasone productie van hooggezuiverde Schizophyllan β-Glucanen

Schizofyallan is een schimmelhoudend β-glucaan met immunomodulerende eigenschappen. Voor een zeer actieve medicinale werking moet schizofyllan een laag molecuulgewicht hebben om een betere biologische beschikbaarheid te krijgen. Het is bewezen dat ultrasoonisering het molecuulgewicht van schizofyllan kan verlagen. Als betrouwbare en doeltreffende methode kan sonicatie gemakkelijk worden toegepast voor de productie van schizofyllan met een laag molecuulgewicht.

Schizophyllum Paddenstoelen

Soorten van de Schizophyllum paddestoel groeien in de natuur op rottende bomen na het regenseizoen. De vruchtlichamen worden in het daaropvolgende droge seizoen verzameld. Schizophyllum soorten zijn rijk aan biochemische verbindingen zoals glucanen en worden daarom vooral in tropische landen geconsumeerd als voedsel en medicijn. Wegens haar immunomodulerende, schimmelwerende, antineoplastische en antivirale eigenschappen heeft Schizophyllum commune, ook bekend als Splitgill mushroom, biotech- en farmaceutische bedrijven aangetrokken.
Het polysacharide schizofyllan, ook bekend als sizofiran, sonifilan of sizofilan, is het belangrijkste β-glucaan dat wordt aangetroffen in Schizophyllum-paddenstoelen, die het zeer werkzame bioactieve β-glucaan schizofyllan bevatten.
Schizophyllum commune paddestoelen groeien in de natuur op bomen, het mycellium kan ook worden gekweekt in fermentatiebouillon. Voor farmaceutische en cosmetische toepassingen is schizofyllan met een laag molecuulgewicht veel doeltreffender dan schizofyllan met een hoog molecuulgewicht. Dit is te danken aan het feit dat schizofyllan met een laag molecuulgewicht een aanzienlijk betere biologische beschikbaarheid en absorptiesnelheid heeft. Bovendien levert schizofyllan met een hoog molecuulgewicht vaak problemen op bij toepassingen, omdat het leidt tot een hoge viscositeit van de waterige oplossingen.
Ultrasone verkleining is een zeer doeltreffende en betrouwbare techniek om het molecuulgewicht van schizofyllan te verlagen en zo de kwaliteit van de β-glucaanmolecule te verhogen.

Protocol voor de productie van laag-moleculairgewicht schizofyllan

Aangezien schizofyllan met een molecuulgewicht drastisch betere biologische beschikbaarheid en toepassingseigenschappen vertoont, onderzocht het onderzoeksteam van Smirnou ultrasoonbehandeling voor splitsing en verkleining van de β-glucaanmolecule schizofyllan.

Ultrasoonbehandeling van Schizophyllan

β-1.3(1.6)-Glucan schizophyllan (SPG) werd geproduceerd door de submerse kweek van S. commune fungus in bioreactor met sucrose als substraat.
Na afloop van de kweek werd de kweekbouillon met gedemineraliseerd water verdund tot een schizofylanconcentratie van 2 g/L en werd ultrasoon met de Ultrasone Bewerker UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Duitsland) in de recycle-modus bij de volgende parameters en omstandigheden: mediumdebiet 50 ml/s, frequentie 20 kHz, vermogen 2000 W, sonotrode type BS2d22, booster type B2-1.4 en amplitude 100%. De temperatuur van de kweekbouillon bij het begin van de sonicatie was 25°C. De geultrasoneerde kweekbouillon (specifieke energie-input 100 Ws/mL) werd onder een druk van 1,5 bar bij 40°C gefiltreerd over een Seitz HS800 dieptefilter. Het ultrasoon behandelde schizofyllan (uSPG) voor chemische karakterisering werd uit het filtraat geprecipiteerd met een drievoudige hoeveelheid isopropylalcohol bij laboratoriumtemperatuur, en gedroogd bij 60°C gedurende 12 uur. uSPG-oplossingen voor immunologisch onderzoek werden als volgt bereid: (1) het door ultrasoonbehandeling verkregen kweekbouillonfiltraat werd gediafiltreerd over een 0,1m2 Pall Centramate T-serie PES-cassette (cut-off 100 kDa) bij 0,8 bar en de diafiltratie werd voortgezet tot het geleidingsvermogen van het retentaat 20 μS/cm bedroeg; (2) de oplossing werd door diafiltratie geconcentreerd tot een uSPG-concentratie van 1 g/L en gesteriliseerd door autoclaveren bij 120°C/20 min. Gedenatureerd uSPG werd op soortgelijke wijze bereid, behalve dat NaOH in een concentratie van 0,2 M aan het kweekbouillonfiltraat werd toegevoegd en de gealkaliseerde oplossing vóór de diafiltratie gedurende 30 min bij laboratoriumtemperatuur werd geïncubeerd.

Analytische methoden

De opbrengst aan mycelium werd gravimetrisch bepaald: kweekbouillon werd verdund met water 1:4, gecentrifugeerd op 10000 × g bij 25°C gedurende 20 min, het neerslag werd gewassen met driemaal zoveel water, gedroogd bij 60°C en gewogen. Schizofyllan werd uit het supernatans geprecipiteerd met een drievoudige hoeveelheid isopropylalcohol, gedroogd bij 60°C gedurende 24 uur en de opbrengst werd gravimetrisch bepaald. pO2 in de kweekbouillon werd gemeten met een optische sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Zwitserland).
De dynamische viscositeit van de kweekbouillon werd gemeten op HAAKE Visco Tester 6L met spindels 1L en 2L bij 4°C en een rotatiesnelheid van 30 omwentelingen per minuut. De filtratiesnelheid werd berekend aan de hand van de filtratietijd van 500 ml kweekbouillon door een 200 × 200 mm Seitz HS800 (Pall, USA) dieptefilter bij 1,5 bar druk en 40°C.
Het molecuulgewicht van uSPG werd gemeten door SEC-MALLS op het HPLC-systeem Alliance (Waters) met in serie geschakelde PL aquagel OH60- en PL aquagel OH40-kolommen, en de detector miniDAWN TREOS (Wyatt) werd geconcentreerd door diafiltratie tot een uSPG-concentratie van 1 g/L en gesteriliseerd door autoclaveren bij 120°C/20 min. Gedenatureerd uSPG werd op soortgelijke wijze bereid, behalve dat NaOH in een concentratie van 0,2 M aan het kweekbouillonfiltraat werd toegevoegd en de gealkaliseerde oplossing vóór de diafiltratie gedurende 30 min bij laboratoriumtemperatuur werd geïncubeerd.

resultaten:
De ultrasoonbehandeling werd rechtstreeks toegepast op S. commune 144-h kweekbouillon met mycelium om de verwerking van SPG stroomafwaarts te vergemakkelijken.
Kenmerken van gekonfijte Schizophyllan: Ultrasoon schizofyllan (uSPG) werd uit het kweekbouillusfiltraat geprecipiteerd met alcohol en gekarakteriseerd. SEC-MALLS schatte het Mw van uSPG op ongeveer 1 MDa. Het gemiddelde molecuulgewicht van schizofyllan uit vloeibare fermentatie is ongeveer 5 MDa, terwijl het in vaste toestand kan oplopen tot 10 MDa. Wanneer het molecuulgewicht van schizofyllan dat met ultrasoon is behandeld, wordt vergeleken met het molecuulgewicht van onbehandeld, natief schizofyllan, kan een 5- tot 10-voudig lager molecuulgewicht als gevolg van de ultrasoonbehandeling worden waargenomen.
De gesoniceerde polysaccharide uSPG bevatte 0,7%w/w eiwit en 1,0%w/w residu na ontsteking. uSPG hydrolysaat bestond uit glucose met meer dan 99%. De analyseresultaten wijzen erop dat sonicatie de β-glucaan ruggengraat willekeurig splijt en dat de zijtakken intact blijven, waardoor de grootte en het molecuulgewicht van schizofyllan afnemen. Immunologische studies op hoofdzakelijk eiwit- en endotoxinevrij uSPG toonden aan dat met ultrasoon behandeld schizofyllan met laag Mw een uitgesproken immunomodulerende activiteit heeft.

Verminderde viscositeit: Ultrasoonbehandeling resulteerde in een significante afname van de viscositeit van de kweekbouillon. Tijdens ultrasonatie veranderde de viscositeit van de kweekbouillon op niet-lineaire wijze: de viscositeitsafname was snel aan het begin van ultra-sonicatie, maar vertraagde later. Specifieke energie-input 100 Ws/mL was voldoende om de viscositeit van de kweekbouillon bijna 7 keer te verlagen.

Verbeterde filtratie: De met ultrageluid behandelde kweekbouillon stroomde sneller door het filter dan de onbehandelde kweekbouillon (specifieke energie-input 0 Ws/mL) met hoogmoleculaire SPG. Bovendien verminderde ultrasoonbehandeling het productverlies tijdens de filtratie aanzienlijk. Het filtraat van onbehandelde kweekbouillon met hoogmoleculaire SPG (specifieke energie-input 0 Ws/mL) bevatte 0,3 ± 0,07 g/L SPG, terwijl de SPG-concentratie vóór dieptefiltratie 2 g/L was. Daarentegen bevatte het filtraat van de met ultrasoonbehandeling van 100 Ws/mL behandelde kweek beide SPG in een concentratie van 2,2 ± 0,2 g/L, wat overeenkomt met bijna nul productverlies.

Conclusie: In hun conclusie stelt het onderzoeksteam dat ultrasone verwerking een efficiënte technologie is voor de productie van schizofyllan met een laag moleculair gewicht, dat vervolgens kan worden gebruikt in cosmetica en medicijnen. Ultrasoonbehandeling, wanneer toegepast op een volledige kweekbouillon met mycelium, brengt bepaalde voordelen met zich mee voor de productie van schizofyllan. Het vermindert productverliezen tijdens de downstream-verwerking en maakt de productie van zeer gezuiverd polysaccharide mogelijk dankzij een efficiënt gebruik van ultrafiltratie.
Bovendien stelden de onderzoekers vast dat de ultrasone verwerking van schizofyllan gemakkelijk schaalbaar is. Eén eenheid van de ultrasone desintegrator UIP2000hdT van de proeffabriek verwerkte 1 liter kweekbouillon in 110 s in flow-modus. De productiviteit van het systeem kan gemakkelijk worden verhoogd door sequentiële aansluiting van extra ultrasone eenheden.

Ultrasone apparatuur met hoge prestaties voor de verwerking van schimmelglucaan

De fragmentatie van polysacchariden zoals glucanen en andere bioactieve verbindingen zoals chitine en chitosan kan op betrouwbare wijze worden verwerkt met de hoogwaardige ultrasoonapparatuur van Hielscher. Onze ultrasoonapparatuur kan hoge amplitudes leveren, biedt nauwkeurige controle over de procesparameters en kan 24/7 onder zware belasting en in veeleisende omgevingen worden gebruikt. De apparatuur van Hielscher Ultrasonics voldoet op betrouwbare wijze aan deze eisen. Naast uitstekende ultrasoonprestaties bieden Hielscher ultrasoonapparatuur een hoge energie-efficiëntie, wat een belangrijk economisch voordeel is – vooral bij grootschalige commerciële productie.
Hielscher ultrasoonapparaten zijn krachtige systemen die kunnen worden uitgerust met accessoires zoals sonotrodes, boosters, reactors of flowcellen om optimaal aan uw procesbehoeften te voldoen.Met een digitaal kleurendisplay, de mogelijkheid om vooraf sonicaties in te stellen, automatische gegevensregistratie op een geïntegreerde SD-kaart, bediening via een browser op afstand en nog veel meer functies, zijn de hoogste procesbeheersing en gebruiksvriendelijkheid gegarandeerd. In combinatie met robuustheid en zware belastbaarheid zijn Hielscher ultrasoon systemen uw betrouwbare werkpaard in de productie.De reductie van het moleculaire gewicht van β-glucanen zoals schizofyllan vereist krachtig ultrageluid om de doelgerichte splitsing te verkrijgen en een eindproduct van hoge kwaliteit te verkrijgen, dat kan worden gebruikt voor farmaceutische toepassingen.

Onderstaande tabel geeft een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasonicators: