ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर नमूनाहरूको अल्ट्रासोनिक Lysis

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर व्यापक प्रयोगशालामा मोडेल जीवको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। त्यसकारण, पूर्व विश्लेषणात्मक तयारी चरणहरू जस्तै कि लीसिस, सेल अवरोध, प्रोटीन निकासी र ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर नमूनाहरूको डीएनए शियरिंग बारम्बार गरिनु पर्छ। अल्ट्रासोनिक डिसेम्बेटरहरू भरपर्दो र दक्ष छन् र अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया प्यारामिटरहरू समायोजन गरेर सहज रूपमा लीसिस, प्रोटीन निकासी वा डीएनए फ्रेगमेन्टेसन जस्ता विभिन्न कार्यहरू गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ। अल्ट्रासोनिक होमोजिनाइजर्स अनुप्रयोगको फराकिलो दायराको साथ लचिलो उपकरणहरू छन्।

अल्ट्रासोनिक Lysis र प्रोटीन निकासी

जैविक प्रयोगशालाहरूमा अल्ट्रासोनिक विच्छेदनकर्ताहरूको लागि लीसिस, सेल घुलनशीलता, टिशू होमोजिनाइजेसन र प्रोटीन निकासी विशिष्ट कार्यहरू हुन्। अल्ट्रासोनिक डिसेम्बेटर र सेल अवरोधकहरू पशुको ऊतकों, कीराहरू (जस्तै, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, सी। एलिगन्स) वा बिरूवा नमूनाहरूको समरूप गर्न उपयुक्त छन्। अल्ट्रासोनिकेसनको पछिको अनुप्रयोगहरू सेल निलम्बन र गोलीहरूको साथसाथै इंट्रासेलुलर प्रोटीनहरूको निकासी हो।
अल्ट्रासोनिक lysis र प्रोटीन निकासी अत्यधिक विश्वसनीय र प्रजनन प्रक्रिया हो, जो स्थापित प्रोटोकलको आधारमा प्रदर्शन गर्न सकिन्छ। चूंकि अल्ट्रासोनिक प्रक्रियाको तीव्रता Sonication प्यारामिटरहरू जस्तै आयाम, चक्र / नाडी मोड, तापक्रम र नमूना भोल्युम मार्फत ठीकसँग समायोजित गर्न सकिन्छ, एक पटक प्रमाणित प्रोटोकॉल बारम्बार दोहोर्याउन सकिन्छ समान परिणामको साथ र अधिकमा।

अल्ट्रासोनिक डीएनए र आरएनए फ्रेगमेन्टेसन

सेल लीसीस र प्रोटीन निकासी पछि, नमूना तयारीको लागि आवश्यक पर्ने सामान्य कदम भनेको डीएनए, आरएनए, र क्रोमेटिनको कपाल तथा विखंडन हुन्छ, जस्तै क्रोमैटिन इम्युनोप्रिसिपिटेशन (चिप) अघि। डीएनए र आरएनए विखंडन शारीरिक शक्तिहरु द्वारा एक साथ DNA पकड कोभ्लान्ट बन्धन तोडेर भरपर्दो हासिल गर्न सकिन्छ। सोनिकेशन जस्ता शारीरिक कपालको प्रयोग गरेर, पहिले सुरुमा डीएनए किनारा बिग्रन्छ, त्यसपछि डीएनए सानो टुक्रा हुन्छ।
अल्ट्रासोनिक डीएनए विखंडन एक लक्षित लम्बाइ, जस्तै 500००bp (आधार जोडी) मा DNA कपालमा विश्वसनीय र कुशल छ। अल्ट्रासोनिक डीएनए विखंडन को प्रमुख लाभहरु मा अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया प्यारामिटर र तीव्रता को सटीक नियन्त्रण समावेश छ। अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया प्यारामिटरहरू Sonication तीव्रता, चक्र र ठीक समय ट्यूनिंग द्वारा समायोजित गर्न सकिन्छ। यसले चाहेको डीएनए आकारहरू सिर्जना गर्न सम्भव बनाउँदछ र लक्षित डीएनए लम्बाई विश्वसनीयताका साथ पुन उत्पादन गर्न सकिन्छ। अल्ट्रासोनिक डीएनए शियरिंग उच्च आणविक तौल DNA टुक्रा बनाउन को लागी पनि आदर्श छ।

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टरको अल्ट्रासोनिक विश्लेषणको लागि प्रोटोकोलहरू

तल तपाईले अल्ट्रासोनिक-सहयोगी lysis, प्रोटीन निकासी, र DNA वा Droophila नमूना को क्रोमेटिन विखंडन को लागी बिभिन्न प्रोटोकल पाउन सक्नुहुन्छ।

क्रस लिंक गर्ने इम्यूनोप्रिसिपिटेशन (सीएलआईपी) परख को लागि अल्ट्रासोनिक Lysis

CLIP परख प्रदर्शन गरिएको थियो केहि पहिले परिमार्जन सहित रिपोर्ट गरिएको थियो। ०- देखि १-दिन पुरानो वन्य-प्रकारका महिलाहरुमा लगभग २० मिलिग्रा अंडाशयहरू UV क्रसलिंक्ड (× × २००० μJ / सेमी २) थियो, १ एमएल आरसीबी बफरमा बरफमा सजिएको (m० एमएम HEPES पीएच .4..4, २०० mM NaCl, २. m mM MgCl2, ०.१% Triton X-100, २ m० MM Sucrose, १ mM DTT, १ × EDTA-free पूरा प्रोटीज इनहिबिटरहरू, १ mM PMSF) U०० U RNAseOUT को साथ पूरक र min० मिनेटको लागि बरफमा राखिन्छ। होमोजेनेट बरफमा सोनिकेट गरिएको थियो, %०% पावरमा, २० पटकमा पाँच चोटि हिल्सचर अल्ट्रासोनिक प्रोसेसरको बिचमा s० सेकेन्डको विश्रामको साथ। UP100H (१०० W, k० kHz) र अपकेंद्रित (000 डिग्री सेल्सियस मा min मिनेट को लागी १000००० × g)। घुलनशील निकाल्न 4 डिग्री सेल्सियस मा 20 मिनेट को लागी 20 μl प्रोटीन जी डायनाबेड्स संग precleared थियो। आरएनए इनपुट (१%) को इम्युनोब्लोटिting र क्वान्टेशनका लागि नमूनाहरू हटाए पछि, एचपी १ लाई 50० μl प्रोटीन-जी डाइनाबेड्सको साथ h एचको लागि इन्क्ब्युशनले 5050० μl प्रिक्लियर निकासीबाट एन्टि-एचपी १ A ए anti एन्टिबडीको साथ प्रतिरोध प्रतिरोध गरिएको थियो। इम्युनोप्रिसिपेटहरू R पटक आरसीबीको साथ धोइन्थ्यो। इम्यूनोप्रिसिपेटेड आरएनएहरू एल्युट गर्नको लागि, पेलेटेड मोतीहरू min मिनेटको लागि अल्ट्राप्योर डीईपीसी-उपचारित पानीको १०० μL मा उमालेको थियो। Μ ०० QL कियाजोल अभिकर्ता आरएनए तयारीको लागि बरामद सतहमा थपेको थपेको थियो। आरएनए प्युरीफाइडको निर्माण कम्पनीको प्रोटोकल अनुसार ओलिगो डीटी, अनियमित हेक्सामर्स र सुपरस्क्रिप्ट रिभर्स ट्रान्सक्रिप्ट्स III को प्रयोग गरेर सिडीएनए संश्लेषण गर्न टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।
(Cassale एट अल। २०१))

Chromatin प्रतिरोधक क्षमता परख को लागि अल्ट्रासोनिक Lysis

Chromatin इम्युनोप्रिसिपिटेशन मानेट द्वारा साना परिवर्तन सहित वर्णन गरिएको विधि अनुसार गरिएको थियो। ०- देखि १-दिन पुरानो वन्य-प्रकारका महिलाहरुमा लगभग २० मिलिग्रा अंडाशय को एक एमएल NEB बफर (१० mM HEPES-Na को pH .0.०, १० mM NaCl, ०.० mM EGTA-Na मा pH,, ०. m mM मा समरूप गरिएको थियो) ईडीटीए-ना पीएच 1, १ एमएम डीटीटी, ०.%% एनपी-40०, ०. m एमएम स्पेर्मिडाइन, ०.55 एमएम स्पर्मिन, १ × ईडीटीए-नि: शुल्क पूर्ण प्रोबिज इनहिबिटरहरू) एक मिनेट (000००० आरपीएममा) मिटरको साथ। होमोजेनेटलाई प्रि-चिल्ड गिलास डोनसमा हस्तान्तरण गरियो र एक कडा मूसलको साथ १ full पूर्ण स्ट्रोकहरू लागू गरियो। नि: शुल्क केन्द्रक तब rif०० डिग्री सेन्टिग्रेडमा १० मिनेटको लागि 000०००xg मा केन्द्रित गरियो। न्यूक्ली-युक्त गोलीहरू NEB को १ मिलिमिटरमा पुनः सौंकाइयो र २००००० × g मा सेन्ट्रिफु grad २० मिनेटको लागि सुक्रोज ग्रेडिएन्ट (NEB मा ०..65 mL को ०..65 mL, ०.8 M M का सुब्रोज NEB मा)। गोली NEB को १ एमएल मा र पुनःल्ड गरियो र अन्तिम १% को एकाग्रतामा formaldehyde। न्यूक्ली कोठाको तापमानमा १० मिनेट को लागि क्रस-लिंक गरिएको थियो र १/१/10 भोल्यू १.375 M एम ग्लाइसिन थपेको थियो। नाभिक cent मिनेटको लागि cent००० × g मा केन्द्रापसार द्वारा संकलन गरिएको थियो। न्यूक्लीलाई NEB को १ मिलिमिटरमा दुई पटक धोइदियो र १ मिलीलीटर लीसिस बफर (१ m एमएम HEPES-Na pH .6..6, १ 140० MM NaCl, ०. m MM EGTA, १ mM EDTA pH,, १% Triton X-100, ०.०) मा पुनः प्राप्त गरियो। एमएम डीटीटी, ०.१% ना डिओक्साइलाइट, ०.।% एसडीएस, ०.%% एन-लौरोयलर्सकोसिन र १ × EDTA मुक्त पूर्ण प्रोटीज अवरोधकर्ताहरू)। न्यूक्लीलाई हिलस्चर अल्ट्रासोनिक प्रोसेसरको प्रयोग गरेर सोनेटिकेटेड गरिएको थियो UP100H (१०० W, k० kHz) २० s को लागि छ पटक र बरफमा १ मिनेट। Sonated केन्द्रक 4 डिग्री सेल्सियस मा 4 मिनेट को लागी 13000 × g मा सेंट्रीफ्यूज थियो। Sonated chromatin को बहुमत लम्बाई मा 500 देखि 1000 बेस जोडी (bp) थियो। प्रत्येक इम्युनोप्रिसेप्टेसनका लागि, क्रोमेटिनको १μ Hg एचपी १ A ए mon मोनोक्लोनल एन्टिबडीको १० μg (h एच 4 डिग्री सेल्सियस एक rot डिग्री सेल्सियट घुमाउँदै) मा उपस्थित थियो। त्यसपछि, abe० dynl डायनाबेड्स प्रोटीन जी थपियो र इन्क्युबेशन रातोरात ° डिग्री सेल्सियस मा जारी राखियो। सतह सतह सतहलाई खारेज गरियो र नमूनाहरू दुई पटक धुईएको थियो लीसिस बफरमा (प्रत्येक धुने १ 15 मिनेट ° डिग्री सेल्सियस) र दुई पटक टीई बफरमा (१ एमएम ईडीटीए, १० मिटर TISHCl pH))। Chromatin दुई चरणमा मोतीबाट elute थियो; इलुशन बफर १ को १०० μl मा पहिलो (१० एमएम ईडीटीए, १% एसडीएस, m० एमएम ट्राश सीएल पीएच at मा) १ min मिनेटको लागि cent 65 डिग्री सेल्सियसमा, त्यसपछि केन्द्रापसारक र सतह सतह सतह को पुन: प्राप्ति। मोती सामग्री TE + ०.77% SDS को १०० inl मा पुन: निकालेको थियो। संयुक्त एल्युएट (२०० μl) -ight डिग्री सेल्सियसको राति रातमा incubated थियो क्रस-लिंकहरू रिभर्स गर्न र μ० μg / ml RNaseA द्वारा १ min मिनेटको लागि °° डिग्री सेल्सियस र μ०० μg / ml प्रोटीनेस K द्वारा h घण्टा 65 at डिग्री सेल्सियसमा। नमूनाहरू फिनोल – क्लोरोफार्म निकाले र इथेनॉल उपजीवित भएका थिए। DNA लाई २μ μl पानीमा पुनः सचेत गरियो। डीएनए इम्युनोप्रिसिपेटेडसँग आणविक विश्लेषणलाई अधिकतम बनाउनका लागि उम्मेदवार जीनहरूलाई एक अनुकूलित डुप्लेक्स-पीसीआर प्रोटोकल मार्फत जोडीमा प्रवर्धन गरिएको थियो जुन एकल प्रतिक्रियामा समान पिघलने तापक्रमको प्राइमरहरूको दुई अलग सेट प्रयोग गरेर थियो।
(क्यासेल एट अल। २०१ 2019)

जैविक नमूनाहरूको लागि उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिक सेल अवरोधकहरू

हाईल्स्चर अल्ट्रासोनिक्स तपाईंको लामो अनुभवी पार्टनर हो जब यो सेल अवरोध, लीसिस, प्रोटीन निकासी, डीएनए, आरएनए, र क्रोमेटिन बिखण्डनका साथै अन्य पूर्व विश्लेषणात्मक नमूना तयारी चरणहरूको लागि उच्च प्रदर्शन अल्ट्रासोनिकेटरहरूको कुरा आउँछ। अल्ट्रासोनिक ल्याब होमोजिनाइजरहरू र नमूना तयारी इकाईहरूको विस्तृत पोर्टफोलियो प्रस्ताव गर्दै, हिल्सचरसँग तपाईंको जैविक अनुप्रयोग र आवश्यकताहरूको लागि आदर्श अल्ट्रासोनिक उपकरण छ।
क्लासिक प्रोब-प्रकार अल्ट्रासोनिकेटर माइक्रो-टिप जस्तै UP200St (२००W; चित्र बायाँ हेर्नुहोस्) वा एक अल्ट्रासोनिक नमूना तयारी एकाइहरू VialTweeter वा UP200St_TD_CupHorn VialHolder संग अनुसन्धान र विश्लेषणात्मक प्रयोगशालामा मनपर्ने मोडेल हो। क्लासिक अल्ट्रासोनिक प्रोब आदर्श हो, जब कम नमूनाहरू तयार पार्नुपर्दछ, निकाला वा खण्डित गर्नुपर्दछ। नमूना तयारी एकाइहरू VialTweeter र UP200St_TD_CupHorn को क्रमशः १० वा v शीशहरू सम्मिलित Sonication को लागी अनुमति दिन्छ।
यदि उच्च नमूना नम्बरहरू (जस्तै---राम्रो प्लेटहरू, माइक्रोटिटर प्लेटहरू इत्यादि) प्रक्रिया गरिएको हुनुपर्दछ, यो UIP400MTP आदर्श Sonication सेटअप हो। UIP400MTP कार्य गर्दछ ठूलो कपहर्नको रूपमा, जुन पानीले भरिन्छ र माइक्रो-वेल प्लेटहरू राख्नको लागि पर्याप्त ठाउँ हुन्छ। Wat०० वाटको शक्तिशाली अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर द्वारा संचालित, UIP400MTP ले कोषहरू, लीज नमूनाहरू, विघटनको गोलीहरू, प्रोटिनहरू निकाल्न वा प्रजातिहरू निकाल्न वा प्रजातिहरू निकाल्ने क्रममा मल्टी-वेल प्लेटहरूको धेरै समान र गहन Sonication प्रदान गर्दछ।

स्मार्ट सफ्टवेयर मार्फत सटीक नियन्त्रण

सबै 200 हेलचर सोनिकेशन समाधान माथि 200 वाट माथि देखि एक डिजिटल र color टच स्क्रीन र एक बुद्धिमान सफ्टवेयर संग सुसज्जित छन्। स्मार्ट डाटा प्रोटोकोलिंग मार्फत सबै अल्ट्रासोनिक प्रक्रिया प्यारामिटरहरू स्वचालित रूपमा CSV फाईलको रूपमा बिल्ट-इन SD कार्डमा बचत हुन्छ अल्ट्रासोनिकेटर सुरु हुने बित्तिकै। यसले अनुसन्धान र प्रोटोकोलिंग यति धेरै सुविधाजनक बनाउँछ। Sonication परीक्षण वा नमूना तयारी पछि, तपाईं केवल प्रत्येक Sonication चलाउन को Sonication मापदण्डहरु को समीक्षा र तिनीहरूलाई तुलना गर्न सक्नुहुन्छ।
सहज मेनू मार्फत, असंख्य प्यारामिटर Sonication अघि पूर्वसेट गर्न सकिन्छ: उदाहरण को लागी, नमूना मा तापमान नियन्त्रण गर्न र यसको तापीय गिरावट रोक्न, नमूना तापमान को एक माथिल्लो सीमा सेट गर्न सकिन्छ। प्लगेबल तापमान सेन्सर, जो अल्ट्रासोनिक इकाईको साथ आउँदछ, वास्तविक सोनिक तापमानमा अल्ट्रासोनिक प्रोसेसर प्रतिक्रिया दिन्छ। जब माथिल्लो तापमान सीमा पुगेपछि, अल्ट्रासोनिक उपकरणले विराम गर्दछ सेट theT को कम सीमा पुगेपछि र त्यसपछि स्वचालित रूपमा फेरि सोनीकेटिंग सुरु हुन्छ।
यदि एक विशिष्ट ऊर्जा इनपुटको साथ Sonication आवश्यक छ, तपाईं Sonication चालु को अन्तिम अल्ट्रासोनिक ऊर्जा प्रिसेट गर्न सक्नुहुन्छ। अवश्य पनि, अल्ट्रासोनिक पल्सेशन र चक्र मोड व्यक्तिगत रूपमा पनि सेट गर्न सकिन्छ।
तपाईंको सबैभन्दा सफल Sonication प्यारामिटरहरू पुन: प्रयोग गर्न, तपाईं विभिन्न Sonication मोडहरू बचत गर्न सक्नुहुन्छ (जस्तै Sonication समय, गहनता, चक्र मोड आदि) प्रि-सेट मोडहरूको रूपमा, ताकि तिनीहरू सजीलो र छिटो फेरि सुरू गर्न सकून्।
अधिक परिचालन सुविधाका लागि, सबै डिजिटल अल्ट्रासोनिक एकाइहरू कुनै पनि साधारण ब्राउजरमा ब्राउजर रिमोट कन्ट्रोल मार्फत सञ्चालन गर्न सकिन्छ (उदाहरण, InternetExplorer, सफारी, क्रोम आदि)। ल्यान जडान एक साधारण प्लग-एन-प्ले सेटअप हो र कुनै थप सफ्टवेयर स्थापनाको आवश्यक पर्दैन।
हामी Hielscher मा थाहा छ कि जैविक नमूनाहरु को सफल Sonication सटीक र दोहराव्यता आवश्यक छ। तसर्थ, हामीले हाम्रा अल्ट्रासोनिकेटरहरू सबै सुविधाहरूसहितको स्मार्ट उपकरणहरूको रूपमा डिजाइन गरेका छौं जसले दक्ष, विश्वसनीय, पुन: उत्पादन योग्य र सुविधाजनक नमूना तयारी सक्षम गर्दछ।

तलको तालिकाले तपाईंलाई अल्ट्रासोनिक माइक्रो-टिप्स र क्लासिक अल्ट्रासोनिक होमोजाइनाइजरबाट बहु-नमूना अल्ट्रासोनिकेटर्समा असंख्य नमूनाहरूको सुविधाजनक, भरपर्दो तयारीको लागि हाम्रो अल्ट्रासोनिक प्रणालीहरूको अनुमानित प्रशोधन क्षमताको संकेत दिन्छ: